Appunti di Biologia cellulare

Biologia cellulare

Appunti di Prof. Bucci Cecilia

A.A. 2022/2023

Lezione 05/10/2022

Organizzazione della cellula eucariotica

La cellula eucariotica è altamente compartimentalizzata e può avere varie forme (dalla tondeggiante alla specializzata). Le cellule possono poi essere polarizzate. Tale polarizzazione può essere:

• Funzionale: transitoria (es. cellula in migrazione).
• Strutturale: tipica del tipo di cellula (es. cellula epiteliale).

Nella polarità strutturale si caratterizzano una membrana apicale e una basolaterale, con una composizione diversa in lipidi e proteine. Tale diversità determina anche una diversa funzione delle due membrane.

I compartimenti della cellula eucariotica sono: endosomi, nucleo, reticolo endoplasmatico, apparato del Golgi, poliribosomi liberi, perossisomi, mitocondri e membrana plasmatica. La comunicazione tra i compartimenti è attribuita al sistema di trasporto vescicolare. Nonostante ciò i compartimenti restano definiti grazie al ruolo delle proteine. La compartimentalizzazione differisce tra i diversi tipi cellulari perché dipende dalla funzione della cellula.

Relazioni topologiche tra compartimenti

Per comprendere relazioni e trasporto tra compartimenti diversi bisogna capire come questi si sono originati perché tali relazioni derivano dalla storia evolutiva.

Ipotesi di origine del nucleo

La membrana plasmatica di antiche cellule procariotiche si è invaginata formando la doppia membrana nucleare e racchiudendo il DNA. Si sono formati così il nucleo e il reticolo endoplasmatico. Questo spiega perché nucleoplasma e citoplasma sono topologicamente equivalenti, così come ambiente esterno e lume del reticolo endoplasmatico. Ciò spiega anche perché molecole di piccole dimensioni passano senza controllo tra nucleoplasma e citoplasma mentre molecole del reticolo endoplasmatico passano all’esterno tramite la via secretoria (così come molecole del Golgi).

Ipotesi di origine del mitocondrio

La cellula eucariotica primitiva fagocita una cellula procariotica generando il mitocondrio con la doppia membrana mitocondriale. Pertanto ambiente esterno e spazio intermembrana sono topologicamente equivalenti. In sintesi tra compartimenti topologicamente equivalenti è presente traffico vescicolare. Inoltre il nucleo si disassembla durante la mitosi, cosa possibile perché nucleoplasma e citoplasma sono topologicamente equivalenti.

Ci sono quindi tre modalità di trasporto e la proteina riconosce la destinazione grazie a segnali di smistamento (normalmente rappresentati da sequenze amminoacidiche). Tale segnale può essere:

• Sequenza segnale: sequenza di amminoacidi contigui.
• Zona segnale: sequenze di amminoacidi in diverse regioni della proteina che formano la zona segnale solo nella struttura terziaria.

La proteina è poi riconosciuta da recettori per il trasporto, che la trasportano al compartimento di destinazione. Spesso, non sempre, il segnale viene tagliato una volta che la proteina giunge a destinazione perché la cellula mira sempre al risparmio. Un esempio di proteina alla quale non viene eliminata la sequenza segnale è l’istone nucleare. La sequenza segnale nucleare non è rimossa perché è necessaria alla ricollocazione dell’istone nel nucleo dopo la divisione. Con il disassemblaggio del nucleo, DNA e proteine nucleari vengono liberati nel citoplasma. Dopo la divisione le proteine vengono indirizzate al nucleo con la loro sequenza segnale, che non è stata mai eliminata.

Sintesi delle proteine

Le proteine possono essere sintetizzate nel citoplasma o nel reticolo endoplasmatico rugoso. In realtà la sintesi inizia sempre nel citosol e poi, se la proteina ha un segnale di indirizzamento al reticolo, il complesso proteina-mRNA-ribosoma si lega al reticolo. Le proteine sintetizzate nel citosol possono restare nel citosol o andare al nucleo, perossisomi, mitocondri. Le proteine sintetizzate nel reticolo endoplasmatico rugoso vanno al Golgi e poi alla membrana, lisosomi, o sono destinate alla secrezione.

Ripiegamento, modificazioni, maturazione delle proteine

Una proteina appena sintetizzata non ha attività biologica nella maggior parte dei casi. Si deve prima ripiegare e modificare. Tra le modificazioni abbiamo l'aggiunta di gruppi chimici o la delezione di parti della proteina. Tali modificazioni possono determinare la stabilità e la localizzazione della proteina. Le proteine devono ripiegarsi in conformazioni tridimensionali specifiche e proteine multiple devono assemblarsi in un complesso funzionale. Le conformazioni derivano dalle interazioni tra le catene laterali degli amminoacidi.

Principio classico: le informazioni necessarie per raggiungere la corretta conformazione tridimensionale sono contenute nella sequenza aminoacidica. In realtà il ripiegamento è mediato dall'attività di altre proteine, le chaperon molecolari, che catalizzano il ripiegamento aiutando l'auto assemblaggio. Lo fanno legando e stabilizzando polipeptidi parzialmente ripiegati o svolti e impedendo aggregazioni o ripiegamenti non corretti.

Le chaperon sono molto conservate nell'evoluzione. Le principali famiglie sono le Hsp70 e Hsp60. La conservazione nell’evoluzione la si evidenzia dalla presenza di chaperon molecolari già nei procarioti.

Funzionamento

Le Hsp70 si legano alla proteina durante la traduzione e la mantengono svolta per evitare la formazione di ripiegamenti anomali prima del termine della traduzione. Stessa cosa avviene nel trasporto agli organelli. Ad esempio, nel trasporto ai mitocondri, la proteina deve essere svolta per attraversare i canali della doppia membrana. Durante la traslocazione, le Hsp70 citosoliche si staccano dalla proteina e le Hsp70 mitocondriali si legano per mantenere svolta la porzione traslocata. Al termine della traslocazione la proteina viene ripiegata. Il distacco delle Hsp70 consuma ATP. Al termine del processo la proteina può comunque ripiegarsi scorrettamente perché necessita delle Hsp60. Queste chaperon sono complessate in strutture a botte composte da 14 subunità in grado di accogliere la proteina svolta e consentirne il ripiegamento. Ciò è possibile perché all'interno del complesso la proteina trova un ambiente senza stimoli esterni. Anche nel distacco da Hsp60 si consuma ATP.

Recentemente è stato scoperto che la cavità del complesso non è unica ma sono due. Inoltre è stato scoperto che durante il ripiegamento la cavità è chiusa da una proteina che funge da coperchio. Il ripiegamento avviene in più fasi e in ognuna di esse possono avvenire errori. Se tali errori non possono essere corretti la proteina viene degradata. Ci sono quindi sistemi che riconoscono la proteina mal ripiegata e la indirizzano alle proteasi.

Altre proteine coinvolte nel ripiegamento

Oltre alle chaperon ci sono anche altre proteine coinvolte nel ripiegamento, come gli enzimi coinvolti nella formazione dei ponti disolfuro, legami che stabilizzano la struttura terziaria della proteina. Nella cellula è presente anche la PDI (proteina disolfuro isomerasi), enzima che rompe e riunisce i legami disolfuro. Tale funzione è necessaria alla correzione dei ponti disolfuro errati. L'attività di PDI è correlata con l'attività secretoria perché i ponti disolfuro stabilizzano la struttura della proteina anche fuori dalla cellula. Un altro enzima coinvolto è la peptidil prolil isomerasi, enzima che isomerizza il legame peptidico che coinvolge la prolina. Normalmente, il legame è trans ma quando c'è la prolina può essere anche cis. La diversa isomerizzazione influenza la struttura terziaria della proteina.

Modificazioni delle proteine

Le modificazioni avvengono dopo la traduzione e possono alterare l'attività, la vita media e la localizzazione della proteina. Si distinguono in:

• Modificazioni chimiche: aggiunta di gruppi chimici
• Modificazioni di maturazione: delezioni di uno o più amminoacidi

Modificazioni chimiche

• Acetilazione (-CH₃CO al gruppo amminico N-terminale): è la modificazione più comune, presente nel 80% dei casi
• Glicosilazione
• Fosforilazione
• Aggiunta di lipidi
• Idrossilazione
• Carbossilazione

Le modificazioni chimiche possono essere reversibili o irreversibili.

Glicosilazione

È un'aggiunta di zuccheri (più o meno modificati) a una proteina. È un processo co-traduzionale. Serve per stabilizzare la proteina, per il suo ripiegamento e influenza la sua attività. Ci sono due tipi: N-glicosilazione (RE) e O-glicosilazione (Golgi). Il ruolo degli zuccheri nel ripiegamento è dovuto a proteine del reticolo endoplasmatico come la calnexina (proteina di membrana) e calreticulina (proteina del lume). Entrambe si legano ai carboidrati della proteina bloccandola in determinate posizioni. La calnexina blocca l'estremità N-terminale vicino alla membrana mentre la calreticulina blocca la proteina per consentire la formazione dei corretti ponti disolfuro. Il reticolo opera anche un controllo qualità sul ripiegamento. Se la proteina non è correttamente ripiegata non lascia il reticolo e viene nuovamente tentato il ripiegamento. Se non si ripiega correttamente, la proteina viene degradata. Una proteina coinvolta nel controllo qualità è proprio la calnexina. Immediatamente dopo la sintesi la proteina non è ancora ripiegata e l'oligosaccaride viene modificato con rimozione di due residui di glucosio. L'oligosaccaride monoglucosilato è riconosciuto dalla calnexina, che lega la proteina e ne consente il ripiegamento. In seguito ad azione di una glucosidasi, il glucosio viene staccato dalla proteina, la calnexina non la riconosce più e la proteina viene rilasciata. Se si è ripiegata correttamente, potrà uscire dal RE. Se non è ancora ripiegata, viene riconosciuta dalla glucosiltransferasi che attacca un residuo di glucosio all'oligosaccaride, in modo che la glicoproteina possa di nuovo legarsi alla calnexina e ricominciare il ciclo.

Modificazioni lipidiche

Servono ad ancorare la proteina alla membrana. Abbiamo:

• N-miristilazione: aggiunta di acido miristico (14C) ad una glicina N-terminale
• Prenilazione: Aggiunta di un gruppo prenile: farnesile (15C) o geranil-geranile (20C) ad una cisteina C-terminale
• Palmitilazione: aggiunta di palmitato (16C) ad una cisteina interna

Miristilazione

La proteina subisce sia una modificazione chimica, rappresentata dalla giunta del miristato, sia una modificazione di maturazione, rappresentata dalla rimozione della metionina iniziale.

Prenilazione

La prenilazione comprende:

• Farnesilazione (15C)
• Geranil-geranilazione (20C)

La farnesilazione coinvolge proteine che hanno la sequenza CAAX al C-terminale, dove C=cisteina AA=AA alifatici X=AA generico. Tale sequenza è riconosciuta dalla farnesil-transferasi, che aggiunge un farnesile al gruppo -SH della cisteina. Il processo avviene in 3 fasi:

• Farnesilazione
• Rimozione dei 3 AA C-terminali
• Metilazione della cisteina

Nella geranil-geranilazione la sequenza riconosciuta è Cys-Cys o Cys-X-Cys. Entrambe le Cys sono geranil-geranilate.

Importanza dello studio delle modificazioni lipidiche: proteina Ras

La proteina Ras è coinvolta nella proliferazione cellulare e nella oncogenesi di molti tumori. È una GTPasi. Queste proteine sono anche dette interruttori molecolari perché passano da una forma attiva (legante GTP) a una forma inattiva (legante GDP) e viceversa, regolando diverse funzioni in cellula. In molti tumori, la Ras è mutata e incapace di idrolizzare il GTP. Pertanto resta sempre attiva e spinge la cellula a proliferare senza controllo. Il passaggio OFF-ON delle proteine G può essere compiuto dalla proteina stessa o da proteine GEF (Guanine Exchange Factor), che spinge la proteina G a scambiare il GDP con GTP. L'idrolisi del GTP a GDP invece è stimolata dalle proteine GAP (GTPase Activating Proteins), che spinge le proteine G a idrolizzare il GTP. [L'attività di GAP è rivolta soprattutto a proteine G monomeriche, come Ras.] La Ras è una proteina farnesilata e, quindi, è legata alla membrana plasmatica dove è presente anche la proteina GEF.

Per contrastare la proliferazione tumorale i ricercatori hanno usato inibitori della farnesil-transferasi. Queste sostanze vanno a impedire la farnesilazione di Ras, questa non arriva la membrana e non viene attivata da GEF, bloccando la proliferazione.

Ancora di GPI

GPI = Glicosilfosfatidilinositolo. È una modificazione lipidica che avviene nel reticolo endoplasmatico. Le proteine da ancorare presentano già una porzione C-terminale inserita nella membrana del reticolo endoplasmatico. Questa porzione viene recisa e la proteina resta ancorata alla membrana solo grazie a GPI. È stato notato che l'ancora GPI è coinvolta nello smistamento della proteina.

Fosforilazione

L'aggiunta di un gruppo fosfato su tirosina, serina e treonina da parte di enzimi detti chinasi. È una modificazione reversibile grazie a un'altra classe di enzimi detti fosfatasi. La fosforilazione può sia attivare che disattivare la proteina bersaglio. Anomalie presenti a livello di chinasi e fosfatasi alterano la trasduzione del segnale e quindi le regolazioni di processi di crescita e differenziamento.

Modificazioni di maturazione

La maturazione comporta la delezione di segmenti peptidici ed è, in genere, irreversibile. Il taglio è tipico della rimozione della sequenza segnale e dell'attivazione di enzimi, come quelli digestivi e della coagulazione, e di ormoni come l'insulina.

Maturazione dell'insulina

L'insulina presenta due catene legate da due ponti disolfuro ottenute in seguito a taglio proteolitico. Le insulina è tradotta come preproinsulina formata da:

• Sequenza segnale: all'estremità N-terminale. Porta la proteina al reticolo endoplasmatico
• Catena B
• Polipeptide di connessione, detto anche peptide C
• Catena A: all'estremità C-terminale

La rimozione della sequenza segnale genera la proinsulina. Dopo la formazione dei ponti disolfuro, il peptide di connessione viene tagliato e si ottiene l'ormone maturo.

Autosplicing

Tipico di batteri ed eucarioti primitivi. Consiste nella rimozione di un segmento interno alla proteina (detto inteina) e nella ricongiunzione delle estremità. È un processo autocatalitico.

Regolazione della funzione delle proteine

Ci sono diversi livelli di regolazione:

• Espressione (viene quindi controllata la quantità di proteina)
• Controlli trascrizionali
• Controlli post-trascrizionali
• Controlli traduzionali
• Controllo post-traduzionale
• Localizzazione
• Attività
• Regolazione da parte di piccole molecole (Cambiamenti di conformazione alterano attività catalitica. L’attacco di piccole molecole (aa, nucleotidi; associazioni non covalenti) cambia la conformazione)
• Fosforilazione delle proteine
• Interazioni proteina-proteina

Degradazione delle proteine

Le cellule possiedono vie di degradazione delle proteine sia extracellulari sia intracellulari. La principale via extracellulare è costituita dalle proteasi digestive che nell’intestino frammentano le proteine ingerite. La degradazione proteica intracellulare gioca molti ruoli importanti nella cellula.

• La degradazione delle proteine cellulari è un processo costante e senza interruzioni.
• La degradazione rimuove le proteine anormali (se le proteine anormali non vengono rimosse si accumulano e possono “avvelenare” la cellula).
• La degradazione facilita il riciclo degli amminoacidi.
• Degradazione rapida per proteine difettose o proteine regolatrici (esempio: fattori di trascrizione, cicline).

Quindi i livelli delle proteine all’interno delle cellule sono determinati non soltanto dalla velocità di sintesi ma anche dalla velocità di degradazione. L’emivita delle proteine nella cellula è molto variabile (da pochi minuti a parecchi giorni). Le vie intracellulari sono almeno due:

• Proteasomica ubiquitina-dipendente (UPS)
• Lisosomiale

Degradazione proteasomica ubiquitina-dipendente

Principale via di degradazione selettiva che utilizza l’ubiquitina come marcatore di proteine nucleari e citosoliche da degradare. Avviene in due tappe principali:

1. Il legame di una catena di ubiquitina alla catena laterale di una lisina interna di una proteina bersaglio.
2. La proteolisi della proteina ubiquitinilata tramite il complesso cilindrico costituito da più subunità chiamato proteasoma.

L’ubiquitina è un polipeptide di 76 aa altamente conservato negli eucarioti.

• Le proteine sono contrassegnate per la degradazione dall’attacco di ubiquitina al gruppo amminico della catena laterale di un residuo di lisina.
• In seguito sono aggiunte altre ubiquitine per formare una catena di ubiquitine.
• Le proteine poli-ubiquitinate sono riconosciute e degradate da un grosso complesso proteico composto da varie subunità, il proteasoma.
• L’ubiquitina è poi rilasciata e può essere riutilizzata.
• L’attacco dell’ubiquitina e la degradazione della proteina richiedono ATP.

Per essere riconosciuta come proteina da degradare la proteina deve contenere una sequenza che è riconosciuta da un enzima che fa legare l’ubiquitina al substrato. Diversi segnali vengono riconosciuti, come il PEST (prolina, acido glutammico, serina e treonina) o altre sequenze specifiche. Il proteasoma è costituito da una parte centrale catalitica e due subunità regolatorie che riconoscono le proteine poliubiquinate e le mandano alla subunità catalitica. L'ubiquitina viene legata e attivata dall'enzima E1, che la cede a E2, che la cede a sua volta a E3. Sia E2 che E3 possono cedere l'ubiquitina alla proteina da degradare. La cellula usa le due famiglie di proteine ubiquitinilanti E2 e E3 per...