Appunti di Ematologia e immunologia di laboratorio

Emolinfopoiesi e morfologia cellulare

Per studiare la morfologia cellulare, si può andare su Cellwiki.net.

Emolinfopoiesi durante la vita fetale

È garantita dal sacco vitellino ed è transitoria, non garantendo una produzione duratura delle cellule del sangue. Nei primi mesi della vita fetale (tra il 1° e il 2° mese), comincia a prevalere l'emopoiesi epatica (il fegato garantisce l'emopoiesi fetale) fino alla nascita, decrescendo verso il 5° mese. L'emopoiesi è anche splenica (milza) dal 2° al 7° mese. L'emoglobina è caratterizzata dall'emoglobina fetale.

Verso il 5° mese, comincia ad aumentare l'emopoiesi del midollo osseo e rimane duratura per tutta la vita, decrescendo anche sulla base di disfunzioni che si manifestano dai 60 anni in su. Quando è inefficace, è alla base di malattie che possono trasformarsi in leucemie. Se è limitata a un'insufficienza, si parla di sindromi mielodisplastiche o mielodisplasie causate anche da mutazioni cromosomiche o mutazioni geniche, che possono evolvere in leucemie croniche o leucemie acute.

Diagnosi e medicina molecolare

Oggi non si può più fare una diagnosi corretta e definita senza conoscere dei parametri antigenici. La diagnosi è il presupposto per l'utilizzo di farmaci biologici nella medicina molecolare o medicina personalizzata (tailor therapy). Dobbiamo conoscere alterazioni molecolari e citogenetiche (alterazioni cromosomiche che si possono studiare mediante tecniche citogenetiche, cioè tecniche che permettono di studiare il cariotipo delle alterazioni dell'emolinfopoiesi. Il cariotipo può essere classico o molecolare, che si studia con il metodo FISH).

L'emolinfopoiesi può essere fisiologica o patologica (si usa la citogenetica, le tecniche di diagnostica molecolare basate sulla tecnica in vitro della PCR). Le cellule dialogano tra loro comprendendo anche strutture recettoriali, solitamente di membrana, ma anche intracitoplasmatiche.

Strutture recettoriali e antigeni

Queste strutture recettoriali si limitano a diversi fattori geneticamente definiti ligandi. Queste strutture possono essere specifiche o associate alle diverse linee cellulari ematiche. Sono immunogeniche, cioè producono una risposta immunitaria. Sono linee cellulari chiamate antigeni (di membrana, citoplasmatici o nucleari). Strutture che variano a seconda della linea cellulare, lo stadio di differenziazione e la maturazione.

Linfociti e immunologia

La risposta cellulare coinvolge i linfociti T, la risposta immunologica coinvolge i linfociti B. Gli antigeni vengono identificati con gli anticorpi monoclonali, che servono in diagnostica per studiare le cellule del sangue, per la citometria a flusso. Sono stati trasformati da reagenti di laboratorio a farmaci biologici per le terapie personalizzate. Oggi sono utilizzati in clinica sia nei tumori liquidi che nei tumori solidi. Vanno a colpire solo quel determinato bersaglio senza avere tutte le conseguenze collaterali di chemioterapia e radioterapia.

Studio dell'emolinfopoiesi

Lo studio dell'emolinfopoiesi permette anche lo studio degli antigeni di una determinata linea di cellule a un certo stadio di differenziazione. Questo è l'immuno-fenotipo. Si utilizzano tecniche diagnostiche basate sul sequenziamento. Permettono di vedere anche se ci sono state delle mutazioni puntiformi. Tra queste tecniche c'è la NGS (Next Generation Sequencing).

Tutto questo permette di capire cosa è successo alle cellule che hanno dato origine a delle determinate linee cellulari e che sono capaci anche di rigenerarsi, cioè le cellule staminali emopoietiche. Un progenitore è CLP (progenitore comune delle linee linfoidi) e l'altro è CMP (progenitore comune delle linee mieloidi). Si generano entrambi dal midollo osseo ma poi si differenziano.

Linee cellulari

La linea linfoide si divide in 3 diversi tipi che originano nel sangue linfociti T (immunità cellulo-mediata), linfociti B (immunità anticorpale) e Natural Killer (NK, risposta supplementare). La linea mieloide dà origine alla linea granulocitaria (granulociti), monocitaria (monociti), megacariocitaria (piastrine) ed eritroide (eritrociti).

Origine delle cellule staminali emopoietiche

• Midollo osseo
• Sangue periferico: in seguito a fenomeni farmacologici che inducono la periferizzazione, cioè la comparsa di staminali emopoietiche nel sangue periferico chiamate PBSC.
• Sangue cordonale
• Fegato fetale

Aspetti funzionali del sistema emolinfopoietico

L'emopoiesi è un processo complesso e multi-step che vede la produzione di tutte le cellule del sangue (piastrine, globuli rossi, globuli bianchi di tutti i tipi, cellule endoteliali). È controllata da fattori coinvolti nella produzione di cellule del sangue, cioè dal midollo osseo. È regolato da delle cellule specializzate e da una serie di proteine e molecole solubili, chiamate fattori (di trascrizione, inibitori…).

Le cellule altamente specializzate garantiscono la produzione delle cellule ematiche. Si dividono in maniera asimmetrica tra loro. Le cellule sono le LT-HSC (Long Term Hemotopoietic Stem Cells) e le ST-HSC (Short Term Hemotopoietic Stem Cells). Dei segnali indicano la strada che le cellule devono seguire: linfoide o mieloide.

Produzione delle cellule effettrici mature

La strada linfoide, attraverso dei progenitori orientati (committed) che, a seconda del messaggio ricevuto (inibizione/maturazione), origineranno cellule effettrici mature che verranno poi quantificate e descritte. Si originano i linfociti B che si trasformeranno nello stadio terminale di differenziamento e maturazione in plasmacellule deputate a secernere anticorpi. C'è anche la linea di linfociti T, responsabili dell'immunità cellulare anche nelle zone periferiche. Questi si dividono in linfociti T helper CD4 e linfociti T citotossici CD8.

I linfociti NK (Natural Killer) sono altri linfociti che aiutano gli altri linfociti nella risposta immunitaria. Se lo sviluppo è stato orientato verso la linea mieloide, si forma un progenitore comune della linea linfoide (CMP) che riceve altri messaggi a livello genico e la cellula matura in due grandi linee: linea granulocitica-macrofagica (si sviluppano granulociti e macrofagi) e la linea megacariocitaria (si sviluppano i globuli rossi e le piastrine).

Processo di emopoiesi

L'emopoiesi inizia durante la vita fetale, tra il 1° e 2° mese, grazie al sacco vitellino dove è garantita da alcune cellule immature derivanti dal mesoderma che poi differenzieranno a formare i precursori della serie rossa, gli emangioblasti. La maturazione e la produzione delle cellule del sangue avvengono nel midollo osseo, in un microambiente midollare dove intervengono un sacco di cellule. Il contesto è la nicchia ematopoietica. Le cellule staminali ematopoietiche sono multipotenti.

Le cellule staminali commissionate non hanno capacità di automantenimento e sono unipotenti. Le cellule però possono andare incontro a degli sviluppi neoplastici durante la loro proliferazione. Questi sviluppi possono sfuggire ai controlli. Bisogna studiare il fenotipo delle varie cellule del sangue partendo da quando le cellule sono staminali fono a quando non sono completamente differenziate. Si va ad individuare il corredo antigenico cellulare. La classificazione è valida in tutto il mondo, agli antigeni viene assegnata una sigla, cioè CD. Ognuno di questi va ad individuare le cellule mediante gli anticorpi monoclonali. Un antigene non manca mai, è CD34.

Microambiente midollare e nicchia emopoietica

• Stroma: matrice extracellulare costituita da collagene, molecole di adesione, proteoglicani...
• Cellule staminali: organizzazione gerarchica regolata da processi di proliferazione e differenziamento (dalla cellula più immatura alla cellula meno immatura)
• Cellule: fibroblasti, osteoblasti, adipociti, monociti/macrofagi, reticolari, endoteliali.
• Precursori emopoietici: proliferano e differenziano originando le cellule del sangue
• Fattori di crescita: influenzano, positivamente o negativamente, i processi di differenziamento e maturazione mediante interazione con i ligandi dei recettori delle cellule staminali e dei progenitori emopoietici.

L'emolinfopoiesi porta al differenziamento di cellule che dovranno garantire la risposta immunitaria. Le cellule del sistema immunitario si riproducono e si differenziano nella periferia durante la risposta immunitaria. Il midollo osseo è soggetto a stimoli ed è sollecitato ad aumentare o rallentare la produzione delle linee ematiche. Per esempio, quando ci sono delle infezioni il numero di globuli bianchi presenti nel sangue aumenta (leucocitosi neutrofile). Le cellule ematiche hanno una vita breve, tranne i linfociti, quindi, vengono rigenerate continuamente attraverso il processo di leucocitosi. Quando c'è uno stress ematologico questo processo è più veloce. Il midollo reagisce a stimoli endogeni ed esogeni.

Cellule staminali emopoietiche

Le cellule staminali emopoietiche possono essere multipotenti, dando origine a tutte le cellule del sangue. In vitro possono dare origine anche ad altri tessuti in certe condizioni colturali. Altrimenti, sono già indirizzate verso una certa linea. Le cellule staminali originano da un piccolo cluster di poche unità (8-16 cellule), queste cellule staminali sono totipotenti perché riescono a generare un embrione. La maturazione della morula e del cluster dà origine a una cellula meno immatura non più in grado di garantire lo sviluppo di tutto l'embrione ma in uno qualsiasi dei compartimenti. Sono cellule pluripotenti.

Le cellule staminali che sono presenti nei vari tessuti del corpo sono cellule staminali adulte e sono molto diverse tra loro per la loro collocazione, per la loro numerosità e per la loro funzione. Si originano cellule con ognuna una specificità tissutale. Si mantiene intatto il patrimonio e si permette alle altre cellule di differenziarsi nella linea tissutale. Le cellule staminali emopoietiche sono indistinguibili da quelle mature. Per distinguerle dobbiamo conoscere il fenotipo, cioè il corredo antigenico staminale delle cellule che si può trovare con gli anticorpi monoclonali.

La sede naturale del compartimento staminale emopoietico è il midollo osseo, ma le cellule staminali le troviamo anche nel fegato. Non mantengono un'emopoiesi duratura. Il sangue cordonale è ricco di staminali che possono garantire un'emopoiesi duratura, solo che sono troppo poche per garantirne una sufficiente in un individuo adulto. Sono stati creati cicli di farmaci che sono in grado di stimolare il midollo osseo alla produzione di staminali che noi possiamo individuare e separare dal sangue periferico. Queste cellule si possono anche congelare e infondere in altri soggetti o nel soggetto stesso. Si va riprodurre un'emopoiesi duratura.

Queste sono le cellule PBSC (Peripheral Blood Stem Cells) che vengono individuate da CD34 e che servono per il trapianto di cellule ematiche CSE (Cellule Staminali Emopoietiche). Il trapianto si chiama trapianto allogenico di CSE se le cellule provengono da un altro donatore compatibile. Se queste sono prelevate dallo stesso soggetto al quale vengono poi reinfuse, si ha un trapianto autologo di cellule CSE. Vengono usate nella clinica ematologica per autotrapianto e allotrapianto. Queste cellule staminali colonizzano il midollo e arrivano alle nicchie emopoietiche. Se le cellule non sono compatibili, in caso di trapianto allogenico, c'è una zona grigia dove è difficile capire se c'è un rigetto delle CSE (non riescono a colonizzare il midollo del ricevente), quindi bisogna condizionare il ricevente. A volte invece ci può essere un'aggressione delle CSE e delle cellule immuno-competenti infuse che non riconoscono come self i tessuti del ricevente originando problematiche cliniche gravi e mortali che definiscono un quadro clinico chiamato malattia da trapianto contro l'ospite.

Bisogna conoscere le cellule e dire al clinico dove la popolazione clonale studiata si è bloccata, sia nell'asse linfoide che mieloide per diverse linee. Il primo livello è la morfologia, dobbiamo essere in grado di conoscere la morfologia delle cellule del sangue. Dopo abbiamo la capacità di studiare tutte le linee cellulari ai diversi livelli. Si possono individuare le diverse strutture citoplasmatiche di membrana grazie agli anticorpi monoclonali. Così si completa il corredo antigenico, cioè l'immuno-fenotipo. Poi si possono anche trovare i cariotipi attraverso tecniche di bandeggio e tecniche molecolari.

Nonostante questo, le terapie possono fallire e la malattia tornare recidiva. Quindi si usa il trapianto di CSE. Queste CSE possono anche essere prese dal sangue. Queste cellule staminali periferiche sono le PBSC tutte queste cellule immature hanno in membrana CD34. Ci sono dei protocolli immunologici per studiare quante cellule sono in periferia e si attiva una procedura trasfusionale sia nel trapianto autologo che allogenico. La procedura di medicina trasfusionale per raccogliere le cellule staminali periferiche si chiama citoaferesi. Può essere anche una semplice donazione di globuli rossi.

Sangue e sistema di laboratorio

L'ultimo strumento che abbiamo per caratterizzare le cellule del sangue comporta l'individuazione di particolari sottotipi biologici della malattia che possono eludere il trattamento farmacologico e dare origine ad una recidiva è una tecnica di ultima generazione chiamata HSG o sequenziamento massivo. Serve perché questo sequenziamento ci permette di valutare mutazioni puntiformi che originano una sequenza che può produrre una proteina che dà un vantaggio selettivo che poi si espande e comporta la ripresa della malattia con caratteri diversi rispetto all'esordio.

La struttura del sangue

Il sangue è un tessuto connettivo fluido, rinchiuso in un sistema di canali comunicanti (vasi arteriosi e venosi), costituito da una parte liquida (plasma 55%) e da elementi figurati (45%): globuli rossi (eritrociti), globuli bianchi (leucociti) e piastrine (trombociti). La parte corpuscolata consiste soprattutto in globuli rossi. La parte corpuscolata costituisce l'ematocrito. I dati dei referti validati vanno a finire nel SIL (Sistema Informativo di Laboratorio).

Processo di laboratorio

1. Fase preanalitica: si conclude quando il campione biologico arriva in laboratorio. Ogni campione deve avere segnato quando entra in laboratorio (orario, chi ha chiesto il campione e chi lo ha portato). Il campione fa il check-in.
2. Fase analitica: il campione entra in laboratorio. Come si fa il check-in si fa anche il check-out per vedere quanto il campione sta in laboratorio.
3. Fase post-analitica: il tempo di refertazione (da quando arriva a quando esce dal laboratorio) deve essere adeguato, si chiama TAT. Questo è molto importante quando si hanno degli esami urgenti da effettuare, più è urgente l'analisi più il TAT deve essere breve. Se si rientra in un ambito di una tabella con i valori di panico bisogna subito contattare il medico.

I globuli rossi con l'emoglobina trasportano ossigeno. I leucociti sono i responsabili della risposta immunitaria ai microrganismi batterici, virali e cellulari. Sono i responsabili del riconoscimento dell'antigene, delle reazioni alla base delle patologie autoimmuni (nel mancato riconoscimento del self). I trombociti sono responsabili della formazione del coagulo sanguigno. Sono responsabili della cascata coagulativa.

Quantità e ordine di grandezza delle cellule del sangue

L'ordine di grandezza dei globuli rossi è 10, cioè il micrometro. Sono milioni. Se si considera su litro, 10¹², su millilitro è 10⁹. I leucociti sono divisi in 5 classi, delle quali i granulociti neutrofili sono la classe principale (60% dei leucociti), i linfociti sono 20-40%, i monociti sono 4-10%, gli eosinofili sono 1-3%, i basofili sono 0-1%. Il valore assoluto nell'emogramma serve per riconoscere condizioni che compromettono la risposta immunitaria del soggetto. Le piastrine hanno un ordine di grandezza di 3x10⁵. Tra 150 e 500 mila su microlitro.

Progenitore comune e serie rossa

Dal progenitore comune si origina tutta la serie rossa. Questa è sotto l'influenza di una molecola avente le caratteristiche degli ormoni, cioè la EPO (eritropoietina). Questa è prodotta dal rene ogni volta che c'è una situazione di ipossia (scarso apporto di ossigeno). L'eritropoietina si lega agli eritrociti, stimola il precursore a generare cellule del sangue grazie a dei fattori di crescita e delle citochine, in particolare di interleuchine (IL).

I globuli rossi maturi vanno incontro a progressivo invecchiamento e il limite temporale è intorno ai 120 giorni. Dopodiché sulla loro membrana compaiono delle molecole ossidate che rappresentano il segnale per la loro fagocitosi, cioè gli antigeni di superficie. Vengono attaccati da cellule (macrofagi) deputate ad attaccare altre cellule tramite un processo di internalizzazione chiamato fagocitosi. Vengono trasportati nella milza e nel fegato. Anche in questa serie noi abbiamo una serie di step maturativi e differenziativi.

Morfologia delle cellule ematiche

È importante conoscere la morfologia delle cellule che configurano un determinato stadio perché quando studiamo al microscopio le cellule, noi dobbiamo sapere a che stadio siamo perché è normale che nel sangue periferico troviamo cellule mature, non è normale che lì ci siano cellule del sangue immature. È una spia di una malattia. Per affrontare lo studio morfologico dobbiamo conoscere la morfologia delle cellule. Il pro-eritroblasto darà origine agli eritroblasti, che si devono riconoscere morfologicamente e immunologicamente (il suffisso -blasto indica una cellula in proliferazione). Queste sono cellule committed, cioè orientate, sulla linea rossa. Se sono bloccate per cause molecolari o genetiche, il processo di differenziazione può essere alterato.