Appunti completi di Biochimica clinica e biologia molecolare clinica

Intro, laboratori e ciclo analitico

Esame

• Corso formato da 2 moduli: biochimica clinica (3 CFU), + Esercitazioni bioch clinica (3 CFU)
• Esame: test 20 domande a risposta multipla + 11 a risposta aperta univoca (a volte risposta è una sola parola, o sì o no…)
• Tutte risposte giuste 30L, 1 sbagliata 30, 2 sbagliate 29…
• Voto finale media dei due moduli

Biochimica clinica = applico conoscenze biochimica e bio molecolare per gestione paziente. Branca di medicina di lab che si occupa come studiare con metodi chimici / biochimici la composizione dei fluidi corporei (sangue, urina, liquido cefalorachidiano, pleurico, sinoviale…)

Altri ambiti di medicina di lab

Tutti collaborano.

• Genetica media
• Anatomia patologica (focus sui pezzi anatomici. Differenza nei marcatori che non sono gli stessi, qui interessa il plesso anatomico con biopsia del pezzo di tessuto)
• Microbiologia

Applica tutte metodologie scientifiche.

• Tutte le discipline mediche hanno i loro marcatori di lab
• Ultimi decenni crescita sia in senso quantitativo (n. di marcatori) che qualitativo: non importante solo avere tanti marcatori, ma averli di qualità e ciò che analisi messe a disposizioni siano affidabili, che consentono di prendere decisioni in base a risultati

In lab si fanno sempre analisi 3 volte per analisi più attendibili. Qualità dato ci consente di avere numero estremamente affidabile. Ex valore Hb critico minimo è 6 e dal risultato dipendono comportamenti rivolti al paziente.

Se marcatore non raggiunge soglia sufficiente affidabilità non viene messo a disposizione ma rimane un marcatore di ricerca.

Lab analisi in tutti ospedali => servizio che fornisce risposta a richiesta di:

• Dati e info utili per diagnosi, terapia, monitoraggio, promozione salute per intercettare prima possibile anomalie e migliorare qualità di vita (obiettivo diventare anziani stando bene)
• Da risultati corretti minimizzando errori
• Risposta in tempi utili per garantire gestione appropriata del paziente => esigenze diverse (pazienti urgenti o persona in buona salute che può avere anche un risultato in 10-15gg)
• Importante modo in cui forniti i risultati: devono essere in una forma possibilmente concordata che permetta corretta interpretazione
• Efficienza e sostenibilità economica: bisogna cercare di far convivere efficienza e affidabilità dato e spese economiche (noi sistema sanitario nazionale invidiato in tutto il mondo, a olimpiadi Milano Cortina 2026 persone stupite perché non ci sono spese)

Laboratori

Struttura precisa con:

• Requisiti adatti ai compiti assegnati
• Personale adatto
• Impianto adeguato

Per mantenere livello qualitativo si ha percorso di certificazione della qualità: bisogna affidare a un ente terzo certificatore di qualità che certifica vari aspetti:

• Pannello di prestazioni
• Ricerca e innovazione
• Pannello di controlli di qualità
• Pannello di comunicazione con esterno
• Archiviazione dati
• Valutazione costi e efficienza

Tipologie di laboratori

Distinti dal punto di vista delle peculiarità.

A) Laboratori di reparto (point of care) = piccoli laboratori che portano la parte analitica vicino al letto del paziente; importanti perché gestiscono esami che servono a pazienti con esami interni al reparto => dedicati ai pazienti gravi, scopo è quello di andare incontro a pazienti così gravi da non poter aspettare il test del laboratorio generale.

• Test semi quantitativi semplici
• Apparecchiature dedicate
• Usate dal personale medico ma non laboratoriale
• Oggi finiti sotto la responsabilità del lab generale che controlla risultati
• Sprovvisti spesso di servizi di supporto

B) Laboratorio generale = lab in cui si fanno gli esami di base, lab con grandi numeri (emocromo 1000 al giorno negli Spedali Civili di Brescia, Na, K…)

• Ben strutturato
• Apparecchiature idonee
• Personale: biologo, biotecnologie, medico, tecnico di lab biomedico
• Spinta l’automazione, mezzi che smaltiscono grande carico di lavoro

C) Laboratorio specialistico = focalizzati su branche specifiche (biotecnologiche, immunologia)

• No automatizzazione, campioni sono meno e il lavoro è molto più manuale

Laboratorio ultraspecialistico = per lo studio di malattie rare o analisi complesse.

• La regione consente affidabilità risultati in tutte le sedi laboratoriali
• Dato di lab pesa fino a 70% del processo decisionale clinico a fronte spesa di circa 4-5% del sistema sanitario nazionale (pesano poco perciò investire nella medicina di lab per sistema sanitario nazionale è proficuo)
• Sistemi che consentono comunicazione e indirizzamento dal punto di vista anche visivo e comprensione degli esami da fare

Codice colore delle provette per analisi del sangue

Associa colore a analisi da fare ed eventualmente contiene già additivo che permette analisi.

• Viola
• Verde
• Azzurro
• Rosso
• Nero

Flusso dell’attività in laboratorio

Una delle cose importanti è il tempo di risposta.

• Alla richiesta dell’esame si apre una sorta di contratto tra chi richiede e il laboratorio: flusso operativo è molto importante perché determina il rispetto del patto contrattuale
• TAT (Turn Around Time) = tempo tra accettazione fino alla refertazione e devono essere indicati nel contratto e rispettati dal lab

1. Accettazione (parte TAT)
2. Verifica campione
3. Centrifugazione
4. Suddivisione e caricamento
5. Analisi
6. Validazione
7. Eventuale ripetizione: possibile ingresso di errori casuali nel processo analisi tipo => quando c’è dato anomalo bisogna contemplare fatto che ci sia errore casuale, perciò, necessaria ripetizione (anche in caso di pazienti urgenti)
8. Referto, firma e restituzione dato

Automazione

• Forte spinta dove ci sono i numeri a automatizzare
• Vantaggi e svantaggi
• Velocità
• Possibilità aumentare volume di lavoro
• Riduzione errore umano
• Affidabilità dipende dal sistema di assicurazione della qualità che viene messa in atto

In base all’automazione lab divisi in categorie:

A) Lab di bassa automazione = lab di tipo specialistico, nella parte analitica fatti dal personale tutti i passaggi, analisi fatta e anche parte post analitica può essere divisa in fasi = tutto fatto dal personale.

• Tutto molto controllato
• Rischio errore dell’operatore
• Tempi lunghi
• Potenzialmente pericolosa per prolungato contatto con campioni potenzialmente infetti

B) Lab di media automazione = lab centrale, tutta la parte pre-analitica e analitica è automatizzata. Dopo l’analisi richiede una valutazione post-analitica dal personale.

• Tempi lunghi
• Potenzialmente pericolosa per prolungato contatto con campioni potenzialmente infetti

C) Alta automazione = tutto è automatizzato fino al referto, soprattutto quando i dati sono nella norma, c’è un algoritmo di assicurazione sugli strumenti che manda direttamente i dati ai reparti.

Principali finalità per la richiesta di indagini di lab sono:

• Finalità di screening
• Finalità diagnostiche = confermare / escludere sospetto diagnostico

Dati

Ogni dato soggetto a variabilità => dev’essere tenuta sotto controllo e studiata.

• Variabilità biologica => se tutti in buona salute facessero il dosaggio di un marcatore, avremo risultati diversi perciò difficile trovare il valore correlato alla patologia, serve capire se il dato è patologico o entra nella variabilità biologica; riguarda tutti
• Intra individuale = che riguarda evoluzione dell’individuo (valori nei bambini diversi dai valori degli adulti) e dipende anche dallo stile di vita che influisce sui valori, insieme all’ambiente
• Inter individuale = età, sesso, stato di salute, etnia, assetto genetico
• Variabilità della misura
• Preanalitica = ciò che succede a campione prima che arrivi in lab, particolarmente pericolosa per noi perché non dipende dal lab
• Analitico = dipende dalla professionalità del personale e capacità di usare strumenti

Ciclo analitico

Compito del lab è:

• Tenere sotto controllo variabilità analitica => ciclo analitico blindato per gestirla

1) Fase preanalitica

Entra tutta la variabilità pre-analitica, reagenti e strumenti usati precedentemente, modifica campione prima dell’analisi o al paziente.

• Maggior parte variabilità entra in questa fase
• Per laboratoristi più pericoloso perché non è sotto il nostro controllo
• Importante anche informare gli altri e sensibilizzare tutti quelli che sono coinvolti nella filiera dell’importanza di questa fase
• Se dato perfetto dal punto di vista analitico ma il campione non è più rappresentativo del paziente, è un pericolo
• Ogni fase ha degli accorgimenti per ridurre la variabilità:

1. Preparazione del paziente: variabilità si riduce quando paziente dev’essere ben informato e motivato e deve seguire le istruzioni prima di fare un percorso analitico (analisi a digiuno…)
2. Prelievo del materiale: può entrare grande variabilità
3. Importante la raccolta, dispositivi usati e iter che fa materiale prima di essere raccolto
4. Trasporto o spedizione: invio del materiale al lab dev’essere adeguato per ridurre variabilità
5. In alcuni casi importante che campione venga separato nelle sue fasi (siero, plasma) che devono essere analizzate separatamente
6. Conservazione del campione; che deve mantenersi per rimanere rappresentativo del paziente

Prelievo di sangue

• Prelievo venoso
• Prelievo arterioso: per vedere se il paziente respira
• Puntura cutanea / prelievo capillare: con il pungidito e si analizza un particolare dato dalla goccia di sangue; ora in farmacia si possono fare alcuni esami di autocontrollo per controlli fatti direttamente dal paziente; si fa nei neonati appena nati per rilevare eventuali malattie metaboliche

Causa frequente di variabilità pre-analitica.

• Importante calibro dell’ago (ago troppo piccolo e eccessiva depressione della siringa, le cellule si rompono e si verifica emolisi e campione si altera, 3-4% campioni che arrivano il lab sono emolizzati e se rilasciano nel campione il contenuto, i valori sono alterati come P, K, enzimi come AST, CK, LDH) e sito del prelievo (di solito parte interna dell’avambraccio, antecubitale e cefalica; e tecnica di prelievo)
• Errori frequenti: lasciare troppo il laccio emostatico (sangue ristagna, si ha concentrazione di metaboliti, gonfia la vena ma si altera anche il campione) si lascia 2-3 min e quando inserito l’ago si toglie; far bene stringere il pugno, ma se troppo diventa uno sforzo di tipo anaerobico, si forma acido lattico e si abbassa pH
• Secondo il documento CLSI GP41-ED.7;2017, c’è una sequenza di riempimento delle provette (ogni provetta contiene un additivo e la sequenza è stata fatta in modo tale da ridurre le contaminazioni)

1. Emocoltura (per primo perché serve per rilevare patogeni e campione dev’essere il più sterile possibile)
2. Coagulazione (sodio citrato verde 4,3 ml)
3. Neutra (bianca 4,5 ml)
4. Siero (con attivatore della coagulazione bianca 4,5, 4,9, 7,5 ml)
5. Siero + gel (con attivatore della coagulazione ocra 7,5 ml)
6. Plasma chimica clinica
7. Ematologia
8. EDTA + gel
9. Omocisteina
10. Glucosio e acido lattico

Sempre per ridurre la variabilità, c’è una sequenza abbastanza classica per contenere questo tipo di variabilità per l’esecuzione del prelievo:

• Standardizzazione dell’ora del prelievo (07:00-09:00) per i metaboliti senza ritmo circadiano o definizione di un’ora correlata al ritmo per quelli che dimostrano
• Dopo accettazione, paziente a riposo o seduto o supino ad aspettare che lo chiamino; passano almeno 15-20 minuti, per aspettare che il paziente sia in uno stato di riposo
• Paziente dev’essere a digiuno dalla sera precedente per allineare tutti i marcatori influenzati dall’alimentazione
• Paziente deve aver praticato una dieta regolare nei giorni precedenti, no alcol, fumo prescritto o comunque registrato

• Persone che possono fare i prelievi fanno parte dell’albo
• Modificazione da stasi venosa (laccio emostatico prolungato)

Trasporto del campione

Bisogna tenere sotto controllo:

• Energia meccanica, vibrazioni, scuotimenti che possono dare emolisi
• Esposizione a luce diretta che può degradare alcune sostanze
• Esposizione al calore e rispetto della catena del freddo (previene evaporazione sostanze volatili)
• Esposizione all’aria (ossigeno altera perché è sostanza più reattiva che c’è e ossida campione)
• Contaminazioni chimiche
• Contaminazioni microbiche

Conservazione

• T diverse, 0°C (acqua e ghiaccio, che cambia T più blanda e preserva campione) per ormoni / metaboliti a vita breve; -20°C / -70°C / -142°C (azoto liquido) per lungo tempo conservativo
• A T ambiente non avvengono cambiamenti per 4h a carico di enzimi, metaboliti, elettroliti e minerali

Campioni non idonei vanno buttati via; fonti di non idoneità:

• Identificazione assente
• Identificazione incompleta
• Mancanza informazioni necessarie per esecuzione test
• Contenitore non idoneo o non integro
• Prelievo non corretto
• Quantità insufficiente
• Rapporto sangue / anticoagulante inadeguato
• Mancanza aggiunta di conservante
• Presenza coaguli
• Emolisi evidente
• Conservazione non corretta e a T non corretta
• Esposizione a luce solare diretta
• Congelamenti e scongelamenti ripetuti

Anche la postura del paziente ha effetto sulla composizione del campione: da in piedi acqua esce e passa nel terzo spazio dalle cellule dell’endotelio a causa dell’aumento della pressione idrostatica => si ha emoconcentrazione di circa il 10% (riduzione del volume sanguigno).

In posizione di riposo seduta semisdraiata: non c’è concentrazione del campione.

La posizione è simile a quella dei pazienti allettati nei reparti => diminuisce variabilità della postura tra pazienti allettati e standardizza ancora di più la procedura.

2) Fase analitica

Sotto controllo laboratoristi e ricercatori.

Errore

Variabilità analitica: errori di misura.

• Problema più grosso è sapere a priori che, per quanto possa essere attento l’operato, risultati ottenuti saranno inevitabilmente affetti da un errore di misurazione
• Errore = quando valore si discosta da valore vero

2 tipi di errore principali:

• Accidentale / casuale = sempre da preventivare, può capitare in qualsiasi momento, non si possono né prevedere né evitare e affliggono la misura in modo casuale (collega che si appoggia a bancone, causa vibrazione e altera misura; o si apre la finestra e aria altera)
• A differenza di quello sistematico, se faccio più misure posso ammortizzarlo e ridurlo al minimo
• Sistematico = pericolosissimi per tutti, perché posso pensare di lavorare bene; quelli che compaiono in ogni singola misura, influiscono su misurazione sempre nello stesso senso e solitamente per una stessa quantità, e possono essere:
• Errori strumentali = legati a utilizzo strumenti poco precisi, mai tarati o non adatti alla misura che si deve effettuare
• Errori soggettivi = provocati da poca abilità, negligenza, errori di lettura (errore di parallasse, che se guarda da più alto la riga vedo un valore diverso), di apprezzamento
• Errori ambientali = pericolosissimi, determinati da fattori esterni come ad es la presenza fonti calore, campi magnetici esterni (termoconvettore botta fuori aria fredda o calda in base alla stagione e altera T dello strumento)

In caso di pazienti gravi è più pericoloso e devo tenere presente che nel tempo che prendo per l’analisi devo poter fare anche la validazione.

Ripetizione prevista dalle linee guida perché è contemplato e può entrare in qualsiasi momento.

Misura

Differenza tra le due tipologie di errori introducono concetti di accuratezza e precisione della misura.

• Accuratezza della misura = descrive quanto il valore medio è vicino al valore vero
• Precisione della misura = misura è precisa quando io misurando ottengo risultati concordanti tra di loro, cioè che differiscono in maniera irrilevante tra loro
• Non per forza una misura accurata è anche precisa e viceversa
• Imprecisione della misura non è eliminabile
• Tutte queste misure, sia effettuate una volta che ripetute, sono affette da
• Errore assoluto = differenza tra valore vero e valore misurato
• Incertezza assoluta = δx individua un intervallo nel quale si troverà il valore vero della grandezza in esame, che non è possibile però conoscere; individua intervallo in cui anche se ho sbagliato la misura vera è contenuta
• Importanza di conoscere quanto sbagliamo quando misuriamo
• Valore analitico

Metodo analitico

Attendibilità metodo analitico garantisce qualità risultato.

Risultato dev’essere costruito su 4 cardini che sono alla base di ogni metodo analitico:

• Accuratezza
• Specificità analitica = capacità della mia metodica (ricercatori e clinici) di misurare in un campione complesso la molecola / analita che interessa a me senza interferenze da altre sostanze
• Sensibilità analitica = capacità del metodo di dosare la più piccola concentrazione della sostanza da analizzare (metodi più sensibili sono più soggetti a errori casuali)
• Precisione = concordanza dei valori su uno stesso campione con lo stesso metodo; in modo più specifico si traduce in ripetibilità (riferita all’operatore, precisione di un professionista in una seduta analitica; misura della deviazione dei risultati del valore medio ottenuta in un’unica serie analitica da un tecnico); riproducibilità (misura della deviazione dei risultati dal valore medio ottenuta nel corso d