Appunti completi esame di Laboratorio di metodologie molecolari e cellulari

Laboratorio di metodologie molecolari e cellulari

La cellula può essere considerata come un sistema sperimentale che permette di isolare, quantizzare e caratterizzare molecole, di studiarne il funzionamento, di comprendere i processi biologici. Ci permettono anche di manipolare i geni e di rendere disponibili applicazioni biotecnologiche di vario tipo.

Colture batteriche

Le cellule procariotiche contengono plasmidi. I tipi di colture cellulari possono essere:

• Colture di microrganismi come batteri (coli) o lieviti (cerevisiae)
• Colture di eucarioti superiori come colture primarie di cellule animali, colture di cellule o protoplasti vegetali e linee cellulari continue

Metodi di sterilizzazione

Per le colture batteriche è importante lavorare in condizioni di sterilità per evitare contaminazioni esterne e la contaminazione di chi lavora in laboratorio. Ci sono diverse metodiche di sterilizzazione:

• Sterilizzazione al calore
  • Calor rosso: su fiamma Bunsen, → attrezzi di metallo, attrezzi di vetro con alcool
  • Calore secco: 160,> 2 ore (stufa)→ vetreria
  • Calore umido: 121,>15 min (autoclave)→ soluzioni, mezzi di coltura
• Radiazioni: raggi UV, radiazioni ionizzanti, articoli monouso in plastica
• Filtrazione: filtri con pori di dimensioni variabili (0,2-0,45 micron), soluzioni labili al calore
• Agenti chimici: disinfettanti

Bisogna mantenere la sterilità dell’area e degli attrezzi di lavoro quindi bisogna effettuare:

• Disinfezione bancone di lavoro (sterilizzazione uccide tutto, disinfettare riduce la carica batterica organismi perché non possano nuocere)
• Sterilizzazione su fiamma Bunsen
• Flambatura contenitori su fiamma Bunsen
• Cappe a flusso laminare

Terreni di coltura

La coltivazione dei batteri in laboratorio richiede l’impiego di terreni di coltura con i quali si cerca di riprodurre artificialmente un ambiente in grado di soddisfare le esigenze metaboliche del batterio che si desidera coltivare. I terreni di coltura contengono tutte quelle sostanze organiche ed inorganiche necessarie per la crescita del microrganismo. La composizione chimica dei diversi terreni di coltura è in parte differente in relazione alle necessità nutrizionali del batterio che si desidera coltivare. I terreni che si usano in batteriologia devono contenere acqua, macronutrienti, micronutrienti e fattori di crescita.

Macronutrienti

Sono gli elementi necessari a tutti i microrganismi, in quantità notevoli; sono necessari per le biosintesi, entrano a far parte delle principali componenti strutturali della cellula (carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici), sono C, N, O, H, S e P.

Altri macronutrienti sono elementi usati in quantità relativamente elevate rispetto agli altri sali, la maggior parte di queste sostanze è necessaria a tutti i batteri, ma alcune sono fondamentali soltanto per alcune specie o in particolari momenti e sono:

• K: sempre necessario, attiva molti enzimi
• Mg: sempre necessario, cofattore di enzimi, stabilizza la membrana, ribosomi, acidi nucleici
• Fe: sempre necessario, costituente di citocromi e di enzimi
• Na: necessario per alcuni gruppi (es. marini)
• Ca: necessario per alcuni gruppi specialmente in alcuni momenti (stabilizza la parete, componente delle endospore)

Micronutrienti

Sono elementi necessari alla cellula, ma in quantità molto esigue. Generalmente le tracce contenute in sali o nell’acqua sono sufficienti a garantire la crescita del microrganismo, se tuttavia si usano sali e acqua particolarmente puri, questi elementi devono essere aggiunti ai terreni sotto forma di soluzioni bilanciate. Sono:

• Co: entra nella sintesi della vitamina B₁₂
• Zn: indispensabile per la funzione di metalloenzimi
• Mo: nelle nitrogenasi e in altri enzimi azoto-riduttori
• Cu: negli enzimi della respirazione
• Mn: attivazione di enzimi
• Ni: nelle idrogenasi

Tipi di terreni

In base alle sostanze che contengono e alle loro concentrazioni, i terreni di coltura sono classificati come sintetici e complessi. Nei terreni sintetici o definiti si conosce l’esatta composizione, sono preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali del microrganismo, contengono un numero definito di sostanze a concentrazione nota.

Nei terreni complessi non si conosce in maniera dettagliata la composizione chimica, permettono di far crescere contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali molto diverse fra loro, è possibile far crescere specie le cui esigenze nutrizionali non sono ancora ben conosciute. Possono contenere:

• Peptoni/triptoni: idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione proteolitica (la caseina è il substrato più utilizzato)
• Estratti di carne magra: ricchi in amminoacidi, peptidi, acidi organici, vitamine e sali minerali
• Estratti di lievito: ricchi di vitamina B e composti del carbonio e dell’azoto

Terreni di coltura qualitativi

I terreni possono essere classificati in maniera qualitativa come:

• Terreni elettivi: ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di pecora o cavallo, consentono la crescita di quasi tutte le specie batteriche
• Terreni selettivi: favoriscono la crescita solo di particolari specie batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di altre specie
• Terreni differenziali: grazie alla presenza di particolari componenti, permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo una identificazione presuntiva della specie isolata
• Terreni di arricchimento: consentono di aumentare la carica della specie batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori nutrienti addizionali che ne migliorano la crescita

I terreni di coltura possono essere liquidi (beuta o provetta) o solidi (piastra Petri o tubo con terreno a becco di clarino). Koch faceva crescere batteri sulle patate e poi sulle gelatine ma la gelatina si scioglieva al caldo, i coniugi Hesse suggerirono di aggiungere l'agar per solidificare il terreno.

L’agar è un polisaccaride estratto dalle alghe rosse, produce un gel rigido trasparente alla concentrazione dell’1-2% (p/v), si scioglie a 98°C ma resta liquefatto fino a 44-45°C. Permette di dare al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare. Non è metabolizzato dalla gran parte dei batteri, non manifesta alcuna tossicità e permette l’aggiunta di componenti sensibili al calore dopo sterilizzazione con autoclave (es. antibiotici, vitamine).

Fattori che influenzano la crescita batterica

La temperatura è un discriminante per la crescita di batteri, ci sono:

• Criofili (-10-20 °C)
• Psicrotrofi (0-30°C)
• Mesofili (10-50°C)
• Termofili (40-70°C)
• Ipertermofili (65-110°C)

Un altro fattore che influenza la crescita batterica è l’ossigeno, ci sono:

• Aerobi obbligati: crescono in presenza di ossigeno atmosferico → si dispongono dove il gradiente di O₂ è maggiore. Usano fosforilazione ossidativa.
• Anaerobi obbligati: crescono in assenza di ossigeno atmosferico → si dispongono dove il gradiente di O₂ è minore. Utilizzano un metabolismo fermentativo per generare ATP.
• Anaerobi facoltativi: vivono anche in assenza di ossigeno, ma la crescita è più rigogliosa in sua presenza → si dispongono principalmente dove il gradiente di O₂ è minore e anche nel resto (gli anaerobi aerotolleranti si dispongono indifferentemente), la loro crescita è più veloce in presenza di ossigeno.
• Microaerofili: possono moltiplicarsi in presenza di aria (20% di ossigeno), ma crescono meglio a concentrazioni inferiori (2-18%) → si dispongono a metà.

Per capire con quale tipo di organismi stiamo lavorando basta porli in un terreno di coltura nella provetta e verificare dove vanno a disporsi i batteri: se si dispongono nei pressi dell’interfaccia terreno/ossigeno saranno aerobi obbligati, viceversa se stanno sul fondo saranno anaerobi obbligati; nel mezzo saranno microaerofili; se disposti omogeneamente saranno anaerobi facoltativi. Abbiamo anche un’altra classe di organismi, che sono quelli aerotolleranti: infatti, se un organismo anaerobio ha enzimi come la perossidasi, allora può vivere in presenza di ossigeno; viceversa se non li ha vuol dire che non riesce ad eliminare i radicali liberi, e quindi non tollera l’ossigeno.

Anche il pH influenza la crescita batterica, ci sono acidofili, neutrofili e basofili.

Fasi della crescita batterica

La crescita dei batteri almeno nella prima fase è esponenziale, poi tende a stabilizzarsi in una fase stazionaria, poi c’è una fase esponenziale al contrario (declino logaritmico in cui le cellule muoiono). Le fasi della crescita batterica sono:

• Fase Lag: serve ai batteri per ambientarsi al loro ambiente, quindi non si ha crescita
• Fase esponenziale: in cui i batteri cominciano a crescere esponenzialmente
• Fase stazionaria: fase di plateau che avviene perché il terreno si consuma (densità di 10⁹ batteri per mm)
• Morte e decrescita logaritmica: che avviene se non si cambia il terreno, a causa dell’esaurimento totale delle risorse

Crescita in colonie

La crescita su terreno solido serve per permettere la crescita dei batteri in colonie, popolazioni di cellule batteriche che derivano tutte da una singola cellula vitale che cresce in un punto specifico del terreno solidificato (le cellule singole in grado di formarle sono anche dette CFU); si ottengono mediante tecniche di piastratura su terreno solido in piastra Petri; sono alla base dell’allestimento delle colture pure, perché poi le colonie possono essere ben localizzate e separate, per poi essere espanse in terreno liquido; permettono anche di misurare la crescita batterica. Ci sono tre metodi di piastratura:

• Piastratura in diluizione strisciata: si fanno degli strisci di cellule su terreno solido; con una pipetta si mette un po' di coltura cellulare su una Petri; si prende un’asta metallica sterilizzata su fiamma Bunsen, e dopo averla raffreddata, possiamo delicatamente strisciarla. In condizioni di elevata concentrazione, cresceranno uno striscio di colture batteriche l’una sull’altra, man mano diminuisce quando si striscia, sino a che alla fine non si ottiene la crescita di singole colonie separate fra loro, il che permette di isolarle (bisogna aspettare che crescano incubate capovolte in stufa a 37°C per almeno 16 ore)
• Piastre a versamento: inoculo la mia diluizione batterica in una Petri vuota, aggiungo agar sciolto e mischio → le colonie crescono dentro e sopra
• Piastre a spargimento: inoculo la diluizione batterica in terreno solido, spargo con un’ansa → le colonie crescono sulla superficie

Metodi di misurazione della crescita batterica

Ci sono metodi diretti come la conta su piastra, filtrazione, conta di provette multiple o numero più probabile (MPN) e conta diretta al microscopio. Nella conta su piastra faccio diluizioni seriali del campione, piastro, lascio in incubazione e conto le colonie → scelgo la diluizione con cui posso vedere e contare le colonie, generalmente 1:10 mila. Di solito si fanno 3 diluizioni per fare poi una media. Si fa la conta per mL: conta per mL = conta media per piastra / volume di coltura piastrato x il reciproco della diluizione.

Nella conta al microscopio in camera di conta si usa l’emocitometro, un vetrino da microscopio con una serie di righe che formano dei quadrati. Si copre con un vetrino coprioggetto, si applica una sospensione di cellule e si conta al microscopio il numero di cellule presenti all’interno di uno o più quadrati. Il conteggio ottimale si ottiene con una concentrazione di cellule di circa 10⁶/ml.

Ci sono metodi indiretti come la torbidità, assorbanza allo spettrofotometro e saggi di attività metabolica. L’assorbanza con lo spettrofotometro sfrutta la Legge di Lambert-Beer: si fa passare luce attraverso una sospensione batterica in una provetta, lo spettrofotometro va a misurare la luce trasmessa da quest’ultima; da questa si ricava l’assorbanza della coltura e se ne ricava la concentrazione.

Colture di cellule animali (e vegetali)

Si tratta di tecniche fondamentali per poter andare a studiare la funzione di diverse macromolecole biologiche, la reazione delle cellule ad una data molecola come per esempio un farmaco o una tossina o ancora molte altre funzioni che vedremo più avanti. Vengono utilizzate per studi funzionali di molecole e cellule biologiche, ci sono diversi approcci sperimentali:

• Studi in vitro: massimo controllo e massima semplificazione, danno risultati più riproducibili, abbiamo però grande distanza tra modello e organismo reale
• Studi di colture cellulari: mantengono una parte della complessità biologica dell’intero organismo (le cellule interagiscono tra loro come succede nei tessuti), offrono un grado di maggiore controllo e sono fondamentali per il principio delle 3R che serve per ridimensionare l’utilizzo di animali limitando al minimo la sperimentazione animale
• Studi in vivo in modelli animali: richiedono tempo, gli animali usati sono C. elegans, zebrafish e topi. Si ottengono dati più completi, ma si ha controllo minimo sull’assetto sperimentale, c’è grande variabilità tra individuo ed individuo

Si stanno sviluppando co-colture ovvero colture di più cellule in contemporanea, colture 3D dove avremo matrici di gel che mimano l’architettura di ciò che accade in vivo, sferoidi o organoidi che simulano dei piccoli organi come piccoli cervelli o cuori che assomigliano molto alla situazione in vivo.

Vantaggi delle colture cellulari

• Grande varietà di tipi di cellule a disposizione
• Semplicità e riproducibilità degli esperimenti, rapidità di risposta
• Controllo delle variabili ambientali (T, pH, etc.)
• Analisi di meccanismi cellulari e molecolari
• Disponibilità commerciale di terreni e fattori per la crescita
• Documentazione su isolamento/conservazione
• Possibilità di dimensionare gli esperimenti con finalità biotecnologiche: è possibile sviluppare delle cellule che siano in grado, per esempio, di generare una molecola di nostro interesse attraverso la modificazione di questa
• Riduzione nel numero di animali uccisi

Svantaggi delle colture cellulari

• Sistemi semplificati rispetto ad un organismo integrato
• Condizioni di esposizione alle sostanze diverse da quelle di un organismo in toto: la risposta a farmaci o altre sostanze sarà molto differente da quella ottenuta dall’organismo in toto, perché in questo caso si fa arrivare la molecola direttamente sulle cellule in esame, senza che questa sia rielaborata dall’organismo
• Difficoltà nel correlare le concentrazioni in vitro con quelle in vivo
• Rischio di interazione delle sostanze con il terreno di coltura
• Instabilità genetica durante i passaggi di coltura: è semplice che avvengano mutazioni cromosomiche anche per via del tipo di cellule utilizzate in coltura (es. HeLa che sono cellule tumorali con un ciclo cellulare molto breve)

Campi d’applicazione delle colture cellulari

• Studi funzionali nel campo della biologia cellulare
• Meccanismi di crescita, sviluppo, metabolismo e differenziamento cellulare
• Produzione di cellule staminali
• Estrazione di acidi nucleici, purificazione di proteine
• Analisi dell'effetto di mutazioni genetiche
• Regolazione dell’espressione genica
• Funzionamento di proteine e geni
• Analisi citogenetiche (diagnosi pre- e post-natale)
• Caratterizzazione biochimica e molecolare dei tumori
• Studi farmacologici sull'efficacia o la tossicità di farmaci
• Ingegneria genetica e tissutale per la produzione di tessuti in vitro
• Terapia genica
• Produzione di proteine ricombinanti, anticorpi monoclonali, vaccini

Tipi di colture

Una coltura animale nasce sempre come coltura primaria. Nelle colture primarie le cellule derivano direttamente dal tessuto d’origine, mantengono molte delle caratteristiche funzionali e di differenziamento che hanno in vivo. La composizione cellulare è molto eterogenea. Si può effettuare una selezione di alcune componenti cellulari nel tempo in base al grado di proliferazione (es. arricchimento in fibroblasti). Hanno una vita finita (sopravvivono un numero limitato di cicli cellulari e poi vanno in senescenza), sono suscettibili all’inibizione da contatto, sono generalmente dipendenti da ancoraggio. Per ottenere una coltura primaria prelevo delle cellule da un campione (organo, tessuto, embrione, uova), effettuo una dissezione meccanica, tratto con tripsina (o un altro enzima) per eliminare i contatti tra le cellule, aggiungo inibitori per bloccare la digestione enzimatica, controllo la vitalità cellulare e semino in piastra su terreno solido o in sospensione.

Le colture secondarie e linee cellulari derivano dalle colture primarie per sub-coltura, consentono la selezione di determinati tipi cellulari. La composizione cellulare è più omogenea, hanno un tempo di vita finito. Mantengono un fenotipo differenziato, mostrano inibizione da contatto, sono generalmente dipendenti da ancoraggio.

Le colture clonali sono colture derivanti da una singola cellula, hanno una popolazione cellulare omogenea.

Le colture continue derivano da colture primarie o secondarie, possono diventare linee cellulari immortalizzate per trasformazione spontanea (mutazioni genetiche spontanee), trasformazione indotta (ad es. mediante trasduzione di un virus) o sono ottenute da espianti di tumori. Possono essere propagate indefinitamente (tempo di vita infinito), hanno una composizione cellulare omogenea, crescita più veloce e perdita di inibizione da contatto e dipendenza da ancoraggio. Sono geneticamente instabili, presenza di aneuploidie, hanno fenotipo indifferenziato.

Quindi in generale si effettua una resezione del tessuto, si allestisce una coltura in vitro (coltura primaria) dalla quale si ottiene una sub coltura per fare una coltura secondaria dalla quale si fa una sub coltura per fare una linea cellulare e da qui:

• Isolamento singola cellula → linea cellulare clonale
• Trasformazione spontanea o indotta con perdita del controllo della crescita cellulare → linea cellulare immortalizzata