Appunti completi di Microbiologia e microbiologia clinica biotech, II anno

MICROBIOLOGIA GENERALE

MICROBIOLOGIA

Microbiologia = studio di microorganismi (organismi troll piccoli per essere visti a occhio nudo)

(tassonomia microbica, biochimica dei microorganismi, genetica batterica)

Microbiologia ambientale

✓ Micro medica

✓ Micro agraria

✓ Micro industriale

✓ Micro alimentare

✓ Micro veterinaria

✓

Si occupa di

- Batteri

- Archebatteri (Archea)

- Eucarioti microscopici (funghi o protozoi)

- Virus = Microorganismi che non hanno organizzazione cellulare sono parassiti intracellulari

obbligati e che tecnicamente sono considerati “non vivi” (mancano di organizzazione cellulare)

= Dotati di un solo tipo di acido nucleico (DNA o RNA) + proteine

- Viroidi = parassiti obbligati, formati da RNA nudo

- Prioni = proteine infettive

Storia

• 1590-95 primo microscopio da Hans + Zacharias Janssen

• Robert Hooke primo microscopio a due lenti

- Risoluzione permetteva di distinguerne funghi filamentosi ma

non i batteri

• Antoni van Leeuwenhoek (Leuuenuk) commerciante di tessuti olandese con psssione per lenti

di ingrandimento => primo a osservare e descrivere protozoi, lieviti, batteri

- Suo microscopio molto piccolo e bisognava “fuochettare” di continuo

- Chiama “animalicules” gli esseri che osserva

- Sue ricerche portano un intero mondo invisibile a consapevolezza degli scienziati dell’epoca

- Innescano dibattito su loro origine che dura 2 secoli (teoria della generazione spontanea)

Medio Evo, rinascimento e parte ‘600

Teoria generazione spontanea (abiotica)

Aristotele

▪ Scritto trattato con osservazioni su molti animali, descrivendo con accuratezza ciclo vitale ma

▪ impossibilità di distinguere l’eccessivamente piccolo o difficoltà di riconoscere come tali stadi

di sviluppo molto diversi gli fecero concludere che le rane si originano dal fango

Questa teoria ebbe largo seguito e molti scienziati offrivano ricette per “creare”

▪ Dimostra con esperimento assurdità secondo il quale mosche si originano da carne in

▪ decomposizione: copre con garza uno dei vasi, dimostrando che “banchi” nascevano solo

dove potevano arrivare le mosche

• 1765 Spallanzani prepara due serie di vasi contenenti brodo, lasciandone una aperta all’aria e

sigillata l’altra e facendo poi bollire brodo al suo interno per uccidere tutte forme vita => sono il

brodo nel recipiente sigillato rimane sterile

• 1774 Joseph Priestly dimostra che O2 è necessario a vita => sostenitori teoria abiotica

obiettano che nelle fiasche sigillate il calore doveva aver alterato ossigeno nel brodo impedendo

sviluppo spontaneo dei microorganismi

• 1800 Pasteur mette fine a diatriba dimostrano che microorganismi che crescono

provengono da esterno, trasportati da aria

Bisognava far passare aria senza alterarne qualità, ma impedendo

accesso ai microorganismi => Pasteur usa fiasche con imboccatura a collo

di cigno

Forza di gravità e lungo tratto in salita avrebbero protetto interno della

fiasca, l’aria sarebbe restata inalterata

1. Terreni non sterile versato nella fiasca

2. Colo viene modellato con fuoco

3. Terreno viene sterilizzato con calore

4. Aria forzata fuori da estremità aperta (aria poteva entrare la polvere no)

5. Polvere e microorganismi intrappolati nella piega, liquidò si raffredda

6. Liquidò resta sferiche anche per molti anni

Dimostra che crescita era dovuta a contaminazione esterna => conferma fu data da

crescita che avvenne non appena brodo fu posto a contatto con polvere

7. Fiasca inclinata e liquidò entra in contatto con polvere

8. Microorganismi crescono

• Crollo definitivo teoria abiotica e nascita microbiologia moderna

• 1840 J Henle ipotizza esistenza di microorganismi non visualizzabili al M.O.

• 1879 A. Mayer => trasmissione sperimentale virus del mosaico del tabacco (malattia

trasmissibile senza evidenza di batteri o funghi patogeni)

• 1892 Ivanowsky dimostra trasmissibilità dopo filtrazione

• 1898 Bejerink scopre Contagium vivum fluidum, agente infettivo (virus del mosaico del

tabacco) replica solo in tessuti della pianta

- Virus infetta solo determinate specie

• Loeffler e Frosch identificano il foot and mouth disease nei bovini

• 1901 W. Reed identifica il primo virus umano, virus della febbre gialla

• Anni ’30 Primi microscopi elettronici

• 19340-1950 esplosione capacità fare colture in vitro

VIROLOGIA GENERALE

Virus = organismi acellulati che hanno genoma costituito da acidi nucleici e sono parassiti

obbligati, cioè sono obbligati a replicarsi in cellule ospiti utilizzano apparati metabolici degli

ospiti, per formare un pool di componenti, i quali si assemblano a formare virioni = acido nucleico

/ genoma protetto da guscio / capside (formato da proteine la cui seq è contenuta nel genoma del

virus)

- Oggi sdoganato il fatto che non siano considerati organismi, perché sono il grado di replicarsi

- Portato all’estremo concetto di parassita considerandolo organismo

- Genomi dei virus mediante ospite devono essere riportati a essere proteine (grazie all’ospite)

- Genoma potrebbe codificare per un singolo gene, quello della proteina del capside

- I virus viaggiano a masse di virioni

• Ordine di grandezza dei nm => 10/15-200/300 nm

• Si muovono attraverso spostamenti passivi => spostamento aria

• Un virus che non entra cella cellula è completamente innocuo

• Obiettivo virus nell’organismo è sopravvivere

• Coltivazione: Non possono crescere su supporto sterile, ma richiedono la presenza di

- Cell ospiti

- Uovo embrionario (fecondato) incubatore perfetto per virus perché cell embrionali perfette

perche

Replicano velocemente

▪ Forza metabolica accelerata che facilita quindi anche replicazione virus => ottengo

▪ progenie virali in coltura

• Virus si differenziano da una cellula per 3 aspetti:

a. Virus di solito ha un singolo tipo di acido nucleico come materiale generico, e può essere

DNA o RNA singolo o doppio filamento

b. Virus non contenenti i enzimi o metabolismo energetico, perciò non possono produrre ATP

c. Virus non codificano sufficienti enzimi per sintetizzare macromolecole componenti,

specificamente, non hanno il “macchinario” per la sintesi proteica

Classificazione virus

• Applicare strumenti tradizionali della biologia alla virologia complicato perché virus talmente

semplici e unici che classificarli con classificazione classica (Linneo, con ordine, geneee e

specie…) è complicato

Nomenclatura Basata sui dati disponibili al momento della scoperta

a. Malattia a cui sono associati Poxvirus, Hepatitis virus, HIV, measles virus

b. Effetto Citopatico

= spesso quando virus infetta le cellule fa cambiare loro morfologia Respiratory Syncytial virus

(genera macrocellula plurinucleata che è un sincizio, comodo per il virus per passsre tra le

cell); Cytomegalovirus

c. Sito di isolamento Adenovirus, Enterovirus, Rhinivirus

d. Luogo della scoperta o persone che l’hanno scoperto Epstein-Barr virus, Rift Valley Fever

e. caratteristiche biochimiche Retrovirus, Picornavirus, Hepadnavirus

• 2001 si è deciso di dare un ordine

Processo di tassonomia dei virus

• utilizza sia nomenclatura gerarchica che tassonomia tradizionale, identifica specie e le raggruppa

classificazione tradizionale (nome ufficiale)

a) regno

b) phylum

c) classe

d) ordini (Virales)

e) famiglie (viridae)

f) sottofamiglie (virinae)

g) genere (virus)

h) specie

adesso classificazione basata principalmente su analisi particelle, classificazione specifica per i virus

in base a:

a) morfologia della particella virale

- mediante microscopia elettronica

b) somiglianza sierologica

= spesso ci sono proteine uguali o molto simili all’interno di due virus differenti

- relativo al riconoscimento da anticorpi, spesso la proteina viene riconosciuta, anche se

struttura non identica ma simile, anche su un altro virus (cross-reattività)

- antigenic cross-activity

Sars-Cov, da cui derivano tutti i ceppi che hanno leggermente diversa la proteina spike, che

però è la medesima e perciò derivano tutti dal precedente (evoluzione da virus precursore)

c) materiale genetico associato

= forma dell’acido nucleico

ssDNA (+ o – strand)

o dsDNA

o ssRNA (+ o – strand)

o dsRNA

o segmented RNA

o

d) omologia di sequenza

- sequenza DNA

- ibridazione

• è una classificazione deliberatamente sistematica che si basa su uso soggettivo dei dati

(normalmente non consentivo a scopo scientifico)

• ci sono comunque punti fermi

- virus che hanno genoma di tipo uguale sono più vicini funzionalmente rispetto a virus che ha

altro tipo di genoma (perché entrambi devono comunque produrre mRNA e perciò avranno

meccanismi d’azione diverso)

Classificazione di Baltimore

= per classificare i virus in base alla loro funzione, la quale dipende dal genoma; perciò, classificate

in base al genoma

• dal signor Baltimore

• per dare ordine ai virus funzionalmente in base all’acido nucleico

polarità dell’elica (5’ o 3’) = in base a come sono messe le basi

- mRNA è singolo filamento a polarità positiva

• 7 classi:

I. DNA a doppia elica (dsDNA)

II. DNA a singola elica (ssDNA)

- Non molto stabile

- Porta con sé tuti svantaggi del DNA che dell’RNA

- Virus piccoli

- Molto diffusi in natura ma non negli organismi superiori

III. RNA a doppia elica (dsRNA)

IV. RNA a singolo filamento a polarità positiva (+ssRNA)

a) -ssRNA —> +mRNA

b) Altri si presentano già come messaggeri

- Coronavirus, Rhinovirus, Flavivirus …

V. RNA a singolo filamento a polarità negativa (-ssRNA)

VI. Virus che utilizzano la retrotrascrittasi con genoma a RNA a polarità negativa

VII. Virus che utilizzano retrotrascrittasi con genoma a DNA a doppia elica

• Da tutti può essere prodotto +mRNA con diversi meccanismi

• Da qui dipende funzione del virus

• Obiettivo comune e produrre la proteina

• Genoma a DNA ha vantaggi e svantaggi

Molto più stabile (perché se RNA fosse stabile avremmo cell impazzite e essi devono servire

✓ allo scopo ed essere degradato; inoltre ci sono molte più RNasi)

- Alcuni si sono evoluti a RNA perché finché è nel capside non viene a contatto con mondo

interno ed è strutturato in modo in cui all’interno della particella virale l’RNA è stabile come

DNA

- Esistono meccanismi di difesa nelle cell ospiti contro DNA ma non RNA

Non tutti i virus infettano gli organismi superiori, ma di solito fanno parte di tutte le classi

▪

Classificazione completa dei virus

Classificazioni binarie che raccolgono tutte le informazioni

▪ a) Genoma a RNA o DNA

b) Simmetria del capside

- Virus hanno trovato 2 modi vincenti per superare problematica volumetrica => cioè contenere

genoma che è più grosso delle proteine

- Aa molto più piccoli delle basi azotate

- Ogni 3 basi un aa

- Unico modo per fare guscio che contenga il genoma => fare più come dello stesso

messaggero creando quindi un capside formato da più subunità uguali (formate da più copie

della stessa proteina) => per creare un guscio stabile lo devo organizzare simmetricamente

(più tipi di proteine uso più e difficile creare qualcosa di stabile)

Elicoidale

o Icosaedrico

o

c) Nudo o envelope (vestito)

- Comportamento nel mondo esterno totalmente differente tra virus vestiti e nudi

d) Architettura del genoma (vedi sopra)

e) Classe di Baltimora

Struttura dei virus

virione = particella fisica del virus infettiva composta dall’acido nucleico + capside proteico +

➢ envelope e può essere extracellulare o intracellulare

core = acido nucleico strettamente associato a proteine del virione

➢ capside / coat = guscio proteico che circonda NA o core formato da capsomeri con molti domini

➢ funzionali (numero può variare)

funzioni

▪ protegge genoma

✓ interagisce specificamente con acido nucleico virale per impacchettamento (interazione tra

✓ cariche…) => capacità cariofilica

interagisce con vettore per trasmissione specifica

✓ interagisce con recettori ospite per emettere nelle cellule

✓ permette rilascio di acido nucleico quando entra in nuove cellule

✓ interviene in processo della regolazione genica virale o della cell ospite

✓ mantenuto legato da leg non covalenti e reversibili (idrofobico, salino, Van der Waals,H…)

▪

capsomero = subunità proteiche identiche che formano capside che presentano più domini

➢ funzionali che multimerizzano in modo appropriato

proteine capsidiche sono ripiegate compattamente (folding) => autoassemblaggio,

▪ disassemblaggio (non momento giusto deve essere in grado di disgregarsi)

- decine di KDa

- folding sono in modo e robusto

- diversa grandezza (tutte medio piccole per evitare instabilità) 50-350 aa

- domini identificabili

- possono essere descritte tipograficamente, simili caratteristiche topografiche non implicano

relazioni evoluzionarie

proteina capsidica è la più conservata dei virus e la più multifunzionale

▪

- deriva genetica funziona bene se c’è vantaggio selettivo

- vantaggio selettivo funziona bene se quella proteina ha una singola funzione

- perciò se proteina muta e quindi cambia per una funzione, difficilmente non andrà a impattare

sulle altre funzioni => per questo essa fa molta fatica a mutare (sottoposta allo stretto

constraint funzionale) e perciò evoluzione di questa proteina sarà molto lenta

hanno capacità di farsi riconoscere dalle cell che vogliono infettare => proteina su virus si lega

▪ stabilmente e mantiene in posizione giusta quella zona funzionale che permette di entrare

nella cell (tropismo)

nucleocapside = core + capside

➢ envelope = membrana lipidica che si trova in alcuni virus, spesso derivati da cellule infettate

➢ peplomero (spike) = unità morfologica protetta da envelope o superficie nude del virione

➢

Simmetria Capside

Elicoidale

= posso avere diverse proteine capsidiche altrimenti non si avvolgerebbe

passo cambia a seconda delle proteine

▪ posso avere capside importanti

▪ stabilizzano meglio acido nucleico

✓ virus del mosaico del tabacco

Rhabdovirus particle

Eicosaedrico / cubico

= una sola proteina capsidica; formato da 20 triangoli equilateri che formano la struttura simmetrica

potrebbe apparire sferico

▪ identici capsomeri

▪ tomato bushy shunt virus

- Ogni particella contiene singola molecola d i RNA (4800 nt)

e 1i0 copie di subunità di proteine di rivestimento (387 aa,

41 kDa)

Envelope / involucro / pericapside

= strato liscio (fodera) di consistenza biochimica simile alle membrane cellulari formato da un doppio

strato fosfolipidi o mai interrotto che viene pesantemente adattato alle necessità del virus

ma le membrane hanno modello a mosaico fluido e invece envelope non si interrompe mai ed è

▪ stabile

li rende virus vincenti in determinati contesti

▪ molto comuni negli animali superiori e meno a livello ambientali dove può creare problemi

▪ si forma in seguito a infezione di una cellula prima di uscire, alla fine del ciclo replicativo => non

▪ portano via un pezzo a caso ma durante ciclo replicativo si premunirà di scegliere alcune

zone della membrana, di montare in quel pezzo proteine virus-specifiche (che codifica lui)

e alla fine porta via il pezzo di membrana modificata dal virus e quindi all’esterno avrà

sempre le proprie proteine per scegliere le nuove cellule da infettare (recettori virali) (deve

entrare solo nelle cell giuste che gli permettono di replicarsi)

proteina matrice = matrice proteica solida che si inserisce tra capside e envelope che aggancia

▪ in modo ripetuto e consistenze da una parte il capside e dall’altra le proteine virali del pericapside

viene quindi appicciato sulla proteina della matrice non così stabile ma molto più stabile di una

▪ membrana cellulare e che quindi la stabilizza

è il 30% peso totale del virione

▪ virus con envelope sarà più delicato nell’ambiente esterno di uno senza envelope

▪ se envelope distrutto, virus diventa non infettivo

▪ Herpesvirus

Ciclo di vita dei virus

1) fase precoce

1. ATTACCAMENTO (ABSORPTION)

= attaccamento del virione sulla superficie della cellula; consiste in un attaccamento

specifico delle proteine di attaccamento virale a recettori sulla superficie cellulare che sono

i maggiori determinanti del tropismo virale

recettori cellulari e virali

recettori cellulari legano direttamente i virioni maturi

▪ co-recettori legato virioni maturi o loro forme alterate

▪ recettori cellulari possono essere proteine di membrana con funzione conskcijfa o

▪ sconosciuta, carboidrati o recettori per Ig

per essere in grado di pene rare, a volte i virus innescano una cascata recettoriale

▪

carboidrati recettori virali

Poliovirus => c’è una profonda apertura (“canyon”) sulla superficie di ciascun vertice

ripiegato 5 volte del capside dove avviene interazione tra Pvr e particelle virali

Recettori virali

recettori carboidrati dis olito meno specifici perché la stessa configurazione delle catene

▪ laterali potrebbe esserci in molecole su diverse membrane

molti virus complessi (poxvirus, herpesvirus) usando più di un tipo di recettore e inoltre

▪ hanno vie alternative

2. PENETRAZIONE

= entrata dell’ultima porzione della particella (incluso il genoma) nel citoplasma della

cellula ospite

per alcuni virus e necessario rompere la membrana della cellula per entrare => pe