Appunti esame Patologia molecolare e immunopatologia (PMI)

Patologia molecolare e immunopatologia

La risposta immunitaria fornisce al corpo umano un importante sistema di difesa contro gli agenti infettivi. Normalmente le risposte immunitarie eliminano l’agente infettante senza causare gravi lesioni ai tessuti dell’ospite. In alcuni casi però le reazioni immunitarie possono causare danno tissutale e malattia.

Malattie da ipersensibilità

Le manifestazioni morbose causate dalle risposte immunitarie sono definite malattie da ipersensibilità. Queste sono state classificate da Gell e Coombs in 4 tipi in base ai meccanismi immunitari che le determinano: tipo I, tipo II, tipo III e tipo IV. Rispetto al periodo in cui Gell e Coombs hanno classificato le reazioni di ipersensibilità, le conoscenze sul sistema immunitario e sul suo funzionamento sono notevolmente aumentate.

Le risposte patologiche del sistema immunitario causano diversi tipi di danno tissutale. I diversi meccanismi immunitari causano disturbi con caratteristiche clinico-patologiche diverse. Nella realtà clinica le malattie a base immunitaria si manifestano in modo complesso a causa dei molteplici meccanismi effettori che possono agire contemporaneamente.

Ipersensibilità di tipo I: Allergie

La reazione di ipersensibilità di tipo I è comunemente nota come allergia. Le reazioni allergiche si sviluppano in individui che producono anticorpi di tipo IgE contro antigeni normalmente innocui presenti nell’ambiente definiti allergeni. Gli allergeni sono generalmente proteine solubili presenti in sostanze quali pollini, alimenti, insetti.

La maggior parte degli individui che incontra questi antigeni produce anticorpi di classe IgG1 o IgG4 che rimuovono l’antigene senza provocare sintomi. Gli individui atopici che producono IgE sviluppano una reazione allergica con effetti variabili che vanno dall’orticaria, alle difficoltà respiratorie e in alcuni casi morte.

Origine e manifestazioni degli allergeni

Molti degli allergeni sono proteasi che si pensa possano ridurre le funzioni della barriera epiteliale favorendo lo sviluppo di allergie. Gli allergeni possono avere varie origini:

• Origine vegetale (polline)
• Origine animale (veleni di insetti)
• Origine alimentare (crostacei, frutta)
• Origine farmacologica (penicillina)

Le allergie hanno diverse manifestazioni: dalle forme meno gravi come il ponfo e la rinite alle forme più gravi come l’asma bronchiale allergico e l’anafilassi, una reazione allergica sistemica. Il sito dove si verifica il contatto con l’allergene determina quali organi e tessuti vengono coinvolti. Gli antigeni inalati causano rinite e asma. Gli antigeni ingeriti causano vomito e diarrea. Gli antigeni iniettati hanno un effetto sistemico.

Negli ultimi anni le malattie allergiche sono aumentate fino a diventare le maggiori cause di malattia cronica dei bambini nei paesi sviluppati. Si stima che 300 milioni di persone nel mondo siano affette da asma. La prevalenza di asma nei bambini è raddoppiata fra il 1980 e il 1990. L’aumento delle malattie allergiche in un breve periodo di tempo implica che i fattori ambientali sono determinanti nello sviluppo della malattia. La propensione a sviluppare allergie dipende anche da fattori genici.

Meccanismo di azione nell'ipersensibilità di tipo I

Nelle reazioni di ipersensibilità di tipo I, il legame fra l’allergene e le IgE legate sulla superficie dei mastociti determina l’attivazione dei mastociti. I mastociti attivati rilasciano i mediatori responsabili dell’aumento della permeabilità vasale, della vasodilatazione e della contrazione della muscolatura liscia bronchiale e viscerale e dell’infiammazione locale.

I mastociti sono cellule ampiamente presenti nell’organismo e si localizzano nel tessuto connettivo e nelle mucose in prossimità dei vasi sanguigni e dei vasi linfatici. I mastociti sono numerosi nella pelle, nel tratto respiratorio e nel tratto gastrointestinale. Sono caratterizzati dalla presenza di granuli citoplasmatici contenenti istamina, proteasi e citochine.

Funzione dei mastociti

I mastociti sono cellule di origine midollare, la loro maturazione è influenzata dal fattore delle cellule staminali (stem cell factor, SCF) e da altre citochine. Completano la maturazione a livello del tessuto. Nel roditore sono state identificate 2 popolazioni di mastociti: del tessuto connettivo e delle mucose. Nell’uomo sono state identificate 2 popolazioni definite MC(T) e MC(TC) che differiscono per il tipo di proteasi presenti nei granuli.

I mastociti risiedono nei tessuti e hanno una vita lunga dell’ordine di mesi e anni. Insieme ai basofili esprimono in modo costituivo il recettore per la porzione costante delle IgE. Le reazioni di ipersensibilità di tipo I avvengono in seguito alla sensibilizzazione dell’individuo ad un determinato allergene. La fase effettrice in cui si osserva il processo infiammatorio è innescata se si ha una seconda esposizione all’allergene.

Fase di sensibilizzazione

Descriviamo la fase di sensibilizzazione. Nel caso di allergeni inalati, le cellule dendritiche presenti nell’epitelio e nella mucosa sottostante catturano l’allergene, lo processano e lo presentano ai linfociti T naïve nei linfonodi o nella mucosa. La presentazione dell’allergene da parte delle cellule dendritiche induce il differenziamento dei linfociti T naïve in linfociti T helper 2.

I linfociti T helper 2 sono caratterizzati dalla secrezione delle citochine: IL-4, IL-5, IL-9, IL-13. I linfociti T helper 2 allergene specifici inducono i linfociti B a produrre IgE specifiche per l’allergene. Il processo attraverso il quale i linfociti B possono produrre anticorpi di stessa specificità ma di diverso isotipo prende il nome di commutazione di classe. La commutazione di classe in risposta ad antigeni proteici richiede la cooperazione dei linfociti T helper.

Infatti, i linfociti T helper 2, mediante la produzione di IL-4, inducono i linfociti B a produrre IgE. Anche i linfociti B naïve, a livello del linfonodo, dovranno riconoscere l’antigene solubile (non quello presentato dalle cellule dendritiche). L’antigene lega le immunoglobuline IgM e IgD espresse sulla membrana del linfocita B naïve.

Attivazione delle cellule B

L’attivazione delle cellule B porta alla proliferazione e al differenziamento di plasmacellule e alla produzione di cellule della memoria. Inoltre, alcune cellule B produrranno Ig di isotipo diverso dalle IgM e dalle IgD. Questo processo prende il nome di switch isotipico o commutazione di classe.

La produzione di anticorpi con stessa specificità per l’antigene e diversa regione costante (isotipo) avviene attraverso la sostituzione di un cluster costante con un altro cluster. Questo processo è mediato dall’enzima activation induced deaminasi e richiede la presenza di specifiche citochine (IL-4) e l’interazione fra CD40 e CD40L (L sta per ligando) espressi rispettivamente dai linfociti B e T.

Interazione T-B e formazione del centro germinativo

Questi sono i 2 segnali affinché possa avvenire lo switch isotipico. A livello del linfonodo abbiamo 2 aree: l’area B e l’area T. I linfociti B naïve, grazie alle IgM e alle IgD, legano un determinato antigene, escono dal follicolo e si dirigono verso l’area di confine. I linfociti T devono essere attivati dalle cellule dendritiche che presentano lo stesso antigene.

Nell’area di confine, il linfocita B processa e presenta l’antigene in associazione con le molecole MHC di classe II. Il linfocita B sostituisce quindi la cellula dendritica. A questo punto una parte delle cellule B dà vita a foci di cellule B extrafollicolari. Un’altra parte delle cellule B rientra nel follicolo e inizia a proliferare formando il centro germinativo.

Nel centro germinativo hanno luogo: la maturazione dell’affinità, la generazione delle cellule della memoria e la commutazione di classe. Quindi, siamo a livello del linfonodo, abbiamo questa collaborazione T-B cioè il linfocita B presenta l’antigene al linfocita T.

Ipermutazione somatica e commutazione di classe

Fino ad oggi abbiamo parlato dei linfociti T helper 2 come linfociti che mediano lo switch isotipico dei linfociti B verso plasmacellule. Dove avviene lo switch isotipico? Questo avviene nell’area extrafollicolare. Quindi, una parte di questi linfociti B che hanno ricevuto la segnalazione da parte dei linfociti T diventano plasmacellule cioè cellule secernenti gli anticorpi.

Queste immunoglobuline che vengono prodotte rappresentano la prima risposta anticorpale prima che avvenga la formazione del centro germinativo. La vera risposta, cioè quella che aumenta l’affinità dell’immunoglobulina, avviene nel centro germinativo. Il centro germinativo è costituito da linfociti B che dopo essere stati in contatto con la cellula T nella zona di boundary rientrano dentro il follicolo.

Di fatto sembra che rientrino prima i linfociti T follicolari e poi i linfociti B, l’importante è che rientrino nel follicolo. Quindi, quando parliamo di cento germinativo stiamo parlando di linfociti B proliferanti. Un altro concetto importante è il seguente. Il processo proprio unico del centro germinativo è l’ipermutazione somatica che consiste in mutazioni casuali a livello della regione variabile dell’anticorpo che servono per aumentare l’affinità dell’anticorpo per l’antigene.

Quindi, una parte di questi linfociti B che sono proliferanti andrà incontro a ipermutazione somatica. Una parte di questi linfociti B andranno anche incontro a switch isotipico quindi a commutazione di classe. Quindi, anche a livello del centro germinativo avviene la commutazione di classe.

Generazione di cellule della memoria

Nel centro germinativo originano anche le cellule della memoria. Che cosa può diventare una cellula B una volta che è stata attivata? Abbiamo visto che può diventare plasmacellula e quindi cellula secernente anticorpi, può diventare cellula della memoria. Quindi, siamo nel centro germinativo.

Le foci extrafollicolari danno vita a plasmablasti a vita breve. Quindi, nel centro germinativo abbiamo ipermutazione somatica e commutazione di classe, poi abbiamo generazione di cellule della memoria e poi anche generazione di plasmablasti. Quindi, l’esisto di una risposta primaria ad un antigene T-dipendente genererà plasmacellule a lunga vita, cellule della memoria, cellule con aumentata affinità e cellule commutate.

Quindi, alla fine della risposta anticorpale primaria si producono anticorpi switchati. Fino ad ora abbiamo detto quanto è fondamentale questo aiuto da parte delle cellule T. Questo aiuto da parte delle cellule T consiste nell’interazione fondamentale fra il CD40 e il CD40L perché l’enzima responsabile della commutazione di classe e dell’ipermutazione somatica viene indotto principalmente dall’interazione CD40-CD40L.

Switch isotipico e citochine

Poi lo switch isotipico viene indirizzato a seconda del tipo di citochina. L’importante è sapere che deve avvenire una ricombinazione tra delle sequenze di switch. Le sequenze di switch si trovano a monte delle regioni costanti. Le cellule Th2 sono responsabili dello switch isotipico dei linfociti B verso la produzione di anticorpi IgE.

Questa immagine è stata presa da un lavoro che già presupponeva l’esistenza di linfociti T helper follicolari, quindi, una sottopopolazione specifica di linfociti T helper la quale ha proprio la funzione di aiutare, di collaborare con i linfociti B per la produzione di anticorpi. Quindi, è un subset di linfociti T che ha proprio la funzione di favorire la risposta anticorpale, di aiutare i linfociti B.

Ruolo delle cellule T helper

Le prime sottopopolazioni di cellule T helper che sono state identificate sono le cellule Th1 e Th2. I linfociti Th1 producono IFN-γ e quindi attuano una risposta contro batteri intracellulari e contro virus. Invece, i linfociti Th2 sembravano favorire la risposta anticorpale proprio grazie alla capacità di produrre IL-4.

Infatti, l’IL-4 promuove la commutazione di classe verso le IgE ciò ha indotto a considerare i linfociti Th2 allergene specifici fondamentali nel favorire lo switch isotipico verso le IgE nella risposta agli allergeni. Più in generale i linfociti Th2 sono stati considerati i linfociti responsabili della cooperazione con i B nella risposta anticorpale.

Quindi, nell’immagine sopra possiamo vedere che in risposta a un allergene a livello del linfonodo vengono generate delle cellule T helper follicolari allergene specifiche. Quando parliamo di cellule T helper follicolari parliamo di una popolazione che è stata identificata la prima volta nel 2000. Questa popolazione è stata accettata con molta difficoltà.

Però oggi, dopo 20 anni, è chiaro che esistono queste cellule T che sono delle cellule caratterizzate dall’espressione del CXCR5, del PD-1 (molecola di checkpoint soppressoria della risposta) e del repressore trascrizionale BCL6. Da un punto di vista funzionale queste cellule sono fondamentali nel sostenere il centro germinativo e tutto ciò che avviene all’interno del centro germinativo (ipermutazione somatica, commutazione di classe ma anche risposta della memoria).

Importanza delle cellule T follicolari

Se analizziamo la risposta anticorpale in topi knockout per BCL6 allora non abbiamo produzione di IgE allergene specifiche. Quindi, questo significa che effettivamente queste cellule sono importanti nella risposta anticorpale verso gli allergeni. Quindi, nella fase di sensibilizzazione si generano cellule Th follicolari specifiche per l’allergene che sono responsabili della risposta anticorpale IgE e poi si genereranno anche i linfociti Th2.

I linfociti Th2 rappresentano la popolazione che compone la risposta infiammatoria di tipo 2. In questo caso l’infiltrato è caratterizzato da linfociti Th2, da eosinofili e da pochi neutrofili. Però la caratteristica della risposta infiammatoria di tipo 2 è proprio la presenza di questi linfociti T helper 2 e di questi eosinofili.

Invece, nell’infiammazione più classica che abbiamo per esempio in risposta a batteri, abbiamo un infiltrato che è ricco di neutrofili. Quindi, nella risposta infiammatoria di tipo 2 abbiamo linfociti T helper 2 ed eosinofili che sono poi quelli che poi mediano il danno tissutale in quelle reazioni allergiche in cui il processo infiammatorio, come nell’asma allergico, diventa cronico.

Diversi tipi di reazioni allergiche

Ci sono diversi tipi di reazioni allergiche. Nell’anafilassi la componente infiammatoria è scarsissima in quanto si verifica una reazione immediata rappresentata dalle IgE. Invece, nelle forme di asma allergico abbiamo eczema, un bel infiltrato linfocitario, quindi, la parte infiammatoria è molto importante.

Quindi, nel modello dell’induzione delle IgE durante l’esposizione all’allergene, durante la fase di sensibilizzazione quello che avviene è che c’è un’induzione di cellule Th follicolari di tipo 2 che sono in grado quindi di produrre IL-4, IL-21 e quindi sono in grado di favorire lo switch isotipico del linfocita B da IgM a IgE.

Generazione dei Th follicolari

Ma come si generano questi Th follicolari? Lo sviluppo di queste cellule follicolari avviene in diverse fasi, al livello del linfonodo inizialmente la cellula T interagisce con la cellula dendritica e si producono citochine. Ad esempio, nel topo si produce l’IL-6. In presenza di IL-6 inizia l’espressione di BCL-6. Il completo differenziamento di cellule Th follicolari che otteniamo alla fine quando poi la cellula Th follicolare va a livello del linfonodo viene ottenuto attraverso l’interazione che la cellula Th ha con inizialmente la cellula dendritica e poi con il linfocita B.

Abbiamo detto che nel corso della risposta all’allergene si formano anche i linfociti Th2 che mediano le risposte infiammatorie. Il differenziamento dei linfociti Th2 a partire dalle cellule T naïve richiede la presenza di IL-4. Da cosa si distingue la cellula Th2? La cellula Th2 si distingue in base alle citochine che produce che sono IL-4, IL-5, IL-13. Quindi, questo ci deve entrare in testa. I Th1 producono l’IFN-γ, i Th2 producono tutte queste citochine.

Ruolo delle citochine

L’IL-4 agisce sugli endoteli, l’IL-13 provoca la secrezione di muco, l’IL-5 recluta gli eosinofili ecc. Quindi, quello che si è sempre detto è che il differenziamento del linfocita T naïve in Th2 dipende dalla presenza di IL-4. Un piccolo problema è che l’IL-4 non viene prodotta dalle cellule dendritiche. Se noi pensiamo al differenziamento di un linfocita Th1 l’IL-12, che è una delle citochine più importanti, viene prodotta da cellule dendritiche.

Quindi, se il naïve incontra la cellula dendritica e la dendritica gli produce IL-12 quello differenzierà in Th1. Nel caso della cellula Th2 l’IL-4 non viene prodotto dalla cellula dendritica. Quindi, siamo nel linfonodo, la cellula dendritica presenta l’antigene, il linfocita T riconosce l’antigene in associazione alle molecole MHC sulla cellula dendritica e a questo punto in presenza di IL-12 questo T diventa Th1 mentre se c’è IL-4 questo T diventerà Th2.

Meccanismo di azione del GATA-3

Sappiamo che IL-4 agisce sui linfociti Th attivando il fattore di trascrizione STAT6. STAT6, una volta che è stato attivato insieme ai segnali che vengono generati dal TCR, determina l’espressione del fattore di trascrizione GATA-3 che è il fattore trascrizionale che caratterizza proprio queste cellule Th2, esattamente come BCL-6 caratterizzava i Th follicolari.

Quindi, queste cellule T naïve inizieranno l’espressione di GATA-3 che è il principale regolatore del differenziamento dei linfociti Th2. GATA-3 attiva la trascrizione dei geni responsabili della produzione delle citochine caratteristiche delle cellule Th2 ossia IL-4, IL-5 e IL-13. Sono tanti anni che si cerca di capire come avviene il differenziamento dei Th2 nel corso delle risposte allergiche.

Ipotesi sul differenziamento dei Th2

Per adesso ci sono una serie di ipotesi. Una prima ipotesi è che il differenziamento dei Th2 specifici è mediato da una particolare sottopopolazione di cellule dendritiche. Le cellule dendritiche convenzionali sono le uniche cellule in grado...