Appunti Biotecnologie genetico-molecolari

Biotecnologie genetico-molecolari

Le metodologie genetico molecolari sono in uso nei laboratori moderni di controllo qualità, di ricerca e sviluppo e di ricerca e innovazione. Importante è capire l'impatto che ha un microrganismo in un processo produttivo, pur mantenendo le caratteristiche di sicurezza. Queste metodologie sono importanti per mettere a punto un processo che permette di realizzare un nuovo prodotto. Spetta al ricercatore dimostrare con tutte le tecniche che un determinato microrganismo sia sicuro per l'ambito alimentare. Tutte le metodologie permettono di raggiungere gli obiettivi in tempi idonei.

La cellula procariota come modello di studio e applicazione

Lo sviluppo delle tecniche genetico-molecolari si è avuto a partire dal modello della cellula procariota (cellula più semplice che ha permesso di conoscere molte caratteristiche anche a livello genetico-molecolare):

• Ha un solo cromosoma (rispetto ai 2n degli eucarioti): si parla di DNA a doppio filamento (DNA cromosomale). È sempre a doppio filamento ma la differenza sta nel fatto che quello dei batteri è una molecola circolare covalentemente chiusa (3CCC). Questa molecola contiene tutte le informazioni per vivere e sopravvivere in determinati ambienti. È di circa 4 milioni di paia di basi nucleotidiche e la si ritrova super avvolta. Il riavvolgimento e il disavvolgimento della molecola è un processo molto guidato dalla cellula, perché essa necessita poi di aprire tale "gomitolo" chiuso per poter svolgere le sue funzioni vitali.
• Ha plasmidi: molti batteri possono possedere anche molecole di DNA extracromosomale, note come plasmidi. Essi hanno la caratteristica di essere in grado di replicarsi in maniera autonoma rispetto al DNA cromosomale (che si replica solo quando la cellula è in grado di dividersi e riprodursi). Si possono infatti osservare coppie dello stesso plasmide all'interno di una stessa cellula. I plasmidi devono essere compatibili con la cellula che li possiede perché necessitano di una proteina che verrà data da questa cellula. In determinate situazioni possono entrare nel cromosoma batterico e fare parte di questo (plasmidi episomi) e in questo caso non si replicano autonomamente ma in sincronia con il cromosoma stesso. Un episoma può separarsi dal cromosoma e tornare a replicarsi autonomamente.

I plasmidi contengono informazioni aggiuntive necessarie alla cellula quando si trova in particolari situazioni ambientali non più idonee (informazioni accessorie). Alcuni plasmidi:

• Codificano per fattori di virulenza batterica (possiedono informazioni per la produzione di tossine, adesine e batteriocine);
• Contengono fattori R: conferiscono resistenza agli antibiotici. I microrganismi sono quindi veicoli di antibiotico-resistenza. Bisogna capire se l’antibiotico-resistenza è portata a livello plasmidico o cromosomale. Nel secondo caso non viene trasmessa alla cellula vicina, nel primo caso invece i plasmidi possono entrare nella cellula vicina (plasmidi = elementi genetici mobili);

Vengono definiti elementi genetici mobili perché una cellula può quindi acquisire o perdere un plasmide, in presenza o assenza di una pressione selettiva. Poiché la cellula non può sprecare energia quando si trova in condizioni di scarsa energia e se non ha bisogno delle informazioni a livello plasmidico, può fare uscire il plasmide. Viceversa, una cellula vicina in condizioni difficoltose cercherà di acquisire tale plasmide. Per queste caratteristiche, i plasmidi vengono tutt'ora impiegati come vettori di informazioni da una cellula all'altra tramite un processo controllato, che permette così di avere dei vantaggi. Anche i plasmidi sono in conformazione CCC (sempre a doppio filamento).

Oggigiorno si conoscono molte tipologie di cellula diverse proprio perché la cellula procariota si è adattata velocemente e facilmente alle diverse condizioni ambientali. Due domini su tre (Bacteria, Archaea e Eukarya) sono costituiti da cellule procariote: Archaea e Eukarya. Gli Archeobatteri sono definiti microrganismi estremofili, trovati nei ghiacciai e a bassissimi pH (hanno membrana che consente loro di adattarsi a questi ambienti estremi).

Teoria dell’endosimbiosi: afferma che la cellula eucariote è nata dalla simbiosi tra due cellule procariote, che in quel momento si trovavano vicine in ambiente sfavorevole. L'evidenza scientifica sta nel fatto che mitocondri e cloroplasti contengono DNA e ribosomi correlabili a quelli dei batteri.

Per costruire l’albero filogenetico si è dovuto ricercare un “orologio molecolare”, ovvero una molecola presente comunemente dai microrganismi ancestrali fino ad oggi, e che nel corso dell’evoluzione avesse subito pochissime evoluzioni (questo permette di costruire anche la distanza evolutiva). Per adattarsi la cellula deve subire una modificazione delle sue caratteristiche a livello di DNA. Per lo più avviene a seguito di una pressione selettiva dettata dall'habitat stesso.

L’orologio molecolare “target” è l’RNA ribosomale 16S (rRNA 16S). L'S sta per coefficiente di sedimentazione dei ribosomi. Questo è presente in tutte le cellule, a partire dal progenitore comune. I ribosomi batterici sono organelli di produzione di proteine (processo di trasduzione) e sono costituiti da due subunità che si collegano quando deve avvenire la sintesi proteica. L’mRNA si lega nel sito per dare inizio alla trasduzione. Le due subunità sono il 30S e il 50S (il ribosoma interno è di 70S). All’interno della subunità 30S si trova l’unità 16S. mentre nella 50S c'è l'unità ribosomale 23S. A parità di informazioni, è meglio usare l’unità più corta.

Scopo della cellula: vivere e riprodursi, colonizzando un determinato ambiente. Così sono in grado di mantenere la propria progenie nel tempo (per fare ciò deve scambiare materia ed energia con l’ambiente). L’evoluzione, dove le condizioni ambientali sono tali da ridurre drasticamente le possibilità di sopravvivenza, comporta la capacità di compiere dei processi di ricombinazione genetica, allo scopo di acquisire qualche caratteristica fenotipica utile (ricordiamo che i batteri non sono in grado di compiere una riproduzione sessuale).

Quindi, la capacità di vivere e riprodursi portano allo svolgimento di tre fondamentali processi: replicazione del DNA, trascrizione in RNA messaggero e trasduzione in fenotipo. Questi sono stati utilizzati come modello per far effettuare alle cellule in vitro ciò che avviene naturalmente.

Fasi

• Trasformazione: prevede che una cellula, venuta casualmente a contatto con del DNA esterno, possa acquisirne una parte. Questo è un processo guidato, ovvero la cellula deve entrare in uno stato di competenza per attirare una serie di proteine, responsabili della cattura del DNA all’interno della cellula e della sua integrazione nel cromosoma. La trasformazione può avvenire anche tramite dei plasmidi che potrebbero essere poi integrati all’interno della cellula ospite (fenomeno comunque raro in natura). Il vantaggio di poter effettuare questo in laboratorio è che il plasmide non ha bisogno di siti (regioni omologhe) per integrarsi nel DNA cromosomale della cellula ospite ma rimangono liberi come entità autoreplicanti.
• Coniugazione: plasmide F (o plasmide coniugativo) che codifica per la produzione del pilo F (o pilo coniugativo) con il quale si riesce ad avere un contatto tra cellula donatrice e ricevente (si forma un ponte coniugativo, attraverso il pilo F, tra le due cellule). Il plasmide con questo pilo ha anche le caratteristiche di un episoma. La cellula che possiede il pilo F viene chiamata F+, mentre quella che non possiede il plasmide, viene chiamata F-. Quando il pilo prodotto da F+ prende contatto con la F-, instaura il processo della coniugazione. Il pilo F è una struttura cava, attraverso la quale può passare uno dei due filamenti di cui è costituito il plasmide F. Quest’ultimo quindi, in un punto specifico rompe i legami di un filamento e permette lo srotolamento di uno dei due filamenti di cui è costituito, che poi passerà all’interno del pilo F nella cellula ricevente (fenomeno di “rollin circle”). Con questo processo la cellula F- ha acquisito la capacità di produrre il pilo F e di creare un ponte coniugativo (diventa una F+). Con questo processo, inoltre, non si hanno grandi modificazioni (variabilità). La vera modificazione si ha quando il pilo F non è presente libero nella F+ ma è presente come episoma (inserito in un sito specifico del cromosoma batterico). Le cellule con il plasmide F nel DNA cromosomale, si chiamano Hfr (alta frequenza di ricombinazione). Ciò perché, quando avviene il contatto tra F+ e F- e si forma il ponte coniugativo, il plasmide F (anche se incorporato nel cromosoma) induce la rottura di un filamento e il suo srotolamento. Questo srotolamento avviene a partire da un punto specifico del plasmide (oriT). In teoria, tutto quello che è legato al plasmide passa come singolo filamento nella cellula ricevente (quindi se il plasmide F è legato al DNA cromosomale, durante lo srotolamento passa il plasmide F e tutto un filamento del DNA cromosomale a cui è legato tale plasmide). Ciò però non avviene in natura perché il contatto tra le cellule avviene in un tempo molto breve, che quindi consente il passaggio di una sola porzione discreta del DNA della cellula donatrice. In questo caso, quando il plasmide è legato al cromosoma e incomincia lo srotolamento, non riusciranno a passare tutto il plasmide e tutto il DNA cromosomale, perché il contatto termina prima (la cellula ricevente acquista solo una porzione). Quindi le cellule possono essere “Hfr + F+” e “Hfr + F-”. Ciò dipende da dove il plasmide F si inserisce a livello del DNA cromosomale: oriT: punto srotolamento IS3: porzione di sequenza che trova omologia sul DNA cromosomale per l’integrazione. Se il plasmide si integra in IS3, esso si linearizza ma il suo punto di inizio di srotolamento, non si trova all’inizio del plasmide, ma nel DNA cromosomale si trova integrato circa alla metà della sua sequenza. Di conseguenza, quando si forma il ponte coniugativo, il plasmide si apre in oriT e lo srotolamento procede verso sinistra. Entra nella cellula quindi solo una porzione e segue poi una porzione del DNA cromosomale della cellula. Poiché il contatto è breve, solo una piccola parte del DNA cromosomale, insieme ad una frazione del plasmide F potrà entrare nella cellula ricevente. Quest’ultima diventa quindi →Hfr+ (anche se è ricevente F-) diventa una cellula modificata. Questo porta le cellule ad avere due destini diversi a seconda da dove si trovi l’origine di srotolamento (oriT) rispetto all’origine di inserzione (IS3). Ciò è stato studiato per i Gram negativi, nei positivi non è stata studiata la presenza del plasmide F. Al contrario, nei positivi può avvenire un contatto diretto tra le cellule per l’emissione di feromoni (emessi dalla cellula ricevente che si trova in condizioni di stress). I feromoni producono una molecola aggregante che favorisce la formazione di un canale e che fa passare una copia di un plasmide coniugativo alla cellula ricevente (trasferimento genico orizzontale). La cellula viene spinta a compiere tali processi solo quando si trova in condizioni avverse.
• Trasduzione: trasferimento di frammenti di DNA cromosomale mediato un batteriofago (o fago) trasducente. Il fago (come tutti i virus) è un parassita intracellulare obbligato e quindi compie il ciclo vitale all’interno di una cellula ospite che riconosce e che è in grado di sopportare la crescita del fago una volta entrato in essa. Il fago ha una testa poliedrica (capside), all’interno della quale è compattato il genoma virale, che è collegata ad una coda che possiede delle fibre (organi di adesione alla cellula ospite). Il fago non entra con tutto il corpo ma inietta all’interno della cellula ospite il proprio genoma (nel ciclo precedente ha infatti incorporato nel capside, che sarebbe la testa, anche un po’ di lisozima prodotto dalla cellula infettata precedentemente). In funzione del loro genoma riescono ad indurre la cellula bersaglio a compiere un ciclo riproduttivo:

• Ciclo litico: replicazione genoma virale e sintesi proteine necessarie al fago per ricostruire le particelle fagiche che fuoriusciranno dalla cellula, a seguito di una lisi. Si chiamano fagi litici. Questo viene chiamato trasduzione generalizzata. Mentre compie il ciclo, all’interno della cellula bersaglio vi sono i componenti e si stanno replicando tante copie del DNA fagico che daranno origine a capsidi, code, ecc. quando avviene l’assemblaggio, il fago assembla il genoma nel capside, insieme ai componenti prodotti dalla cellula. Può succedere però che un componente della cellula entri nel capside al posto del genoma fagico (il fago non riconosce ciò che è entrato nel capside). In questo caso si forma comunque la particella virale che fuoriuscirà dalla cellula lisata, chiamata “particella virale errante”. Essa riuscirà comunque ad andare ad infettare → (recettori del fago ma DNA non virale) inietterà quello che pensa sia il suo genoma ma entrerà semplicemente un pezzo di DNA cromosomale della cellula precedente);
• Ciclo lisogeno: effettuata da fagi temperati, in quanto hanno una relazione momentaneamente non mortale con la cellula ospite. Il loro genoma ha DNA ed enzima che sia in grado di trascriverlo nel corrispondente DNA. Questo DNA virale riesce ad entrare nel DNA cromosomale della cellula ospite (in un punto in cui vi è omologia). Fino a quando il DNA fagico è incorporato nel DNA cromosomale, la cellula vive normalmente. Questa situazione di lisogenia può perdurare per tanti cicli riproduttivi della cellula infettata (che trasferisce anche alle cellule figlie il proprio genoma, che contiene anche il DNA fagico incorporato). Può succede però che eventi esterni (non ancora molto conosciuti) possano causare la scissione del DNA fagico dal DNA cromosomale e ciò può avvenire in tutte le cellule figlie nelle quali si era replicato il DNA fagico. In questo caso si instaura immediatamente un ciclo litico (genoma virale libero che induce subito le fasi del proprio ciclo riproduttivo che porterà la cellula alla morte).

Quando si parla di lisogenia, si parla anche di ceppi lisogenici (ceppo che ha inserito nel proprio DNA, un DNA fagico), identificato con diversi metodi di laboratorio (non si conoscono i meccanismi che portano al ciclo lisogeno). Si cerca quindi di isolare ceppi naturalmente resistenti a quella famiglia di fagi che può infettare quella determinata specie. Il ceppo può essere reso resistente con la secrezione di sostanze che vanno a ricoprire la parete cellulare (strato extra parietale noto come capsula) e che impediscono quindi l’adesione del fago (la capsula va a “nascondere” i siti dei recettori a livello della parete, responsabili del riconoscimento del fago). Un altro modo è quello di degradare il genoma virale entrato nella cellula attraverso la secrezione di enzimi di restrizioni (endodesossiribonucleasi). Questi tagliano il DNA fagico in punti specifici riconosciuti. A volte però i fagi riescono a superare questi “ostacoli” e a dar comunque luogo ad un’infezione. Anche nel caso del ciclo lisogenico può avvenire uno sbaglio e questo viene chiamata trasduzione specializzata. Il fago temperato si inserisce sempre in un determinato punto del DNA cromosomale della cellula ospite. Non si conoscono i due geni che stanno a monte e a valle dell’inserimento. In ogni caso, se si ha la scissione del DNA fagico, può avvenire uno sbaglio nel distacco e quindi, un pezzo del DNA cromosomale può staccarsi insieme al DNA fagico. Ciò dà luogo al ciclo litico e la cellula muore. Il fago con DNA fagico modificato può instaurare un altro ciclo lisogenico in un’altra cellula bersaglio. Quando avviene ciò il DNA fagico si integra in quello della cellula e i geni virale vengono riconosciuti e bloccati. Il pezzo di DNA cromosomale in più portato dal fago non verrà riconosciuto e bloccato dalla cellula (la ospite lo riconosce come proprio). La nuova cellula ospite potrà in questo modo esprimere i geni della cellula precedente.

Ciclo vitale di una cellula

Tre fondamentali processi: replicazione del DNA, la sua trascrizione in RNA messaggero e infine, la traduzione in fenotipo a livello dei ribosomi cellulari.

DNA

Costituito da basi azotate:

• Pirimidine: citosina, timina (uracile se RNA);
• Purine: adenina e guanina.

Il DNA è una molecola a doppio filamento: tenuto insieme da legami a idrogeno che si formano tra le basi complementari nei due filamenti. La complementarità è data dalle basi azotate complementari G e C; A e T. I legami a idrogeno sono due per A e T, mentre sono 3 per G e C. I due filamenti sono anche antiparalleli (hanno due direzioni diverse). Una è 5’-3’, l’altra 3’-5’. Il 3’ rappresenta il gruppo OH libero del desossiribosio, al quale durante la replicazione si lega la successiva base azotata (formando la base nucleotidica).

RNA

Nella cellula c'è poi l’RNA che si differenzia dal DNA per la presenza dell’uracile al posto della timina e perché è a singolo filamento. Noi conosciamo 3 diverse molecole di RNA con funzioni specifiche:

• mRNA (messaggero): prodotto durante il processo della trascrizione delle informazioni genetiche (intermediario tra informazione genetica e manifestazione del fenotipo);
• rRNA (ribosomale): importante perché è un costituente