Appunti completi di Filogeografia

Filogeografia riassunti

La filogeografia si occupa principalmente di studiare il differenziamento genetico fra popolazioni o fra specie strettamente imparentate in relazione alla distribuzione geografica e quindi anche in relazione alle condizioni ambientali ecologiche (attuali o del passato). Sequenze diverse hanno una distribuzione non casuale a livello geografico, e questo può dare molte informazioni riguardo alla storia demografica delle popolazioni studiate. I pattern osservati possono essere interpretati con modelli teorici quali Bayesian likelihood, bayesian inference e simulation based inference (probabilità basata sul confronto fra osservati e attesi).

Marcatori molecolari genetici

I marcatori molecolari genetici corrispondono a specifici loci genici che identificano determinate regioni cromosomiche sia in porzioni codificanti sia non codificanti. Per studiarli è necessario fare un sequenziamento genomico o un’elettroforesi nel caso dei microsatelliti. I marcatori molecolari genetici hanno il vantaggio di poter essere applicati a tutti gli organismi viventi. Sono di più sicura interpretazione rispetto a marcatori fenotipici o proteici e permettono di rilevare fenomeni di differenziamento altrimenti difficilmente studiabili (es. specie criptiche; relazioni di parentela). I marcatori molecolari classici (proteici), a differenza di quelli genici, non mostrano le mutazioni missenso o sinonime e permettono di studiare solo parti codificanti del genoma.

I marcatori genetici possono essere studiati grazie alla PCR, la quale, producendo una quantità elevata di copie di un determinato frammento di DNA da un individuo, permette di avere materiale su cui lavorare. Questo deve poi essere analizzato in qualche modo, per ottenere informazioni sulla sequenza che contiene. A seconda delle necessità possono essere presi in considerazione diversi tipi di marcatori genetici, fra cui gli SNP, microsatelliti e aplotipi.

SNP

Gli SNP (single nucleotide polymorphism) sono mutazioni di singole coppie di basi (transizioni o transversioni) che sono eventi unici o avvengono con frequenza molto bassa (<10^-9) e si possono trovare in regioni codificanti o non. Il fatto che si tratti di mutazioni uniche o quasi significa che ogni evento di mutazione crea un nuovo allele, diverso da ogni altro già presente nella popolazione. Lo stato ancestrale può essere valutato dal confronto con un outgroup (nel caso degli SNP della regione codificante del mtDNA si usa quello della tipa inglese).

STR

STR (Short Tandem Repeats - Microsatelliti) sono sequenze di poche basi ripetute che si trovano lungo tutto il genoma in regioni non codificanti. Le mutazioni di queste sequenze (inserzioni o delezioni che variano la lunghezza dell’area di ripetizione, dovute a errori della DNA polimerasi) avvengono con frequenza elevata. Queste sequenze sono quindi molto polimorfiche: individui diversi si riconoscono facilmente perché hanno numero diverso di ripetizioni all'interno di queste sequenze, differenza che non si manifesta a livello fenotipico ma che può essere vista solo tramite sequenziamento. Ogni locus microsatellite fornisce come risultato un profilo genotipico in cui è registrata la dimensione dei due alleli dell’individuo esaminato.

Aplotipi

Aplotipi sono combinazioni di varianti nucleotidiche che vengono ereditate insieme, essendo strettamente associate tra loro sulla stessa molecola ed essendo quindi in linkage disequilibrium. L'associazione statistica tra loci si manifesta in assenza di ricombinazione tra i loci stessi. Per quanto riguarda gli autosomi (cromosomi non sessuali) e le regioni pseudoautosomiche dei cromosomi sessuali, questo può essere dovuto alla vicinanza fisica tra i loci considerati e all'assenza di hot-spot di ricombinazione tra di loro. Invece, gli alleli della regione non ricombinante del cromosoma Y (NRY) sono sempre associati a formare aplotipi, così come gli alleli del genoma mitocondriale (mtDNA). Infatti, queste due porzioni del genoma non ricombinano, essendo ereditate con modalità uniparentali, paterna la prima, materna la seconda.

Marcatori mitocondriali e nucleari

I marcatori molecolari genetici possono essere distinti in mitocondriali e nucleari. Questi hanno un diverso livello di variabilità (utili a diversi livelli tassonomici) e diversi costi di sviluppo e applicazione. Nella maggior parte dei casi, sono aploidi i primi (eredità uniparentale materna nei vertebrati e in molti invertebrati) e diploidi i secondi (eredità biparentale, tranne se si prende in considerazione il cromosoma Y). I marcatori uniparentali (non autosomici) hanno diverse applicazioni nello studio della genetica di popolazione.

Il cromosoma Y, trasmesso unicamente dal padre ai figli maschi, e il DNA mitocondriale, trasmesso invece esclusivamente dalla madre ai figli (sia maschi che femmine, anche se solo le figlie femmine lo ritrasmettono a loro volta), non essendo soggetti a ricombinazione, vengono variati nel corso delle generazioni esclusivamente da mutazioni casuali, che vengono trasmesse inalterate alla generazione successiva. I geni autosomici invece sono soggetti a ricombinazione. In alcuni molluschi, il mtDNA viene trasmesso da femmine a femmine e da maschi a maschi, attraverso un sistema di riconoscimento.

Marcatori mitocondriali

I marcatori mitocondriali sono stati fra i primi marcatori molecolari a DNA ad essere utilizzati per studi di filogenesi e filogeografia. Lo studio del mtDNA presenta molti vantaggi rispetto allo studio del DNA autosomico: è di piccole dimensioni, è presente in multiple copie in ogni cellula, è più facile ottenerlo anche da fonti molto degradate, è più stabile nel tempo. Il genoma mitocondriale è compatto e circolare. Per ogni individuo si ha solo una sequenza aploide, il che è sia un vantaggio, perché permette di non dover gestire la presenza di più alleli diversi per uno stesso locus, sia uno svantaggio perché da informazioni parziali: solo relative all’ereditarietà uniparentale materna.

Nei vertebrati, il mtDNA non ha introni e ha una dimensione di circa 17 kb. È costituito da una regione codificante nell’uomo per 37 geni (fra cui i geni per circa 20 tRNA, 13 proteine, e due RNA ribosomali) e una regione D-loop (displacement loop) non codificante ma con funzione regolatrice. Da questa parte la replicazione del DNA mitocondriale: solo le regioni necessarie all’apertura della forcina di replicazione hanno constraint funzionali, tutte le altre no. La regione codificante ha un tasso di mutazione molto minore rispetto al D-loop, che invece è ipervariabile (in particolare le sue regioni HV1 e HV2, che non hanno constraint funzionali). Lo studio delle due sequenze permette quindi di analizzare i diversi livelli di evoluzione: il D-loop permette di studiare la storia evolutiva più recente (confronto fra individui della stessa specie), mentre la regione codificante permette di studiare la storia evolutiva più antica (confronto fra specie diverse).

Fra le parti del DNA mitocondriale che sono molto conservate vi sono quelle che codificano per i tRNA e per i rRNA (infatti qualsiasi mutazione sarebbe dannosa e verrebbe velocemente eliminata) e mostrano un’elevata similarità tra diverse specie. Molto presto nella loro applicazione si sono resi disponibili dei primers universali proprio grazie alla presenza di queste regioni più conservate (descritti in Kocher et al., 1989). I geni per i rRNA sono molto conservati perché hanno forti constraint funzionali (qualsiasi mutazione determina facilmente perdita di funzione): hanno spesso sequenza identica fra individui di una stessa specie. Questi sono quindi molto utili per il confronto fra specie diverse, anche filogeneticamente molto distanti. Sono utili per lo studio del DNA ambientale.

La replicazione del DNA mitocondriale inizia a livello dello strand H nel D-loop, grazie a un primer generato da un trascritto dello strand L. Solo quando il nuovo strand H è a circa 2/3 dal completamento inizia anche la replicazione del L strand quando il sito di origine per la sua replicazione viene scoperto dalla DNA polimerasi. La replicazione nelle due direzioni è quindi asincrona, a differenza di quella del DNA nucleare.

Il DNA può essere estratto grazie a kit commerciali e poi amplificato grazie alla disponibilità di primers, attraverso PCR. I frammenti amplificati possono quindi essere sequenziati (sequenziamento di Sanger) in modo da ottenere i dati su cui lavorare e trarre considerazioni. Confrontando sequenze di diversi individui è possibile misurare il grado di diversità fra queste facendo confronto a coppie fra sequenze di individui, fra diverse popolazioni o fra specie. Le sequenze sono generalmente molto simili, il che può essere un problema in caso di analisi di popolazioni piccole.

Misurare mtDNA la divergenza fra sequenze

La prima cosa che si può fare analizzando sequenze mitocondriali è calcolare la divergenza tra sequenze come differenza percentuale fra sequenze. Se consideriamo due sequenze lunghe z nucleotidi che differiscano per z nucleotidi e definiamo siti (1->t) le diverse posizioni della sequenza, allora p=z /z è la differenza percentuale tra le due sequenze. Nel caso di sequenze simili (campioni entro la stessa specie), p è una buona misura di distanza genetica. Tuttavia, se le sequenze sono molto diverse, esiste il fenomeno delle sostituzioni multiple -> un sito può subire nel tempo due successive mutazioni che non possiamo rilevare perché ricreano lo stesso nucleotide (es A->T e T->A) o che rileviamo solo in parte come mutazione singola (es A->T e T->C).

Le sostituzioni multiple possono al limite creare una saturazione nelle differenze tra sequenze: si arriva ad un plateau di divergenza percentuale che non può essere superato (75%). Per livelli intermedi di divergenza si può utilizzare quindi il modello di correzione di Jukes e Cantor: secondo questo la divergenza percentuale “vera” è D = -(3/4) ln(1-(4/3)p). La distanza percentuale basata sulle mutazioni visibili viene aumentata dal modello di Jukes e Cantor in base a quanto ci si aspetta di essersi persi delle sostituzioni multiple. Esistono poi tanti modelli per la correzione delle distanze tra sequenze, a partire dalla Kimura 2 parametri (Kimura 1980), che tiene conto del fatto che alcune mutazioni possono avvenire con maggior frequenza di altre.

Se si hanno più di 2 sequenze (abbiamo campionato numerosi individui) si possono fare tutti i confronti a coppie possibili e ricavare una matrice di distanze tra coppie di sequenze. Le matrici di distanze tra coppie di sequenze possono essere difficili da visualizzare (non si possono valutare a occhio se le sequenze campionate sono tante) e possono essere rappresentate da dendrogrammi (“alberi filogenetici”) o Multidimensional Scaling. Si tratta di rappresentazioni dove sequenze più simili tra loro sono connesse da rami più corti o sono più vicine nello spazio. Alberi di sequenze basati su distanze a coppie possono essere creati con diversi algoritmi, fra cui UPGMA (Unweighted pair grouping with arithmetic averages) e NJ (Neighbour Joining). Spesso a ciascun nodo dell’albero è associato un valore di bootstrap che ci indica quanto quel nodo è supportato dai dati a partire dai quali è stato costruito l’albero.

UPGMA costruisce l’albero a partire dalle due sequenze con distanza più piccola fra di loro (individuabile nella matrice di distanze). Fra queste due viene messo un primo nodo. Si procede quindi individuando la seconda distanza più piccola e anche fra queste due sequenze viene posto un nodo. Si procede ricercando la terza distanza più piccola e così via. (distanza di C da AB è media della distanza di C da A e di C da B).

Esempio

La procedura può produrre risultati diversi se ho due distanze identiche. Inoltre, gli alberi UPGMA possono produrre una cattiva rappresentazione della matrice di distanze perché più matrici diverse possono portare a uno stesso albero, e non tengono conto del fatto che una sequenza può variare più rapidamente (può avere un tasso evolutivo più veloce) rispetto ad altre. Questo si può risolvere se si disegna l’albero in modo asimmetrico (perché fare le medie fra le distanze appiattisce le differenze nelle distanze).

Gli alberi costruiti con algoritmo NJ forniscono una rappresentazione più fedele della matrice di distanze se sono presenti sequenze con diverso tasso evolutivo. NJ è un algoritmo un po’ più complicato di quello UPGMA. Considera non solo la distanza tra coppie di sequenze ma anche la distanza tra ciascuna sequenza e tutte le altre insieme.

Esempio

L’UPGMA produce l’albero giusto se la distanza è ultrametrica (i due rami che si dipartono da un nodo sono uguali). Dato un albero, una misura di distanza è additiva se la distanza tra ogni coppia di tips è la somma dei rami che le congiunge. L’algoritmo NJ produce l’albero giusto se la distanza è additiva. È un algoritmo abbastanza robusto anche se la distanza non è additiva.

Bootstrap

Per determinare il supporto di un nodo con bootstrap bisogna ricreare degli allineamenti delle sequenze in cui si selezionano a caso i siti dell’allineamento iniziale per formare uno “pseudoallineamento casuale”. Lo pseudoallineamento è lungo lo stesso numero di loci e ha lo stesso numero di sequenze ma ogni suo sito è uno dei siti dell’allineamento originale estratto a caso con reimmissione (caso estremo da un allineamento con 20 siti può essere estratto 20 volte il sito 1). Dopo aver creato un numero elevato di pseudoallineamenti (1000 o 10000) si creano degli alberi a partire da questi e si vede quale percentuale di questi alberi mantiene il nodo che stiamo considerando. Il valore percentuale corrisponde al valore di bootstrap del nodo.

Questa è una procedura che permette di campionare il segnale prevalente nel dataset originale: se numerosi siti nell’allineamento originale supportano il differenziamento di una determinata sequenza dalle altre, questi, essendo più numerosi, avranno più probabilità di essere ricampionati nella costruzione dello pseudoallineamento. Viceversa, se sono pochi i siti che mettono insieme o differenziano determinate sequenze, questi siti più difficilmente saranno campionati.

Le distanze genetiche possono anche essere rappresentate, invece che con un albero, con un network. In questo caso ogni ramo ha una lunghezza proporzionale al numero di mutazioni tra due nodi, che rappresentano le sequenze in esame. Il network può essere costruito con diversi modelli quali Minimum spanning network, Network basato su “statistical parsimony”, Median joining network. I cerchi pieni rappresentano aplotipi non campionati, le mutazioni sono rappresentate da barrette o dagli stessi rami, sempre di lunghezza unitaria, nel Median Joining Network.

Le distanze possono anche essere rappresentate su un piano attraverso non linear multidimensional scaling. In questo caso la distanza nel piano corrisponde alla distanza genetica.

MtDNA confronto fra sequenze di una popolazione

Se si sta studiando un campione popolazionale è possibile misurare la diversità genetica entro popolazione o fra popolazioni, dato importante in quanto la diversità genetica è necessaria per l’adattamento delle popolazioni all’ambiente e perché una bassa diversità genetica è spesso indicativa di consanguineità (inincrocio) che determina fitness ridotta. Facendo riferimento a un frammento di DNA mitocondriale, la diversità intrapopolazionale si può misurare come numero di sequenze diverse (aplotipi) presenti in una popolazione. Questa misura però dipende molto dalla dimensione del campione: se questo non è sufficientemente grande è più facile che sfuggano aplotipi più rari. In un grafico la probabilità di NON osservare un aplotipo (in y) date le frequenze p (diverso colore) in rapporto al numero di individui analizzati (in x) ha andamento esponenziale al contrario (probabilità decresce esponenzialmente al crescere delle frequenze). La probabilità di NON osservare è più alta se la frequenza p è più bassa.

Per questo motivo, se si usa come misura di variabilità il numero di sequenze diverse che si osservano, i dati relativi a popolazioni diverse possono essere confrontati soltanto se la sample size è la stessa. Altrimenti la probabilità di campionare un certo numero di sequenze sarebbe diversa per le due popolazioni per motivi legati alla sample size. Data questa limitazione relativa alla dimensione del campione e soprattutto per ovviare al problema di diverse sample size per diverse popolazioni, in genere si usa come misura della diversità genetica la haplotype diversity nel caso di DNA mitocondriale e la gene diversity (eterozigosità attesa) nel caso di microsatelliti (DNA nucleare).

In una popolazione con k aplotipi che abbiano frequenza p la haplotype diversity è: Se pi^2 è la probabilità di campionare due volte l’aplotipo i, la sommatoria per tutti gli aplotipi è la probabilità di campionare due volte lo stesso aplotipo qualsiasi esso sia. 1-la probabilità di campionare due volte lo stesso aplotipo corrisponde alla probabilità di campionare due aplotipi diversi, e corrisponde a una misura di variabilità: più la variabilità è alta e maggiore sarà la probabilità di campionare due aplotipi diversi se si fanno due campionamenti random. In caso di geni nucleari, la p non è più frequenza degli aplotipi ma degli alleli. Se le frequenze degli aplotipi è molto diversa (es. uno è predominante) il valore di haplotype diversity si abbassa (perché diventa più facile campionare due volte due aplotipi identici, indipendentemente dal numero complessivo di aplotipi).

Diversity (variabilità) non è la stessa cosa di differentiation (differenziamento). Problema nella haplotype diversity come misura di diversità.