Appunti di Ingegneria genetica

Lezione 1, 16 settembre 2024

E. Perrin

All’inizio fa una presentazione del corso, spiega come funziona l’esame (1 h e 30 minuti, 6 domande, 3 sulla 1 parte e 3 sulla 2 parte).

Introduzione sulla storia dell’ingegneria genetica (non viene chiesta all’esame): leggere nella slide.

L’ingegneria genetica si basa sulla possibilità di eseguire un clonaggio genico e di costruire delle molecole di DNA ricombinante, cioè sulla possibilità di andare a cambiare il materiale genetico di un individuo. Nasce grazie a tutta una serie di scoperte che poi, messe tutte insieme, permetteranno di andare a costruire delle molecole di DNA ricombinante.

• Scoperta delle DNA ligasi (1967): sono quegli enzimi che legano insieme i frammenti di Okazaki durante la replicazione del DNA; quindi, sono enzimi che sono in grado di legare insieme due frammenti di DNA diversi.
• Scoperta di enzimi di restrizione (1968): sono enzimi in grado di tagliare il DNA.
• Produzione della prima molecola di DNA ricombinante in vitro (1972).
• Primo esperimento di clonaggio (1973).
• Metodologia di sequenziamento del DNA (1977).
• Viene prodotta la prima proteina umana ingegnerizzata (1979), l’insulina.
• Primo animale transgenico (1980).
• Viene inventata la PCR (1983).

Clonaggio genico

Quindi, a partire dalla seconda metà degli anni 70, con la scoperta degli enzimi di restrizione e delle ligasi nasce l’ingegneria genetica. È chiamata anche modificazione genetica o manipolazione genetica: è la manipolazione del DNA di un organismo fatta mediante l’utilizzo della tecnologia.

Manipolazione vuol dire che si può andare a cambiare una singola base, si può andare a togliere o ad aggiungere un pezzo di DNA. Quindi l’ingegneria genetica comprende tutte quelle tecnologie che permettono di andare a manipolare il materiale genetico di un organismo.

E la base dell’ingegneria genetica, che ha permesso di andare a sviluppare tutte le tecnologie successive come le tecnologie di sequenziamento, i sistemi di CRISPR-Cas eccetera, è proprio il clonaggio genico, cioè la possibilità di andare a unire insieme 2 frammenti di DNA diversi in un’unica molecola e andarli a trasferire all’interno di un altro organismo.

Alla fine del corso dovremmo aver imparato proprio a capire come si fa un esperimento di clonaggio di un gene o di un frammento di DNA. Ci dobbiamo concentrare di più sul lato pratico, per capire come progettare un esperimento di clonaggio.

Cose da sapere dai corsi precedenti: vedere slide e fare ripasso per essere più sicuri.

Per inserire un frammento di DNA all’interno degli organismi serve un vettore: un vettore è qualcosa che viene utilizzato per trasportare DNA da un organismo all’altro. La maggior parte dei vettori derivano o da plasmidi o da fagi.

Plasmidi

Sono degli elementi genetici extracromosomiali capaci di replicazione autonoma, accessori. Sono molecole di DNA che si ritrovano prevalentemente nei batteri (eccezione negli eucarioti che non hanno plasmidi, a parte qualche lievito).

Sono molecole di DNA accessorie: vuol dire che non hanno dei geni essenziali per la sopravvivenza dell’organismo, cioè un batterio può vivere benissimo anche senza plasmidi. Spesso però i plasmidi possono diventare essenziali perché possono avere dei geni che diventano essenziali in determinate condizioni.

L’esempio più classico è quello della resistenza agli antibiotici, spesso i plasmidi codificano dei geni che portano il batterio a resistere all’azione di un antibiotico e quindi anche se il plasmide non è essenziale di per sé perché, se non c’è l’antibiotico, di per sé il plasmide non serve a niente, in presenza dell’antibiotico il plasmide può diventare essenziale perché può permettere al batterio di sopravvivere.

Questa associazione tra resistenza agli antibiotici e plasmide è un grosso problema a livello clinico perché i plasmidi sono il principale mezzo di diffusione della resistenza agli antibiotici negli ospedali, perché come vedremo tra poco una caratteristica importante dei plasmidi è la capacità dei plasmidi di essere trasferiti da una cellula ad un’altra, ma dal punto di vista dell’ingegneria genetica questa proprietà dei plasmidi è molto utile.

Perché? Perché vedremo che quando si va ad inserire una molecola di DNA estranea all’interno di un organismo una delle prime cose da capire è sapere se la molecola è entrata oppure no nella cellula in cui si voleva inserire. Nella maggior parte dei casi per saperlo si sfrutta il fatto che i plasmidi, che si usano come vettori, presentano un gene per la resistenza all’antibiotico, le cellule che avranno acquisito il plasmide diventeranno quindi resistenti all’antibiotico e quelle che non lo avranno acquisito non lo saranno. Questa tecnica è una delle prime usate per il clonaggio genico e in ingegneria genetica.

Rimaniamo sui plasmidi naturali che si ritrovano normalmente nei batteri: abbiamo detto che sono molecole di DNA indipendenti dai cromosomi, ma in realtà in alcuni casi i plasmidi possono andare ad integrarsi nei cromosomi (definiti in questo caso episomi) ma nella maggior parte dei casi questo non succede e sono indipendenti rispetto ai cromosomi.

Plasmidi e megaplasmidi

Quanto sono grandi? La maggior parte hanno dimensioni piccole sotto le 350 paia di basi. I plasmidi che si utilizzano in ingegneria genetica hanno solitamente una dimensione massima di 10 k paia di basi, ma esistono anche dei plasmidi molto grandi che vengono chiamati megaplasmidi.

Di ciascun plasmide all’interno di una cellula batterica possono essere presenti più copie, generalmente più i plasmidi sono piccoli e più copie ci sono all’interno della cellula; più sono grandi e più il numero di copie diminuisce. I megaplasmidi sono presenti in generale in una sola copia per ciascuna cellula.

Ciascuna cellula batterica può avere più di un plasmide diverso al suo interno (ci sono cellule che hanno 10/20 tipi diversi di plasmidi); c’è una sola regola: questi plasmidi non devono appartenere allo stesso gruppo di incompatibilità, cioè è stato visto che ci sono dei plasmidi che non possono stare insieme all’interno della stessa cellula.

Quindi se un batterio ha un determinato plasmide, se ce ne metto uno che appartiene allo stesso gruppo di incompatibilità, uno dei due viene buttato fuori. Non possono esistere insieme all’interno della stessa cellula, si danno fastidio a vicenda: generalmente questo è legato a come si replicano i plasmidi.

Plasmidi che si replicano allo stesso modo generalmente sono incompatibili, cioè se all’interno della stessa cellula ho due plasmidi che si replicano allo stesso modo quello che può succedere è che possono darsi fastidio a vicenda: quindi generalmente due plasmidi che si replicano allo stesso modo non sono in grado di stare all’interno della stessa cellula.

Questo è un aspetto importante da tenere conto in ingegneria genetica, poiché a volte è necessario inserire più di un plasmide all’interno della stessa cellula e se i due plasmidi sono incompatibili non si può fare. Quindi va tenuto in conto.

I plasmidi si possono classificare in due modi, o sulla base della loro capacità di essere trasferiti da una cellula ad un’altra oppure sulla base del fenotipo che questi plasmidi conferiscono alle cellule batteriche.

Una delle caratteristiche base dei plasmidi è quella di poter essere trasferiti da una cellula batterica ad un’altra (principale: coniugazione): vengono classificati come coniugativi, non coniugativi o mobilizzabili, in base alla loro capacità di spostarsi da una cellula batterica ad un’altra.

Classificazione dei plasmidi sulla base del loro effetto fenotipico: i plasmidi sono elementi genetici e come tali trasportano dei geni. A seconda dei geni che trasportano questi plasmidi possono conferire un fenotipo diverso.

Ad esempio: plasmidi di resistenza, di fertilità, coloro che producono batteriocine che uccidono altri batteri (COL), quelli degradativi perché degradano sostanze tossiche, oppure quelli che trasportano geni che sono in grado di far diventare un batterio virulento e quindi un batterio non patogeno grazie al plasmide può diventare patogeno.

Importante: i plasmidi generalmente si replicano in maniera autonoma dal cromosoma, hanno una loro origine di replicazione dalla quale iniziano a replicarsi in maniera indipendente rispetto ai cromosomi.

Da ricordare: i plasmidi sono elementi naturali nei batteri, hanno dimensioni variabili e a noi interessano quelli di piccole dimensioni che sono presenti in tante copie nei batteri, si replicano da soli e quindi una volta che li inseriamo in una cellula batterica questi iniziano a replicarsi da soli, spesso trasportano geni per la resistenza agli antibiotici, possono essere passati da una cellula ad un’altra. Come vedremo quello che viene fatto molto spesso in ingegneria genetica è prendere dei plasmidi naturali, modificarli, in modo da poterli utilizzare per trasportare il DNA che noi vogliamo all’interno di un’altra cellula.

Batteriofagi

L’altro grande gruppo di vettori utilizzato in ingegneria genetica sono vettori basati sui fagi, poiché anche loro sono in grado di trasportare DNA da una cellula ad un’altra.

Fagi o batteriofagi sono i virus dei batteri e come tutti i virus sono parassiti quindi non sono in grado di replicarsi senza un ospite. In questo caso il loro ospite sono le cellule batteriche.

La maggior parte dei fagi sono virus a DNA, cioè che hanno un genoma costituito da DNA a doppia elica ma ce ne sono anche a RNA a singola o doppia elica e a DNA a singola elica.

La maggior parte sono fatti in questo modo: testa all’interno della quale si trova il materiale genetico e una coda che è quella che interagisce con le membrane cellulari batteriche e il materiale genetico viene iniettato tramite la coda all’interno della cellula batterica. Ci sono però anche dei fagi chiamati “filamentosi” che hanno una struttura diversa.

Ciclo litico

Non tutti i fagi sono uguali, alcuni hanno il ciclo litico ovvero che una volta entrati nella cellula batterica iniziano a fare tante copie del loro genoma, dopo di che iniziano a produrre proteine del capside che gli serve per sopravvivere nell’ambiente esterno e quando hanno prodotto tante copie del loro genoma e del capside, lisano e quindi uccidono la cellula batterica: queste nuove particelle vengono liberate nell’ambiente e possono andare ad infettare altre cellule batteriche.

Ciclo lisogenico

Ci sono invece dei fagi che hanno un ciclo lisogenico o lisogeno (fagi temperati) che quando entrano all’interno della cellula possono o fare ciclo litico descritto prima oppure rimanere silenti per tanto tempo, si integrano nel genoma batterico in maniera silente, non si riproducono anche per periodi molto lunghi.

Ad un certo punto, a seguito di vari stimoli ambientali, il fago può fuoriuscire dal genoma batterico, iniziare a replicarsi e andare incontro ad un ciclo litico uccidendo la cellula e infettando altre cellule.

Ciclo del fago M13

Esiste un terzo tipo di ciclo che ci interessa di un fago che viene usato in ingegneria genetica: è un fago filamentoso M13 che fa una via di mezzo. Infetta la cellula batterica, inizia a riprodursi e quando le particelle fagiche vengono rilasciate, la cellula non muore; ma si instaura una sorta di “simbiosi”, anche se trattandosi di virus non si può parlare di simbiosi.

La cellula continua a crescere e riprodursi, il fago rimane al suo interno e periodicamente vengono rilasciate particelle di fago all’esterno ma la cellula non muore.

Fago lambda

Ci sono principalmente due fagi che sono stati riadattati in ingegneria genetica: il primo è il fago lambda. Ci interessa che ha la caratteristica particolare di avere geni per la stessa funzione raggruppati tutti insieme dalla stessa parte. Ha un genoma diviso in settori.

Questo ci interessa perché se lo voglio utilizzare in ingegneria genetica, posso togliere facilmente i geni che non mi interessano e sostituirli con geni che a me invece interessano. È reso facilitato e utile.

Altra caratteristica interessante del fago lambda: alle estremità del genoma del fago ci sono estremità COS, coesive cioè il DNA è normalmente a doppia elica, ma alle estremità è lineare e queste due estremità sono complementari tra di loro, possono appaiarsi e il fago da lineare diventa circolare: è quello che succede quando il fago entra nella cellula batterica. Una volta iniettato il genoma del fago circolarizza e questo lo aiuta a replicarsi.

Fago M13

Poi c’è il fago M13 che ha un genoma più piccolo del fago lambda (6407 bp), non uccide le cellule ma continua ad essere replicato. Altra caratteristica interessante: il DNA è a singola elica fuori dalle cellule batteriche e diventa a doppia elica dentro le cellule batteriche. Anche questo ha tutta una serie di applicazioni per l’ingegneria genetica.

Da ricordare: ce ne sono di vari tipi, a noi interessano quelli a DNA e in particolare fago lambda e fago M13.

Meccanismi di trasferimento genetico orizzontale

Ne esistono diversi ma quelli più comuni e studiati sono 3: coniugazione, trasformazione e trasduzione.

Trasformazione

È l’acquisizione, l’integrazione e l’espressione funzionale di DNA extracellulare all’interno di una cellula batterica, ovvero un processo per cui una cellula batterica acquisisce del DNA che si trova in ambiente esterno, libero (ce n’è tanto, si conserva molto bene rispetto all’RNA che invece si degrada molto facilmente) ma non basta che la cellula lo prenda, si deve integrare nel genoma batterico e deve essere espresso.

Se questo non succede, il DNA viene buttato fuori dalla cellula batterica. Quindi la trasformazione implica che il DNA internalizzato rimanga dentro il genoma della cellula. La cosa particolare è che pochissimi batteri in natura sono in grado di acquisire DNA dall’esterno, quindi di fare trasformazione in modo naturale.

Per poter effettuare trasformazione devono avere dei geni per la competenza che codificano proteine che servono per integrare DNA all’interno della cellula. Non solo, ma anche quei batteri che hanno questi geni non sono in grado sempre di fare questa cosa: bisogna che questi geni siano espressi e non sempre lo sono. In natura la trasformazione è abbastanza rara.

In laboratorio invece è possibile rendere un buon numero di batteri competenti = terminologia usata in laboratorio ma non corretta. Perché in laboratorio non si aggiungono proteine al batterio, ma si fa entrare attraverso una foratura il DNA all’interno della cellula. Non si fa diventare competente il batterio, ma si usa la stessa terminologia ma per indicare cose diverse.

Il batterio usato principalmente è E. coli che non è naturalmente competente ma facilmente si può rendere competente e gli si può far acquisire DNA dall’esterno.

Con altri batteri non si riesce perché ogni batterio è diverso (Gram +/monodermi hanno parete cellulare di peptidoglicano e Gram -/didermi hanno due membrane e uno strato sottile di peptidoglicano): di fatto ciascun batterio ha però modificazioni diverse; quindi, per alcuni si riesce facilmente a forare la membrana, per altri no.

Coniugazione

Quando questo non riesce si usa la coniugazione, anche in questo caso cambiandola rispetto a quello che succede in natura: in natura è il passaggio di materiale genetico da una cellula batterica donatrice ad una cellula ricevente, quindi il DNA non viene dall’ambiente esterno ma da un’altra cellula. Generalmente viene passato un plasmide, ma esistono anche altri elementi genetici chiamati “ais”.

Per poter effettuare coniugazione servono dei geni: geni TRA e si dividono in due grandi gruppi. I geni MOB/DTR servono per preparare il DNA plasmidico al trasferimento; il secondo gruppo di geni MPF servono per codificare la struttura che mette in contatto le due cellule batteriche e che permette il trasferimento.

Quindi il primo gruppo di geni prende un plasmide, lo tagliano e lo preparano per essere trasportato in un’altra cellula batterica. L’altro gruppo di geni codifica, nel caso di batteri Gram negativi, il pilus, mentre nel caso di batteri Gram positivi delle adesine di membrana, che sono quelle che mettono in contatto le due cellule batteriche e formano la struttura che permette il passaggio di DNA da una cellula all’altra.

Ci sono dei plasmidi che hanno tutti questi geni, sono in grado da soli di farlo; altri hanno solo i MOB ma non hanno i MPF, mobilizzabili; plasmidi non coniugativi che non hanno entrambi i geni.

La cosa interessante e utile è che anche un plasmide non coniugativo o mobilizzabile, può comunque essere trasferito se all’interno della cellula c’è un plasmide che ha tutti i geni per la preparazione e trasferimento del plasmide. Glieli passa il plasmide che li ha a quello che non li ha. Anche questa può essere usata in laboratorio per trasferire materiale genetico. Perché questa cosa ci è utile in ingegneria genetica? Non tutti i batteri possono essere resi trasformabili