Appunti completi di elementi di biochimica (STC)

Elementi di biochimica

Gli acidi nucleici

Sequenziamento degli acidi nucleici

L'essere in grado di determinare la sequenza di nucleotidi degli acidi nucleici ha reso possibile dedurre le sequenze amminoacidiche delle proteine da essi codificate e, in una certa misura, le strutture e le funzioni di tali proteine. Il sequenziamento degli acidi nucleici ha rivelato anche informazioni sulla regolazione dei geni.

La strategia complessiva usata per sequenziare un qualsiasi polimero composto da unità non identiche prevede tre fasi:

• Scissione del polimero in frammenti specifici di dimensioni sufficientemente piccole da poter essere sequenziati in modo completo.
• Determinazione della sequenza dei residui presenti in ciascun frammento.
• Ordinamento dei frammenti del polimero originale mediante l’allineamento dei frammenti che contengono sequenze sovrapposte.

Molti batteri hanno la possibilità di resistere alle infezioni causate dai batteriofagi (virus specifici per i procarioti) grazie a un sistema di modificazione e restrizione. Il batterio modifica determinati nucleotidi presenti in specifiche sequenze del proprio DNA mediante aggiunta di un gruppo metilico nel corso di una reazione catalizzata da una metilasi di modificazione. Un’endonucleasi di restrizione, che riconosce la stessa sequenza nucleotidica individuata dalla metilasi, taglia qualunque DNA che non è stato modificato su almeno uno dei suoi due filamenti (un’endonucleasi scinde legami interni al filamento polinucleotidico di un acido nucleico, mentre un’esonucleasi rimuove uno dei residui terminali dell’acido nucleico). Questo sistema distrugge il DNA esogeno contenente un sito di riconoscimento che non è stato modificato tramite metilazione.

Il DNA ospite è sempre metilato almeno per metà e quindi, anche se il filamento figlio non è metilato subito dopo essere stato sintetizzato, quello parentale, a cui quest’ultimo è appaiato, è già modificato (e pertanto protegge entrambe le catene di DNA dal taglio da parte dell’enzima di restrizione). Nell’endonucleasi di tipo II ci sono enzimi che tagliano il DNA all’interno della sequenza di 4-8 basi riconosciuta dalla loro corrispondente metilasi di modificazione.

Gran parte delle endonucleasi di restrizione di tipo II riconosce e taglia sequenze di DNA palindrome. Quasi tutti gli enzimi di restrizione tagliano le due catene di DNA a livello di posizioni sfalsate, dando origine a frammenti provvisti di estensioni complementari a singolo filamento. Al contrario, determinate endonucleasi di restrizione scindono i due filamenti di DNA in corrispondenza dell’asse di simmetria, generando frammenti di restrizione con estremità nette (piatte) in cui tutte le basi sono appaiate.

I frammenti prodotti durante il trattamento di una molecola di DNA con una endonucleasi di restrizione possono essere separati mediante elettroforesi su gel.

In linea di principio, una molecola carica si sposta in un campo elettrico con una velocità proporzionale alla sua densità di carica complessiva, alla sua dimensione e alla sua forma. Per le molecole che presentano una composizione relativamente omogenea (come, per esempio, gli acidi nucleici), la forma e la densità di carica sono costanti, e la velocità di migrazione dipende principalmente dalle dimensioni. L'elettroforesi è condotta in una matrice gelatinosa, costituita di solito da agarosio (polimeri di carboidrati che formano un reticolo a maglie poco compatte) o da poliacrilamide (un polimero di sintesi più rigido con legami trasversali). Di norma il gel è mantenuto in posizione da due lastre di vetro o è collocato all'interno di uno stretto tubo capillare. Le molecole da separare sono applicate a un’estremità del gel e migrano attraverso i pori della matrice sotto l’influenza del campo elettrico. Le molecole più piccole si spostano con maggiore rapidità attraverso il gel e quindi, in un dato tempo, migrano più lontano dal punto di origine.

Alla fine dell'elettroforesi le molecole che sono state separate possono essere visualizzate nel gel grazie a una tecnica opportuna, come l’aggiunta di un colorante che si lega saldamente al DNA, una marcatura di tipo radioattivo, oppure la fluorescenza.

Il metodo di sequenziamento del DNA

Il metodo tradizionale di sequenziamento del DNA utilizza la tecnica di terminazione della catena. Questa metodica utilizza un enzima di Escherichia coli per sintetizzare copie complementari del DNA a singolo filamento da sequenziare. L’enzima è una parte della DNA polimerasi I, uno degli enzimi coinvolti nella replicazione del DNA dei batteri; impiegando il filamento di DNA singolo come stampo, la DNA polimerasi I unisce i quattro deossinucleosidi trifosfato, dATP, dCTP, dGTP e dTTP, in una catena polinucleotidica complementare che poi si allunga in direzione 5’ 3’.

La DNA polimerasi I può aggiungere deossinucleotidi in successione unicamente all’estremità 3’ di un polinucleotide che è appaiato con il filamento stampo; la replicazione inizia in presenza di un breve polinucleotide (un primer) complementare all’estremità 3’ del DNA stampo, che diventa quindi l’estremità 5’ del nuovo filamento. Il componente fondamentale della miscela di reazione è una piccola quantità di un 2’,3’-dideossinucleoside trifosfato (ddNTP), che è privo del gruppo 3’-OH presente nei deossinucleotidi e che fa sì, quindi, che la biosintesi di DNA venga interrotta.

Usando una piccola quantità di ddNTP, si genera una serie di catene troncate, ciascuna delle quali finisce con l’analogo dideossi in una delle posizioni occupate dalla base corrispondente. Ogni ddNTP è caratterizzato da un’“etichetta” fluorescente diversa, in modo che i prodotti della reazione della polimerasi possano essere facilmente individuati.

L’elettroforesi su gel separa i segmenti di DNA neosintetizzati che differiscono tra loro per un solo nucleotide. Gli strumenti di sequenziamento più avanzati che utilizzano il metodo di terminazione della catena identificano ogni segmento di DNA nel momento in cui esso fuoriesce dal tubo capillare in cui ha luogo l’elettroforesi. Così facendo, i dati ottenuti si presentano come una serie di picchi:

Poiché sia la preparazione del campione sia l’analisi dei dati sono ormai completamente automatizzate, si possono ottenere sequenze di DNA (chiamate “letture”, reads) lunghe fino a 1000 nucleotidi partendo da una sola miscela di reazione iniziale prima che errori cumulativi riducano l’identificazione della base a livelli inaccettabili. Le numerose letture che sono state sequenziate devono essere disposte in un ordine corretto per formare il filamento molto più lungo di DNA da cui sono state originate. Ciò si ottiene mediante la sovrapposizione delle letture di sequenze:

L’ordine dei frammenti sequenziati nel loro DNA di origine è determinato dall’abbinamento delle sequenze di frammenti sovrapposti. Quindi, l’estremità 3’ del frammento 1 è identica all’estremità 5’ del frammento 2, la cui estremità 3’ è identica all’estremità 5’ del frammento 3 e così via.

La determinazione della sequenza del genoma umano, composto da circa tre miliardi di nucleotidi, è stata un’impresa titanica, che ha coinvolto centinaia di scienziati suddivisi in due gruppi di lavoro. Il genoma umano contiene 3 miliardi e 38 milioni di nucleotidi in 23 cromosomi. Il 99% è in comune con lo scimpanzé.

La manipolazione del DNA

I segmenti di DNA possono essere clonati o riprodotti in un organismo ospite. La tecnologia del DNA ricombinante, detta anche clonaggio molecolare o ingegneria genetica, permette di isolare, amplificare e modificare sequenze specifiche di DNA.

L’approccio illustrato di seguito viene usato per ottenere e amplificare un segmento di DNA:

• Viene generato un segmento di DNA delle dimensioni opportune mediante digestione con enzimi di restrizione e successiva PCR o sintesi chimica.
• Il frammento è incorporato all’interno di un’altra molecola di DNA nota come vettore, che contiene le sequenze necessarie per dirigere la replicazione del DNA.
• Il vettore, unitamente al DNA di interesse, è introdotto nelle cellule, dove viene replicato.
• Le cellule contenenti il DNA desiderato sono identificate o selezionate.

I vettori di clonaggio sono particolari molecole di DNA, naturale o anche artificiale, impiegate nelle tecnologie molecolari di clonaggio. Esistono differenti tipi di vettori di clonaggio. I più semplici, e anche i più usati comunemente, sono i vettori plasmidici (o plasmidi). I plasmidi sono elementi genetici di DNA, circolari ed extracromosomici, che si replicano in maniera autonoma rispetto al cromosoma batterico:

In breve, il clonaggio mediante vettore plasmidico consiste nel trattare sia il plasmide che il DNA da clonare mediante uno stesso enzima di restrizione. In questo modo il vettore plasmidico viene linearizzato, cioè perde la sua normale struttura circolare ed è pronto ad ospitare al suo interno la molecola di DNA esogeno, che viene ligata insieme al plasmide linearizzato dall'enzima DNA ligasi. Il plasmide con il DNA esogeno viene detto plasmide ricombinante. Questo viene infine trasferito in una opportuna cellula ospite (normalmente cellule batteriche) la quale è in grado di produrre centinaia di copie del frammento di DNA clonato.

Un segmento di DNA da clonare è ottenuto di solito mediante l’azione di endonucleasi di restrizione. Un frammento di restrizione può essere inserito in un taglio prodotto in un vettore di clonaggio per mezzo dello stesso enzima di restrizione:

Il plasmide ricombinante viene inserito in una cellula ospite, ma occorrono degli strumenti per individuare le cellule che lo hanno ricevuto rispetto a quelle che hanno ricevuto il plasmide tal quale e le cellule che non hanno ricevuto nulla. È essenziale selezionare esclusivamente quegli organismi ospiti che sono stati trasformati e che contengono un vettore costruito nella maniera voluta. Nel caso della trasformazione plasmidica è possibile operare la selezione attraverso l’impiego di antibiotici e/o di sostanze cromogeniche (che generano colore). Per esempio, il gene lacZ contenuto nel plasmide pUC18 codifica l’enzima β-galattosidasi che scinde il composto incolore X-gal generando un prodotto di colore blu:

I plasmidi ricombinanti avranno la beta galattosidasi non funzionante e formeranno colonie bianche, mentre i plasmidi intatti avranno la beta galattosidasi attiva e formeranno colonie blu. La serie clonata di tutti i frammenti di DNA derivanti da un particolare organismo è nota come libreria genomica. Una volta ottenuto il numero richiesto di cloni, la libreria genomica deve essere analizzata per accertare la presenza del gene desiderato.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) permette di amplificare un segmento di DNA ottenendo in vitro, molto rapidamente, la quantità di materiale genetico necessaria per le successive applicazioni. La PCR prevede che un campione di DNA sia separato nei filamenti singoli e incubato con DNA polimerasi, dNTP e due oligonucleotidi primer le cui sequenze fiancheggiano il frammento di DNA di interesse; i primer guidano la DNA polimerasi nella sintesi di filamenti complementari del DNA bersaglio.

La DNA-polimerasi è in grado di sintetizzare progressivamente un nuovo filamento di DNA nelle seguenti condizioni:

• Devono essere disponibili i nucleotidi da polimerizzare, sotto forma di deossiribonucleosidi trifosfati (dNTP);
• Il DNA deve essere denaturato, ovvero le due eliche che compongono i filamenti devono essere già separate;
• Il segmento da ricostruire può essere soltanto prolungato, ovvero non è possibile sintetizzare un nuovo filamento a partire da zero;
• Devono essere rispettate opportune condizioni di temperatura, pH, etc.

La capacità di manipolare le sequenze di DNA consente di alterare ed esprimere i geni con l’intento di ottenere proteine dotate di migliori proprietà funzionali o di correggere difetti genetici. La seguente tabella elenca alcune proteine ricombinanti prodotte per essere impiegate in medicina o in agricoltura:

Per molti scopi è preferibile ottenere un organismo “su misura” piuttosto che solo una proteina, vero obiettivo dell’ingegneria genetica. Gli organismi pluricellulari che esprimono un gene proveniente da un altro essere vivente sono detti transgenici, mentre il gene esogeno trapiantato è denominato transgene. Il grosso topo a sinistra è il prodotto di un uovo fecondato e microiniettato con DNA contenente il gene di ratto per l’ormone della crescita; il suo peso è quasi doppio rispetto all’altro esemplare normale, appartenente alla stessa figliata.

Gli amminoacidi

La struttura degli amminoacidi

Le analisi di una vasta serie di molecole proteiche provenienti da quasi tutte le fonti disponibili hanno evidenziato che tutte le proteine sono composte di 20 amminoacidi standard. Non tutte le proteine note contengono tutti e 20 i tipi di amminoacidi, anche se la maggioranza ne contiene molti, praticamente tutti. Gli amminoacidi comuni sono noti come α-amminoacidi, poiché possiedono un gruppo amminico primario in qualità di sostituente dell’atomo di carbonio α. La struttura generica di un amminoacido è la seguente:

Quindi, i 20 amminoacidi differiscono tra loro solo per il gruppo R che lega lateralmente.

Gli amminoacidi possono polimerizzare per dare luogo a catene lineari; questo processo avviene per mezzo di reazioni di condensazione (che prevedono la formazione di un legame con l’eliminazione di una molecola di acqua). Il risultante legame CO-NH è detto legame peptidico:

Gli amminoacidi, come molti altri composti biologici, sono molecole chirali la cui configurazione può essere rappresentata con le proiezioni di Fischer. Gli amminoacidi, nelle proteine, hanno tutti la configurazione stereochimica L.

L’importanza della stereochimica nei sistemi viventi ha destato l’interesse anche dell’industria farmaceutica. Numerosi farmaci sono sintetizzati per via chimica in forma di miscele racemiche, sebbene solo un enantiomero esibisca attività biologica. In molti casi l’enantiomero opposto è biologicamente inerte, e quindi viene somministrato insieme al prodotto attivo. Questo è il caso, per esempio, dell’agente antinfiammatorio ibuprofene, dove uno solo dei due enantiomeri è fisiologicamente attivo:

Talvolta, però, l’enantiomero inattivo di un farmaco utile produce effetti dannosi, e quindi deve essere tolto dalla miscela racemica; l’esempio che ha destato maggiore scalpore è quello del farmaco talidomide, un blando sedativo il cui enantiomero inattivo determina gravi malformazioni alla nascita.

Proprietà acido-base degli amminoacidi

Gli α-amminoacidi possiedono due o tre gruppi acido-base. A valori di pH molto bassi, questi gruppi sono completamente protonati, mentre a valori di pH molto alti questi gruppi sono deprotonati. A valori intermedi di pH, i gruppi acidi tendono a essere deprotonati mentre i gruppi basici tendono a essere protonati.

Il pH a cui una molecola non porta carica elettrica netta è detto punto isoelettrico. Per gli α-amminoacidi:

pK₁ + pK₂ = pI/2

Classificazione degli amminoacidi

Il modo più semplice per classificare i 20 amminoacidi standard utilizza le polarità delle loro catene laterali. In base a questa classificazione, vi sono tre tipi principali di amminoacidi:

• Amminoacidi con gruppi R non polari. Gli amminoacidi riuniti in questo gruppo sono nove. La glicina è l’amminoacido con la catena laterale più piccola, in quanto è costituita da un solo atomo di H, mentre l’alanina, la valina, la leucina e l’isoleucina presentano catene laterali composte da idrocarburi alifatici con dimensioni variabili. La prolina è caratterizzata, invece, da una catena laterale pirrolidinica ciclica.
• Amminoacidi con gruppi R polari non carichi. Gli amminoacidi classificati in questo gruppo sono sei. La serina e la treonina hanno catene laterali di grandezza differente con un gruppo ossidrilico; l’asparagina e la glutammina hanno catene laterali amidiche di varie dimensioni, la tirosina presenta un gruppo fenolico mentre la cisteina è l’unico tra i 20 amminoacidi a possedere un gruppo tiolico in grado di formare un legame (ponte) disolfuro con un’altra cisteina mediante ossidazione dei due gruppi tiolici.
• Amminoacidi con gruppi R polari carichi. Cinque amminoacidi possiedono catene laterali cariche. A valori fisiologici di pH, le catene laterali degli amminoacidi basici sono cariche positivamente. La lisina presenta una catena laterale costituita da butilammina, mentre l’arginina ha un gruppo guanidinico; l’istidina contiene un gruppo imidazolico. Le catene laterali degli amminoacidi acidi, acido aspartico e acido glutammico, sono cariche negativamente a un pH superiore a 3; nello stato ionizzato, tali amminoacidi sono chiamati aspartato e glutammato.

I 20 amminoacidi standard non sono gli unici presenti nei sistemi biologici. Alcuni amminoacidi non fanno parte delle proteine e svolgono bensì una serie di funzioni biologiche in maniera indipendente.

Gli amminoacidi e i loro derivati fungono spesso da messaggeri chimici per la comunicazione tra le cellule. Per esempio, la glicina, l’acido α-amminobutirrico (GABA, un prodotto della decarbossilazione della glutammina) e la dopamina (un derivato della tirosina) sono neurotrasmettitori, ossia sostanze rilasciate dalle cellule nervose per influenzare il comportamento di altre poste nelle loro vicinanze.

L’ornitina è invece un α-aminoacido intermedio del ciclo dell’urea. Vi è poi la canavanina la cui tossicità aumenta in caso di denutrizione. Ci sono, tuttavia, alcuni erbivori che sono resistenti alla canavanina poiché l’enzima arginina tRNA ligasi non la riconosce correttamente.