Appunti delle lezioni di Laboratorio di micro e nano strutture

Laboratorio di micro e nano strutture

Introduzione

Gli stimoli che una cellula subisce nella sua condizione fisiologica sono ancora impossibili da riprodurre in laboratorio. Lo scenario è molto complicato ma ci sono diversi metodi per stimolare precisi comportamenti cellulari. In fisiologia, uno stimolo è un cambiamento rilevabile nell’ambiente interno o esterno; è qualcosa che cambia intorno alla cellula e che ne determina una modifica nel comportamento (sintesi di sostanze, proliferazione, differenziazione…). La capacità di rispondere agli stimoli si chiama sensibilità. La risposta ad uno stimolo può essere un cambiamento di stato o di attività di una cellula in termini di movimento, secrezione ed espressione genica. Le risposte possono essere generiche o, in base ai recettori, più specifiche e selettive per il tipo cellulare. Per molto tempo in ingegneria dei tessuti la maggior parte delle conoscenze si è focalizzata su stimoli biochimici; si è partiti dallo studio del terreno di coltura, per poi passare ai fattori di crescita e alle sostanze che influenzano le cellule. Questo ha permesso di introdurre moltissimi stimoli biologici per indirizzare il comportamento di tipi cellulari differenti.

Tra l’altro, molte conoscenze derivano da prove dimensionali e su un tipo di materiale specifico; molti esperimenti, ad esempio, sono stati eseguiti su polistirene o vetro. Da un certo momento in poi si è anche capito che gli stimoli devono essere contemporaneamente presenti; in particolare, si è iniziato da quelli meccanici (ed elettrici). Vengono fornite deformazioni al substrato per studiare come si modifica il comportamento (soprattutto per l’ambito vascolare). Le cellule, infatti, percepiscono le forze, le trasmettono ad altre cellule o trasducono segnali; le risposte sono estremamente ampie e sorprendenti. Per questo, accanto agli stimoli biochimici, sono stati sviluppati materiali e sistemi di coltura in grado di fornire stimoli meccanici ai costrutti e indirizzarne la maturazione. Questo risulta di particolare importanza per alcune specifiche tipologie di tessuti, come ad esempio i vasi sanguigni, in cui la struttura è fondamentale dal punto di vista funzionale. C’è un legame circolare tra struttura, funzione e stimolo assolutamente fondamentale. Per esempio, a seconda dei vasi sanguigni, cambiano le cellule presenti, aumentando o diminuendo lo strato muscolare. I vasi più distali, infatti, hanno meno muscolatura ed elasticità e non necessitano di vasi ausiliari.

Se lo stretching del substrato è stato uno dei primi fattori ad essere introdotti, con il tempo è anche diventato chiaro che le cellule sono influenzate anche da fattori come la geometria dell’ambiente extracellulare e la sua rigidezza. Questi segnali influenzano la cellula su diverse scale, determinando diverse tipologie di comportamento. Si devono considerare quindi il materiale e la sua compatibilità chimica ma anche la rigidezza e la morfologia superficiale. Un aspetto particolarmente importante quando si vogliono organizzare le cellule in una struttura organizzata riguarda la comprensione degli stimoli che spingono le cellule a migrare e organizzarsi. Gli stimoli possono sommarsi o sottrarsi per cui il quadro finale può essere diverso. Gli stimoli direzionali sono di natura diversa rispetto agli altri, agiscono direttamente e cooperano o competono nel regolare la migrazione cellulare: gli effetti si vedono immediatamente. Sono un primo passo verso l’obiettivo di indirizzare le cellule nel creare una struttura funzionale geometricamente e biologicamente.

Terminologia

• Aptotassi: migrazione cellulare in risposta ad un gradiente derivante da sostanza vincolate al substrato (non solubili come per la chemiotassi da cui si distingue) → le cellule sono adese ad un substrato, non disperse in un ambiente acquoso. Nell’immagine si vede una migrazione lenta per gradiente di fibrinonectina, una delle principali proteine usate per l’adesione cellulare. Viene marcata con sostanza fluorescente su dei punti per cui si osserva che la cellula si muove nella direzione della fibrinonectina.
• Contact guidance: disposizione cellulare in risposta alla topografia del substrato (forma della superficie). L’esempio più tipico è l’allineamento su materiali che presentano scanalature, creste, valli o fibre allineate. → l’immagine mostra un allineamento preferenziale di fibroblasti su substrati in PLA-TMC con scanalature. A seconda della distanza tra le scanalature si notano dei comportanti diversi, soprattutto relativi alla morfologia della cellula.
• Chemiotassi: migrazione cellulare in risposta ad un gradiente di concentrazione di fattori solubili. Può essere negativa o positiva se provoca rispettivamente repulsione o attrazione → le cellule sono sempre disperse in ambienti umidi per questo si parla di fattori solubili. La cellula si sposta, passando da un posto all’altro, per effetto di un gradiente.
• Meccanotassi: migrazione cellulare in risposta a stimoli meccanici (sforzo di taglio in flusso, deformazione uniassiale…) → riassume tutte le disposizioni cellulari in risposta a stimoli meccanici che possono essere di diverso tipo. Le cellule si danno sforzi l’una con l’altra ma a noi interessa principalmente l’interazione con il materiale che può essere:
  • Durotassi: dipende da gradienti di rigidezza del substrato. Le cellule sono in grado di effettuare una vera e propria esplorazione tattile della rigidezza del substrato, esercitando forze. Uno dei problemi principali nella ricerca è quello di isolare il contributo della rigidezza, un aspetto che non è affatto banale. È difficile avere lo stesso materiale, con la stessa composizione chimica ma con diversa rigidezza: è complicato cambiare la rigidezza del substrato, senza cambiare il substrato. Nelle immagini si considera il movimento di fibroblasti su un substrato con diverso gradiente di rigidezza (poliacrilamide). Nella parte sinistra si nota l’uso di molecole fluorescenti e già queste potrebbero influenzare il comportamento cellulare: questa ha rigidezza migliore. Nel caso A, la cellula viene messa nella parte soft ma si sposta all’interfaccia per gradiente: si nota un cambiamento di spreading, di adesione e di morfologia. Nel caso B, la cellula si sposta invece verso la zona del gradiente ma partendo dalla parte rigida e si allinea sulla riga di giunzione tra i due materiali.
  • Deformazione substratica: influenza della deformazione sul comportamento delle cellule. Nelle immagini si considerano cellule cardiache che vengono sottoposte a deformazione del substrato di silicone. Appena adese, l’orientamento è casuale ma quando si applica uno stimolo, le cellule si orientano nella direzione dello stretching che quindi è preferenziale. Le cellule si allineano comunque anche in assenza di deformazione ma in direzioni diverse e non decise da noi. È immediato guardare la morfologia, mentre è più complicato valutare il comportamento: i grafici mostrano i risultati del test ELISA di diversi fattori di crescita e ormoni e ci sono alcune differenze rilevanti. È poi ancora meno intuitivo capire come i cambiamenti di questi fattori vadano a influenzare il comportamento generale. Si vanno a guardare fattori specifici che caratterizzano il comportamento della cellula.
  • Filotassi: dipende dalla tensione intercellulare.
• Elettrotassi
• Galvanotassi: migrazione cellulare in risposta ad un gradiente di potenziale elettrico. Questa risposta appare molto importante nei processi rigenerativi: alcuni ricercatori nel wound healing sono stati in grado di misurare e verificare che la distruzione dei tessuti epiteliali genera una differenza di potenziale (misurata in mV/mm, quindi piccola ma rilevabile) che funge da gradiente di attrazione per i cheratinociti.

Di fatto, abbiamo sempre maggiore disponibilità di tecniche di micro e nano fabbricazione che consente di creare modelli sempre più raffinati. Quando si considera un materiale con rigidezza diversa, spesso si deve variare anche la composizione chimica: una soluzione che è stata adottata è stata invece quella di variare il momento di inerzia, variando il diametro. In questo modo la cellula esplora sempre lo stesso materiale ma con rigidezza diversa; la cellula migra nella direzione con maggior rigidezza. Spesso su substrati molto morbidi, le cellule non riescono ad aderire. Si possono usare anche stimoli per avere una localizzazione precisa delle cellule, come quelle mostrate a lato in pozzetti di agarosio. Sono molte le applicazioni in cui la posizione delle cellule è fondamentale, dato che può anche influenzarne il comportamento ed i segnali emessi che sono altamente specifici. Lo stimolo direzionale può anche essere usato per creare quindi co-culture organizzate. È fondamentale considerare stimoli multipli, complicando però sempre di più il problema. Per esempio, si possono studiare le combinazioni di tipografia e deformazione.

Tecniche di fabbricazione delle superfici

Per ottenere un pattern si deve appositamente fabbricare e caratterizzare le superfici. Per essere precisi, definiamo nanometrico quando abbiamo nel sistema di esperimenti almeno una misura inferiore a 100 nm (con una certa tolleranza ovviamente). Al nanometrico si può arrivare con due strade:

• Top down: riduzione progressiva delle dimensioni di oggetti massivi
• Bottom up: la nanostruttura è ottenuta tramite assemblaggio di atomi o molecole.

Tecniche

Litografia: è una tecnica di stampa piana che gioca con le proprietà di idro e oleo-repellenza. Si usa un particolare tipo di pietra che viene appositamente levigata; si dipinge il negativo sulla pietra con una matita idrofobica (grassa), passando dell’acqua, questa viene trattenuta nelle zone non disegnate.

Inizialmente il processo veniva chiamato "stampa chimica su pietra" e fu inventata a fine ‘700 dal tedesco Aloys Senefelder; la tecnica sfrutta le proprietà di un tipo di pietra delle cave di una cittadina nei pressi di Monaco di Baviera. Il particolare tipo di pietra, opportunamente levigata, viene disegnata con una matita idrofobica (grassa) e trattiene uno strato sottile di acqua nelle zone non segnate. Utilizzando inchiostri a base grassa è così possibile trasferire il disegno su carta.

Fotolitografia: è la tecnica di microfabbricazione per eccellenza. Può essere ottica o a UV. È stata la principale fautrice dei circuiti integrati per poi diffondersi ad altri settori (MEMs, Microfluidica, LABonCHIP..). Ne esistono diverse tipologie ma tutte hanno in comune una serie di elementi:

• Struttura che influenza solo alcune zone (maschera che riporta il pattern)
• Sorgente di energia per trasferire la maschera al materiale di interesse (appositamente scelto per favorire la coltura cellulare)
• Una sostanza o materiale che sia sensibile alla fonte di energia, per cui passando la luce attraverso la maschera rimane impresso il pattern.

Applicazione del resist: il foto-resist può essere deposto con lo spin coating, uno dei metodi più semplici e diffusi. Si sfrutta la forza centrifuga per depositare il materiale in uno strato sottile e uniforme su diversi substrati. Funziona meglio con i substrati tondi e presenta alcuni problemi agli angoli. Il fotoresist viene esposto alla luce attraverso la maschera che crea il pattern. Di solito si usa come substrato un wafer di Si.

Ci sono due tipi di resist:

• Quelli che diventano solubili quando colpiti dalla luce: positivi → le zone esposte diventano solubili per il passaggio successivo
• Quelli che reticolano e diventano insolubili quando colpiti dalla luce: negativi → le zone esposte diventano insolubili e si ottiene il negativo del pattern

Questo influenza innanzitutto il disegno da imprimere alla maschera e in generale tutto il processo. Il resist può proteggere zone che non si vogliono toccare o zone su cui si vuole che nulla si depositi.

Ci sono diverse tipologie di fotolitografia:

• La maschera è a contatto con il resist: ci sono delle contaminazioni (sebbene tutti i processi avvengano in camera bianca) il resist è a contatto con la maschera, il pattern è proiettato 1:1 (economico, minore risoluzione, possibile contaminazione, usura maschera)
• La maschera è in prossimità con il resist: previene le contaminazioni perché la maschera non si appoggia. Si creano delle zone in cui la luce può passare e quindi la risoluzione diminuisce il resist è quasi a contatto e il pattern è proiettato 1:1 - (economico, minore risoluzione, accuratezza limitata da diffrazione)
• L’immagine viene proiettata con una lente e focalizzata con un certo intervallo di risoluzione (che è maggiore) l’immagine della maschera è proiettata e ridotta 4:1-10:1. (risoluzione maggiore, attrezzature complesse e costose, problemi di diffrazione)

Dal punto di vista della tecnica, le cose si complicano: l’aggiunta di componenti, la modifica della risoluzione, l’allineamento rendono l’esperimento più complesso.

Fasi

1. Esposizione e sviluppo: il resist divenuto o rimasto solubile viene rimosso per immersione in una soluzione detta di “sviluppo” (es. NaOH). Il materiale non protetto dal resist viene rimosso ancora per immersione in una soluzione (wet-etching) o via plasma (dry-etching).
2. Rimozione del resist: il resist, non più necessario, viene rimosso dal substrato ancora nel bagno di solvente o ancora via plasma

Una tecnica semplice di fotolitografia prevede l’uso di una lampada UV e ha una minor risoluzione ma risulta di maggiore applicabilità, anche in ambienti non di laboratorio. Nelle immagini si vedono strutture vendibili che servono proprio a fare questo e comprendono una struttura di un polimero composito su cui vi è uno strato sottile di lame. Sopra a quest’ultimo c’è direttamente il fotoresist. Si deve sciogliere la parte solubile del resist che non serve in un’operazione chiamata sviluppo e che prevede l’esposizione delle parti non di interesse alla luce; il resist positivo rimane quindi solo sulla parte del disegno da ottenere. Per quest’operazione si usa di solito una soluzione basica. A questo punto, si deve scavare il materiale di interesse su cui avere il pattern e non protetto dal resist. Nella fase di etching quindi si rimuove tale materiale per immersione in una soluzione (wet etching) o con plasma (dry etching). In questa tecnica i tempi e i modi sono critici per avere buona accuratezza del disegno. L’ultimo passaggio consiste nella rimozione del fotoresist con una seconda fase di sviluppo: si espone il resist positivo per renderlo solubile e rimuoverlo ancora nel bagno di solvente o nel plasma. La maschera può essere ottenuta tramite stampa con i lucidi e in laboratorio lavoreremo per contatto.

In laboratorio faremo

1. Stampare un pattern sulla carta da lucido con la stampante laser
2. Appoggiare la maschera sul foto resist
3. Usare una lampada UV per esporre le zone non di interesse
4. Sciogliere il materiale che non ci interessa (bagno di cloruro ferrico).

Risoluzione

Anche in condizioni ideali, esiste una dimensione minima del dettaglio che può essere ottenuto. In prima approssimazione, in proiezione, il dettaglio minimo ottenibile è CD= k * lambda/NA (e.g. NA=sin(teta) e k=0,6; CD=Critical dimension; NA=numerical aperture)

In prima approssimazione, la dimensione critica è direttamente proporzionale alla lunghezza d’onda e inversamente proporzionale all’angolo di apertura. Quindi, nella litografia ad alta risoluzione, per aumentare la risoluzione si tende a diminuire la lunghezza d’onda. Alcuni esempi sono:

• Litografia deep UV: si modifica la sorgente luminosa che consiste in un laser ad eccimeri che consentono di utilizzare lunghezze d’onda ridotte. Nell’immagine si vede che la visualizzazione dei dettagli risulta essere molto migliorata rispetto alla tecnica tradizionale.
• Litografia EUV: le lunghezze d’onda sono ulteriormente ridotte (da 124 nm fino a 10 nm circa) cambiando ancora la sorgente di fotoni, che consiste in plasma nel vuoto. Su queste lunghezze d’onda, i laser non hanno le potenze necessarie e la sorgente di fotoni è un plasma in vuoto
• Litografia Extreme UV: le maschere devono essere prive di difetti e ottiche riflettenti e questo implica difficoltà di realizzazione.
• Litografia a raggi X: la sorgente utilizzata per l’esposizione è un fascio collimato di raggi X e la risoluzione sfrutta la bassa lunghezza d’onda degli stessi (circa 1 nm). C’è ancora la maschera ma non si usano più raggi UV, sostituiti da quelli X. Le maschere non sono lucidi stampati con il laser ma sono composte di solito da uno strato di metallo (oro, tantalio, tungsteno che hanno alto numero atomico- la trasparenza dei raggi X dipende proprio da questo) su un materiale trasparente ai raggi X o in uno strato sottile (C, Be, CSi…). Servono metalli pesanti per schermare i raggi X. Il resist, in genere in PMMA, viene depositato partendo dal monomero per spin coating sul substrato. Nelle immagini, si vede che la risoluzione è molto migliorata rispetto alle tecniche precedenti. La cosa interessante è il fatto che i raggi X penetrino a fondo, per cui è possibile usare anche strutture alte e profonde.
• Litografia a fascio di elettroni: la risoluzione viene ridotta fino al di sotto di 20 nm. È lo stesso principio...