Basi molecolari dei farmaci biotecnologici - Introduzione

Le biotecnologie e la tecnica del DNA ricombinante

Biotecnologie: qualsiasi applicazione tecnologica che utilizza sistemi biologici, organismi viventi o loro derivati per realizzare o modificare prodotti o processi per un uso specifico.

Già nell’800 si inizia a parlare di biotecnologie: con il vaccino contro tetano e difterite, si iniziava a parlare di terapia sierica. Nel 900 si applicò la prima terapia per il diabete di tipo 1: l’insulina. La prima forma di insulina somministrata ai pazienti era di origine animale, insulina bovina o suina, che però dava una serie di problemi (immunogenicità etc). Oggi questo problema non sussiste perché si utilizza insulina umana ottenuta grazie alle biotecnologie e la tecnica del DNA ricombinante.

Quando si parla di biotecnologie, si parla di ottenimento di farmaci biologici che si classificano in 2 categorie:

• Farmaci biologici veri e propri: sono molecole naturali derivate dal metabolismo endogeno di sistemi biologici. Ad esempio, gli antibiotici come le penicilline;
• Farmaci biotecnologici: sono composti prodotti da sistemi biologici geneticamente modificati.

Quindi, la modificazione genetica di microrganismi come batteri, cellule eucariotiche, le piante e gli animali corrisponde all'acquisizione di un gene codificante una proteina di interesse che diventerà il principio attivo del farmaco biotecnologico.

Le biotecnologie farmacologiche racchiudono tutte le tecnologie necessarie per produrre biofarmaci o farmaci biologici (biologia molecolare, la biochimica, biologia cellulare, genetica, bioinformatica, microbiologia e bioingegneria).

Traduzione e trascrizione

Prima dello studio della tecnica del DNA ricombinante bisogna capire come funziona la trascrizione e la traduzione del genoma umano.

Espressione genica: è l’informazione genetica portata dal DNA, esso viene replicato, poi trascritto per avere un RNA che successivamente viene tradotto per avere una proteina.

Trascrizione

1. Nella fase d'inizio, l’RNA polimerasi riconosce la sequenza del promotore e vi si attacca. La fase è completa quando, vicino al promotore, i filamenti di DNA si separano e formano un complesso aperto lungo una dozzina di basi.
2. Durante la fase di allungamento, l’RNA polimerasi sintetizza il trascritto di mRNA. L’mRNA messaggero porta delle sequenze nucleotidiche che vengono chiamate codoni o triplette, ogni codone è costituito da tre sequenze nucleotidiche che codificano per un aa, l'unione di tutti i codoni va a determinare la proteina.
3. Il filamento di DNA trascritto è detto filamento stampo e la sequenza di basi del filamento di RNA in via di formazione è complementare a esso.

Traduzione

I ribosomi sono il luogo in cui avviene la traduzione. Sono in grado di assemblare una catena polipeptidica trattenendo nella giusta posizione l’mRNA e i tRNA carichi di amminoacidi. I ribosomi sono formati da due subunità: una maggiore e una minore.

Come fa l’organismo a capire quando iniziare e quando finire la traduzione dell’RNA messaggero per dare la proteina? Tramite dei segnali. Il segnale d’avvio è il codone d’inizio: AUG dà l'avvio alla traduzione. Il segnale di stop, ovvero il codone di stop, può essere UAA, UAG, UGA e si termina la traduzione.

Tecnologia del DNA ricombinante

È l'insieme delle tecniche di biologia molecolare che consentono di isolare e tagliare brevi sequenze di DNA per trasferirle nel genoma di altre cellule.

Questa tecnologia consente interventi mirati, consente il trasferimento di DNA anche da una specie ad un’altra (per esempio si possono trasferire geni da un batterio ad una pianta o introdurre in un batterio un gene da una cellula eucariota).

Quali sono gli scopi?

• Miglioramento genetico dell'individuo ricevente (in agraria per avere una maggiore resistenza agli attacchi da parassiti);
• Utilizzare l'organismo ricevente per clonare il gene introdotto;
• Servirsi della cellula ospite come una ‘fabbrica’ per la produzione di molecole utili cell factories: ad esempio, prendendo il gene che codifica per l'insulina, inserendolo all'interno di un vettore plasmidico, lo si replicherà tantissimo in maniera tale che quel frammento di DNA umano produrrà tanta insulina che verrà utilizzata per la somministrazione al paziente.

Come si è arrivati a questa tecnica?

1. La profonda conoscenza della genetica dei batteri;
2. L'identificazione di endonucleasi di restrizione e delle ligasi.

Gli enzimi di restrizione: sono delle proteine sintetizzate dai batteri per proteggersi dalle infezioni virali (batteriofagi). Sono enzimi batterici capaci di riconoscere sequenze specifiche di DNA e operare la scissione del legame fosfodiestero all’interno di tali sequenze. Consentono di tagliare parti di DNA interessanti.

Ligasi: è un enzima che catalizza la formazione del legame tra due molecole in modo da formare una nuova molecola a partire dalle prime due, si riuscì a combinare tra loro molecole di DNA anche di origine molto diversa. Consente di legare il vettore e i frammenti di DNA interessati.

La conoscenza della genetica dei batteri ha consentito di integrare i frammenti di DNA di interesse all’interno di DNA circolari (plasmidi), capaci di replicazione autonoma. Tali ibridi, introdotti in ceppi batterici e coltivati in laboratorio, potevano essere amplificati all’infinito.

Il vettore e i frammenti di DNA vengono ‘ritagliati’ tramite l’enzima di restrizione e poi uniti insieme dalla ligasi. Successivamente, vengono inseriti in un sistema che ne consente la replicazione in maniera tale che questa porzione venga amplificata tantissimo perché il senso è tradurre per avere la proteina e poi utilizzarla.

Nella tecnologia del DNA ricombinante è possibile individuare diversi step:

1. Selezione del target;
2. Identificazione del gene di interesse;
3. Isolamento e amplificazione del DNA;
4. Selezione dell'host di espressione (cioè, dove voglio che questa proteina venga prodotta);
5. Inserimento in un vettore di espressione (il plasmide è un vettore di espressione);
6. Clonazione;
7. Trasfezione nell’host di espressione e produzione della proteina.

1. Selezione del target

Reverse pharmacology (target-based drug discovery, TDD): si parte dall’ipotesi che la modulazione dell’attività di una specifica proteina target possa avere effetti benefici sulla malattia.

Esempio: nel malato di diabete c'è una carenza di insulinail target è l'insulinabisogna fare in modo che questa proteina venga modificata, oppure isolata, migliorando la sua farmacocinetica per migliorare poi il benessere del paziente.

Il target può essere:

• Una molecola che è stata prodotta in eccesso;
• Una molecola che è downregolata (es. insulina);
• Una molecola che ha una struttura anomala.

2. Identificazione del gene di interesse

L’identificazione del gene di interesse è possibile grazie al progetto ‘genoma umano’ completato nel 2003 in cui è stato sequenziato il genoma umano.

Per questo step vengono utilizzati 2 database: EMBL (europeo) e NCBI (americano). È necessario inserire il nome del gene e si troverà la sequenza, la caratteristica della proteina e tutte le possibili info che consentono di creare un identikit del gene.

3. Isolamento e amplificazione del DNA

Una volta identificata la sequenza nucleotidica del DNA di interesse (il gene di interesse) è necessario che questo sia isolato ed amplificato per essere inserito nel vettore di espressione.

In questo campo la necessità è quella di lavorare sulle cellule eucariote, dell’uomo, e quando si lavora sulle cellule eucariote, in genere, la sequenza di partenza è l’mRNA.

Perché si parte dall’mRNA?

Perché negli eucarioti l’mRNA può essere molto più piccolo del gene a causa della presenza di introni (delle sequenze che in realtà non codificano nulla, sequenze non necessarie per avere la proteina) nel gene.

Dopo la trascrizione a partire dal DNA ad opera della RNA polimerasi II, il trascritto primario va incontro allo splicing per produrre l’mRNA.

Intronisequenze non codificanti dei geni

Esonisequenze codificanti dei geni.

Splicingè il meccanismo di eliminazione degli introni dal trascritto primario, per ottenere mRNA maturo.

Come si fa ad ottenere la copia del gene di interesse?

1. Isolare l’mRNA dalle cellule che esprimono quel determinato gene;
2. Retrotrascrivere: con un enzima isolato dai retrovirus che è trascrittasi inversa, in grado di produrre una copia del DNA a partire dall’mRNA isolato. Le copie di DNA ottenute dall’mRNA sono chiamate cDNA (DNA complementare).
3. Amplificare il cDNA tramite PCR (reazione a catena della polimerasi): con questa tecnica dapprima si trasforma il DNA da doppio filamento a singolo filamento e poi con dei primers (inneschi) specifici si effettua la sintesi e quindi la copia del filamento da parte della DNA-polimerasi.

In tal modo dopo diversi cicli di reazione si ottengono molti frammenti di DNA dalle sequenze innesco prescelte.

4. Selezione dell’host di es