Appunti teoria di Chimica analitica III

TECNICHE STRUMENTALI OTTICHE

Le tecniche strumentali ottiche si basano sull’interazione della radiazione

elettromagnetica con la materia (nel nostro caso l’analita). Sono tecniche che ci

permettono di determinare la concentrazione dell’analitica in funzione di grandezza

ottiche (assorbanza, trasmittanza, fluorescenza, lunghezza d’onda ecc.),

Le principali tecniche ottiche sono 3:

1) NMR (Risonanza Magnetica Nucleare): ci dà informazioni dettagliate sulla

struttura della molecola.

2) IR (Infrarosso): tecnica utile per identificare i tipi di legame.

3) UV-Vis (Ultravioletto-Visibile): tecnica sia molecolare che atomica, si sfruttano

le capacità delle molecole di interagire con la radiazione elettromagnetica

per avere informazioni quantitative (come il valore di quantità assorbita o

= ⋅ ⋅

emessa) che vengono ricavate dalla legge di Lambert-Beer ( ) oppure

informazioni qualitative (come la posizione del picco che corrisponde alla

lunghezza d’onda massima o lo spettro)

La relazione tra una grandezza ottica, generalmente l’assorbanza per la

spettrofotometria UV-Vis, deve avere una relazione lineare con la concentrazione

dell’analita (Legge di Lambert-Beer). Per rappresentare tale relazione si usa la RETTA DI

TARATURA:

Sull’asse delle ascisse abbiamo la concentrazione dell’analitica e lungo l’asse delle

ordinate l’assorbanza. Per costruirla abbiamo bisogno della preparazione di soluzioni

standard, ossia soluzioni a concentrazione NOTA che siano il più simili possibili alla

soluzione del nostro campione, e poi misurare l’assorbanza per ogni soluzione

standard in poi da fare un grafico Abs vs [C] e ricavare la concentrazione desiderata.

Non si può dire nulla su ciò che c’è prima o dopo la retta poichè il mio dato analitico

vale SOLO nel range della retta.

Posso sapere cosa c’è dopo?

La risposta è sì. Posso semplicemente diluire il mio campione o fare altre soluzioni

standard in modo da allargare l’intervallo della retta.

Il valore al di sotto della retta NON è RILEVABILE, si chiama LOD il punto di” minima

=

quantità rilevabile” che ci dà un segnale diverso da quello generato dal bianco.

()

3 , = =

Esiste anche il LOQ detto “limit of quantification” (minima quantità quantificabile):

= 10 .

Anche la sensibilità ha un ruolo importante, si ricorda il suo significato: “capacità di

discriminare fra piccole differenze di concentrazione” ed è anche il coefficiente

angolare della retta di taratura. Ci permette di capire quale metodo sia più sensibile.

La retta di taratura rossa rappresenta un metodo più sensibile poiché ha un

coefficiente maggiore della retta nera e a parità di concentrazione c’è un segnale

maggiore. PREPARAZIONE STANDARD

Le soluzioni standard sono molto importanti poiché costituiscono la base della retta di

taratura, motivo per cui devono essere preparate nel modo più simile possibile alla

soluzione del nostro analita dalla concentrazione incognita. I fattori che possono

influenzare il segnale sono: temperatura, pH, forza ionica e presenza di altre specie in

soluzioni.

Il primo step per la preparazione è capire la massa necessaria per ottenere una

soluzione a concentrazione nota poiché sarà la nostra soluzione madre. Dobbiamo

quindi prima decidere la concentrazione che vogliamo ottenere in modo da calcolare la

massa da pesare con la bilancia analitica e secondariamente il volume finale a cui

vogliamo arrivare. Ad esempio, scegliamo una concentrazione di 0.1 M e un volume di

[]

= ( ) ⋅ ())

10 ml. Per cui calcoliamo le moli (() e poi ricaviamo la massa

()

usando il prodotto tra il numero di moli e il peso molecolare dell’analita scelto. Si usa

un matraccio in cui si inserisce la polvere (se si tratta di un sale) e si porta a volume.

Questa sarà la soluzione madre da cui si prepareranno tutti gli standard a diverse

concentrazioni. −3

10 , 2 ⋅

Per preparare diverse soluzioni standard a diverse concentrazioni (.

−3 −3

10 , 4 ⋅ 10 .) =

uso il metodo della diluzione con la formula . In

1 1 2 2

base ai volumi a cui lavoriamo usiamo micro-pipette o pipette tarate.

Infine, dopo la preparazione di tutti gli standard a diverse concentrazioni, si passa al

travaso nelle provette specifiche che andranno inserite nello spettrofotometro così da

costruire la retta di taratura.

SPETTROFOTOMETRIA UV-VIS

Questa tecnica strumentale si basa sull’assorbimento della radiazione

elettromagnetica da parte delle molecole. Con assorbimento si intende la luce che

viene assorbita da atomo, ione o molecola portandoli a uno stato più alto di energia

(detto anche stato eccitato).

La radiazione elettromagnetica è un’onda che trasporta con sé energia attraverso lo

spazio sotto forma di campi elettrici e magnetici oscillanti perpendicolari tra loro e

perpendicolari alla direzione di propagazione dell’onda. Essendo un’onda, è

caratterizzata da parametri fisici precisi:

- Lunghezza d’onda ( ) distanza tra due massimi consecutivi di uno dei due

campi

- Frequenza ( ): numero di oscillazioni al secondo

- Energia: direttamente proporzionale alla frequenza e inversamente

proporzionale alla lunghezza d’onda. = , =

Sono due grandezze legate tra loro tramite la relazione:

à

All’aumentare della lunghezza d’onda, la frequenza e l’energia associata al fotone

ℎ

= ℎ =

diminuiscono. L’energia del fotone invece: , con h costante di

Planck. Lavorando nella regione Uv-Vis dello spettro elettromagnetico si lavorerà a un

range di lunghezza d’onda tra 380-400 nm fino a 750-800 nm (provoca transizioni

elettroniche degli elettroni di valenza, mentre l’IR transizioni vibrazionali e le microonde

transizioni rotazionali).

Il processo di assorbimento di avviene solo quando l’energia della radiazione

corrisponde a quella necessaria a far avvenire la transizione dallo stato fondamentale

allo stato eccitato. Le transizioni possibili sono 3: elettroniche, vibrazionali e

rotazionali. Gli ultimi due sono associati solo alle molecole mentre le transizioni

elettroniche si rifanno agli atomi. Le transizioni elettroniche hanno quindi bisogno di

un'energia specifica e dipende sia dal tipo di legame che dalla struttura elettronica

della molecola, in ogni caso sono sempre quantizzate poiché gli elettroni possono

occupare solo certi livelli energetici. Se parliamo della molecola, con la transizione

elettronica intendiamo la ridistribuzione degli elettroni negli orbitali molecolari,

∗ ∗

→ →

generalmente da o da . Mentre per gli atomi abbiamo la ridistribuzione

degli elettroni negli orbitali atomici. Mentre gli atomi presentano degli spettri “a righe”,

le molecole mostrano spettri a “bande” più complesse poiché i livelli elettronici sono

suddividi in sottolivelli vibrazionali e rotazionali.

Lo spettro di assorbimento atomico (AAS) ha un ruolo importante poiché è costituito da

linee discrete, non molto ampie come nelle molecole, dove ogni linea è specifica e

dipende dalla differenza di energia tra stato fondamentale e stato eccitato dell’atomo.

Ad esempio, l’atomo di idrogeno ha uno spettro a righe complesso dovuto alle

transizioni elettroniche all’interno dei sottolivelli s,p,d,f.

Ogni molecola ha un livello di energia elettronica suddiviso in un numero di sottolivelli

vibrazionali, a loro volta suddivisi in sottolivelli rotazionali. Le transizioni vibrazionali

modificano la lunghezza del legame e la separazione media dei due nuclei (tecnica IR)

mentre le transizioni rotazionali causano modifiche energetiche quando essa ruota

rispetto al suo centro di gravità (microonde).

Mentre, l’interazione con una molecola e l’assorbimento coinvolgono sia livelli

elettronici che sottolivelli vibrazionali e rotazionali. Questo ci permette di osservare

uno spetrro “a bande” senza però riuscire a distinguere le diverse transizioni.

ANALISI QUALITATIVA

Questo tipo di analisi si basa sull’identificazione di un composto sulla base dello

spettro di assorbimento, mediante un confronto con lo spettro di un materiale noto o

standard di riferimento. La lettura dello spettro si basa sulla lunghezza d’onda

massima, la forma dello spettro e l’intensità dei picchi che ci permettono di dedurre la

struttura elettronica. Ogni sostanza ha un profilo di assorbimento caratteristico e il

riconoscimento avviene confrontando lo spettro ottenuto con quello di riferimento.

ANALISI QUANTITATIVA

Questo tipo di analisi, invece, si basa sulla determinazione della concentrazione

incognita dell’analita (nello spettro UV-Vis) utilizzando la legge di Lambert-Beer:

“la quantità di luce assorbita da una soluzione è funzione della concentrazione della

sostanza assorbente e della lunghezza del cammino ottico”.

Si basa sul fatto che l’intensità dell’assorbimento dipende direttamente dalla quantità

di sostanza presente nella soluzione attraversata dalla luce.

Per arrivare a definirla consideriamo un fascio di radiazione di intensità P che attraversa

il materiale (di spessore N, quindi è il cammino ottico e di costante di assorbimento K).

La legge differenziale dell’assorbimento dice:

− =

, la diminuzione dell’intensità è proporzionale all’intensità stessa, come se fosse un

decadimento esponenziale. Si possono separare le variabili e integrare:

La differenza tra ASSORBANZA e TRASMITTANZA:

- L’assorbanza corrisponde alla densità ottica ed è il termine usato nella legge di

Lambert-Beer.

- La trasmittanza è la frazione di radiazione trasmessa, è il valore che viene

misurato dallo strumento.

La legge è composta tra 3 termini: il primo è l’assorbività molare, una costante

caratteristica delle sostanze ed è espressa in M^-1 cm^-1, il secondo termine è il

cammino ottico (spessore cuvetta) e infine la concentrazione della sostanza di esame.

Per misurare l’assorbanza, che è direttamente proporzionale alla concentrazione, si

cerca di eseguire le misure al valore della lunghezza d’onda massima (ossia

corrispondente al valore massimo di assorbanza) questo perché:

1- Si riduce il possibile errore associato alla misura

2- Il punto massimo ha maggiore sensibilità e quindi un più basso limite di

rivelazione

Inoltre, l’assorbanza viene misurata sempre in un intervallo specifico in cui è presente

linearità. Sebbene sia presente una linearità nella legge di Lambert-Beer, si possono

avere delle deviazioni della legge che non ci permettono di visualizzare più la linearità.

La limitazione che presenta la legge è che può essere usata solo per radiazioni

monocromatiche e soluzioni diluite.

Generalmente, possiamo incontrare due errori chiave:

1- ERRORE OTTICO (selezione lunghezza d’onda, radiazione indesiderata o

ampiezza fenditura)

2- ERRORE CHIMICO (pH, concentrazioni elevate di soluto, miscele con presenza

di più specie)

I problemi più comuni sono:

1- DEVIAZIONE STRUMENTO, CASO DELLA LUCE POLICROMATICA (deviazione

ottica)

L’assorbanza è una grandezza

additiva, che misuriamo nella

sua completezza a tutte le

lunghezze d’onda. Se abbiamo

due specie che assorbono la

stessa lunghezza d’onda allora

l’assorbanza finale sarà la

somma delle due. Nel grafico a

sinistra si nota che le due assorbanze sono diverse e a destra si mostra la deviazione

della banda B rispetto alla A (non c’è linearità). Perché?

Questa deviazione è dovuta al fatto che la radiazione elettromagnetica è composta da

tante lunghezze d’onda, una “banda”. Questo perché alcune lunghezze d’onda

tendono ad essere assorbite più di altre e fa sì che l’assorbanza sia meno lineare di

quella prevista e che si abbia una curva che si piega verso il basso.

Poiché gli strumenti reali hanno una "banda passante" finita, viene inviato un intervallo

di lunghezze d'onda attraverso il campione. Se il coefficiente di assorbimento molare

varia sensibilmente in quell'intervallo (come accade sui lati di un picco di

assorbimento), si verifica una deviazione dalla linearità.

2- CASO SPECIE, INDICATORE ACIDO-BASE (deviazioni chimiche)

Si parla del caso della fenolftaleina e la dipendenza dal pH. È un indicatore acido-base

che in soluzione acquosa può avere 2 colori e due forme: in ambiente basico (pH>10)

ha un colore rosa, mentre in ambiente acido (pH<8,2) è incolore. Tra 8,2 e 10, invece, le

due forme sono in equilibrio. Quello che cambia tra le due forme è anche l’assorbanza

in funzione della lunghezza d’onda. Per evitare la formazione di queste due forme, si

sua una soluzione tampone per fissare il pH in una regione specifica dove òa specie è

stabile (o basico o acido), in modo da misurare la lunghezza in cui solo la specie

predominante assorbe. Quindi, se l’analita è un indicatore acido-base allora ci sarà

uno spostamento dell’equilibrio acido-base che cambia in fase alla forma chimica

presente e quindi lo spettro di assorbimento.

3- DEVIAZIONE LUCE DIFFUSA (deviazione ottica)

La luce diffusa è costituita da radiazioni con lunghezze d’onda diverse da quella

selezionata che raggiungono il rilevatore a causa di riflessioni interne o imperfezioni del

monocromatore. Questo causa deviazioni negative: l’assorbanza misurata risulta

inferiore a quella reale poiché la luce extra fa apparire più alta la trasmittanza.

In questo esempio di grafico, si rappresentano quattro rette di taratura. Quella a 586 e

482 nm sono quella più lineari ma quella a 482 nm è più sensibile poiché più stretta e

ha una maggiore assorbanza coprendo anche un minor intervallo di lunghezze d’onda.

Nel complesso questa legge è una legge limite, ovvero funziona bene solo per soluzioni

diluite (<0,01M). Quando la soluzione è concentrata, le molecole sono così vicine che

le loro nubi elettroniche si influenzano a vicenda. Questa cosa altera le capacità della

molecola di assorbire fotoni. La legge, inoltre, vorrebbe una luce con UNA sola

lunghezza d’onda, ma è impossibile poiché lo strumento invia una banda di lunghezze

d’onda. Se il valore di epsilon varia in questa banda, allora la curva di taratura non sarà

una retta. Se la cuvetta è sporca o la soluzione torbida, la luce viene riflessa o deviata e

lo strumento pensa di averla assorbita in realtà l’ha deviata positivamente (assorbanza

più alta di quella reale).

SPETTROFOTOMETRIA, COMPONENTI E USO

Lo spettrofotometro è lo strumento che permette di misurare il rapporto tra intensità di

luce che attraversa il campione e quella che incide su di esso. Lo strumento ha un suo

schema a blocchi (lineare) composto da:

• Sorgente di luce

• Cella per il campione

• Selettore di lunghezza d’onda

• Rilevatore

SCHEMA A BLOCCHI

- La sorgente ha il ruolo di emettere un fascio di radiazioni (luce) in maniera

continua e stabile e in un ampio intervallo di lunghezze d’onda (nel caso dell’UV-

Vis tra 380 e 750 nm) e avere un'intensità di emissione il più possibile uniforme.

Una sorgente per il visibile può essere una lampada a tugsteno o tugsteno-

alogeno il cui intervallo di lunghezze d’onda va da 350 a 2200 nm. Mentre per

l’UV quella più comune è la lampada a deuterio, tra 160 e 380 nm (funziona bene

tramite scarica elettrica).

- Il selettore di lunghezza d’onda ha il ruolo di isolare UNA SINGOLA LUNGHEZZA

D’ONDA (luce monocromatica) dal fascio policromatico della sorgente. È

composto da fenditura d’ingresso, che riceve la luce dalla sorgente, l’elemento

disperdente (il più usato è il filtro) poiché più semplice, e permette di

trasmettere un intervallo il più stretto possibile di lunghezze d’onda e può essere

di due tipo: ad assorbimento o interferenziali. Quello di assorbimento è fatto di

un materiale che assorbe selettivamente solo alcune lunghezze d’onda oppure

interferenziale per far passare la luce attraverso la superficie e dopo viene

riflessa all’indietro. Lo scopo è realizzare un'interferenza con la luce incidente.

In ogni caso, sono anche economici e ci permettono di ottenere singole bande

strette, se vogliamo eseguire misure a diverse lunghezze d'onda abbiamo

bisogno di più filtri. Alternativa ai filtri, sono i monocromatori in cui è possibile

selezionale qualsiasi lunghezza all’intervallo di utilizzazione del

monocromatore. Quelli più usati sono prismi e reticoli. I prismi si basano sul

fatto che l’indice di rifrazione di un materiale è in relazione alla lunghezza d’onda

quindi lunghezze d’onda divere avranno angoli di rifrazione diversi. Vantaggi dei

prismi: permettono di selezionare un ampio ambito di lunghezze d’onda e sono

relativamente economici. Svantaggi: bassa dispersione a lunghezze d’onda

elevate e la luce deve passare attraverso il materiale del prisma e ciò limita

l’int