Appunti Basi biologiche e metodi per le bionanotecnologie

Basi biologiche e metodi delle bionanotecnologie

Introduzione

Possiamo definire la biologia come lo studio scientifico degli organismi viventi, orientato a comprendere la complessità dei processi vitali e la vastissima diversità biologica. Tale analisi si articola su molteplici livelli gerarchici di organizzazione, i quali collegano in modo lineare le molecole, le cellule, i tessuti, gli organismi e, infine, la complessità sistemica degli ecosistemi.

La proprietà fondamentale della vita emerge in modo peculiare proprio a livello della cellula, che si configura come la più piccola unità strutturale e funzionale dei viventi. Questo concetto cardine è sancito dalla Teoria Cellulare, i cui postulati stabiliscono che tutti gli organismi sono costituiti da una o più cellule e che ogni cellula deriva esclusivamente dalla divisione di una cellula preesistente (“omnis cellula e cellula”).

Sotto il profilo morfologico, la microscopicità cellulare, generalmente compresa tra 1 e 100 micrometri, risponde alla necessità termodinamica di mantenere un elevato rapporto area/volume, ottimizzando così gli scambi metabolici attraverso la membrana.

Per definire la vita sotto il profilo biologico, dobbiamo comprendere che essa è una proprietà emergente, ossia una caratteristica che un sistema chimico manifesta esclusivamente quando i suoi componenti ordinari raggiungono un determinato livello di organizzazione molecolare. Nonostante l'immensa biodiversità, stimata in circa 8,7 milioni di specie, esistono otto caratteristiche universali che accomunano ogni forma di vita:

• L'organizzazione cellulare: l'architettura biologica basata su unità cellulari;
• Il metabolismo: l'insieme coordinato delle reazioni chimiche cellulari, suddiviso nelle vie esoergoniche del catabolismo, degradazione di molecole complesse per liberare energia, come nella glicolisi, e in quelle endoergoniche dell'anabolismo, biosintesi che richiede energia. La “valuta” energetica che accoppia queste vie è la molecola di ATP;
• L'informazione genetica: il possesso di istruzioni chimiche ereditabili codificate nel DNA;
• La risposta agli stimoli e l'adattamento: la capacità di percepire le fluttuazioni ambientali e reagire modificando le proprie attività per ottimizzare la sopravvivenza, come si osserva nella chemiotassi batterica o nel fototropismo;
• La regolazione e l'omeostasi: il mantenimento attivo di uno stato chimico-fisico interno stabile e costante tramite sistemi di feedback, come i meccanismi di costrizione o dilatazione dei vasi sanguigni e di sudorazione per la termoregolazione;
• Lo sviluppo e la crescita: un processo in cui la crescita determina l'aumento delle dimensioni mediante assimilazione di nutrienti, mentre lo sviluppo scandisce la successione di cambiamenti morfologici programmati nel ciclo vitale;
• La riproduzione: la facoltà di generare una discendenza per via asessuata, da un singolo genitore, senza variabilità, o per via sessuata, tramite fusione di gameti di due genitori distinti;
• L'evoluzione: il mutamento genetico delle popolazioni nel tempo guidato dalla selezione naturale darwiniana, che premia i fenotipi più adatti a un determinato contesto, come dimostrato dal fenomeno del melanismo industriale in Biston betularia.

Ogni funzione vitale è subordinata al flusso dell'informazione biologica, governato dal Dogma centrale della biologia. L'informazione chimica è conservata stabilmente nella sequenza lineare dei nucleotidi del DNA. Attraverso il processo di trascrizione, questa informazione viene copiata in un filamento intermedio di mRNA, il quale viene successivamente tradotto a livello dei ribosomi. Qui, la sequenza nucleotidica originaria determina l'esatto ordine di assemblaggio degli amminoacidi per la sintesi delle proteine, che operano come gli effettori funzionali della cellula.

Sotto il profilo topologico, il genoma umano presenta una lunghezza lineare di circa due metri. Per poter essere racchiuso all'interno di un nucleo cellulare confinato in uno spazio di appena 6-8 micrometri, il DNA deve necessariamente subire un massivo processo di condensazione mediato da specifiche proteine strutturali.

Analizzando, invece, la composizione chimica della materia vivente, emerge che oltre il 96% della massa degli organismi è costituito da soli sei elementi a basso peso atomico: carbonio, idrogeno, azoto, ossigeno, fosforo e zolfo. L'acqua rappresenta il solvente biologico preponderante, circa il 70% del peso, mentre la restante quota secca è dominata dalle macromolecole biologiche. Esse sono polimeri formati dall'unione di unità monomeriche ripetute, interconnesse mediante legami covalenti che si generano tipicamente attraverso reazioni di condensazione.

Possiamo articolare la loro struttura e formazione in quattro classi distinte:

• I carboidrati, o polisaccaridi: sono molecole costituite da carbonio, idrogeno e ossigeno. I loro monomeri sono i monosaccaridi, chimicamente classificati in pentosi, a 5 atomi di carbonio, come il ribosio e il deossiribosio costitutivi degli acidi nucleici, ed esosi, a 6 atomi di carbonio, come il glucosio, il fruttosio e il galattosio. La loro unione avviene tramite la formazione di un legame glicosidico covalente tra i gruppi ossidrilici (–OH) dei monomeri, con l'eliminazione di una molecola d'acqua. Strutturalmente, la geometria di questo legame ne determina la funzione: i legami alpha-glicosidici formano polimeri elicoidali e facilmente idrolizzabili deputati alla riserva energetica, come l'amido nei vegetali e il glicogeno ramificato negli animali; i legami beta-glicosidici generano invece catene lineari stabili e insolubili con funzione di sostegno strutturale, come la cellulosa della parete cellulare vegetale;
• Le proteine: sono polimeri lineari di amminoacidi uniti covalentemente da un legame peptidico. Ogni amminoacido presenta una struttura fissa: un atomo di carbonio-α centrale legato a un atomo di idrogeno, a un gruppo amminico, a un gruppo carbossilico e a una catena laterale, o gruppo R, variabile. Il legame peptidico si stabilisce specificamente tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il gruppo amminico dell'amminoacido successivo, liberando acqua. Le catene laterali R conferiscono l'identità chimica, dividendo gli amminoacidi in polari, apolari, idrofili o idrofobici, e guidano il ripiegamento della proteina nella sua conformazione nativa attraverso quattro livelli strutturali: la struttura primaria, la sequenza lineare amminoacidica; la struttura secondaria, ripiegamenti regolari locali come l'alpha-elica o il beta-foglietto, stabilizzati da legami a idrogeno; la struttura terziaria, la conformazione tridimensionale globale guidata da interazioni idrofobiche, ponti disolfuro e legami ionici tra i gruppi R; la struttura quaternaria, l'unione funzionale di più subunità polipeptidiche distinte;
• I lipidi: rappresentano una classe eterogenea di molecole idrofobiche e non polari che, a differenza delle altre macromolecole, non formano polimeri lineari ad alto peso molecolare. Le tre categorie principali sono: i trigliceridi, formati da una molecola di glicerolo legata covalentemente a tre catene di acidi grassi tramite legami estere, deputati all'accumulo energetico a lungo termine e all'isolamento termico; gli steroidi, caratterizzati da una struttura idrocarburica a quattro anelli fusi, come il colesterolo, che fungono da modulatori della fluidità di membrana e precursori ormonali; e i fosfolipidi. Questi ultimi presentano una struttura fortemente anfipatica: una “testa” polare idrofila, contenente un gruppo fosfato legato al glicerolo, e due “code” di acidi grassi apolari e idrofobiche. Questa peculiare asimmetria chimica fa sì che, in ambiente acquoso, i fosfolipidi si organizzino spontaneamente in un doppio strato, costituendo la matrice strutturale di tutte le membrane biologiche;
• Gli acidi nucleici: sono polimeri lineari di nucleotidi deputati alla conservazione e all'espressione dell'informazione genetica. Ciascun nucleotide è strutturato da tre componenti: uno zucchero pentoso, ribosio o deossiribosio, un gruppo fosfato e una base azotata. La polimerizzazione avviene mediante la formazione di un legame fosfodiesterico, un ponte covalente in cui il gruppo fosfato funge da giunzione tra il carbonio 5' di uno zucchero e il carbonio 3' dello zucchero adiacente, costituendo lo scheletro portante della molecola. Negli organismi troviamo il DNA, acido deossiribonucleico, strutturato in una doppia elica stabilizzata da legami a idrogeno complementari tra le basi azotate, adenina, guanina, citosina e timina, che funge da archivio stabile del genoma, e l'RNA, acido ribonucleico, generalmente a singolo filamento, che funge da intermediario dinamico per consentire la sintesi proteica.

Virus, cellula procariota, cellula eucariota

Nell'affrontare lo studio delle basi biologiche emerge un quesito fondamentale di natura sia cronologica che filogenetica: l'origine della vita sul nostro pianeta. Considerando che l'Universo ha un'età stimata di circa 13 miliardi di anni e la Terra si è consolidata circa 4,5 miliardi di anni fa, i reperti fossili testimoniano che le prime forme di vita sono comparse in un intervallo compreso tra 3,7 e 4,1 miliardi di anni fa.

Tale evidenza cronologica dimostra inequivocabilmente che la vita non è sempre esistita, sollevando il problema scientifico di come essa sia potuta derivare da una matrice prebiotica non vivente. Storicamente, la comprensione di questo fenomeno è stata a lungo ostacolata dalla teoria della generazione spontanea, risalente ad Aristotele, secondo la quale i piccoli organismi potevano originarsi ex nihilo dalla materia in putrefazione sotto l'influenza di fattori ambientali quali il sole o il fango.

Questa concezione è stata smentita mediante il rigore del metodo sperimentale. Nel 1668, si dimostrò, tramite l'utilizzo di barattoli contenenti carne sigillati o schermati con garza, che le larve di mosca derivavano esclusivamente dalla deposizione di uova e non dalla degradazione spontanea della materia. Successivamente, nel 1860, Louis Pasteur estese tale confutazione ai microrganismi mediante l'esperimento dei palloni a collo di cigno.

Curvando il collo del matraccio a forma di “S”, Pasteur permise il passaggio dell'aria ma intrappolò i contaminanti batterici nel condotto; la perfetta sterilità del brodo nutritivo, mantenuta fino alla rottura intenzionale del collo stesso, sancì il dogma biologico secondo cui, nelle attuali condizioni planetarie, la vita si genera esclusivamente dalla vita preesistente.

Sebbene nelle attuali condizioni ambientali la materia vivente non si generi dal nulla, l'atmosfera della Terra primordiale presentava caratteristiche marcatamente differenti, configurando uno scenario violento e riducente, privo di ossigeno libero e saturo di anidride carbonica, azoto, idrogeno, idrogeno solforato e monossido di carbonio. In questo contesto si accumulò il cosiddetto brodo primordiale, una miscela acquosa di sali inorganici e composti chimici semplici a base di carbonio.

La transizione cruciale dalla non-vita alla vita è spiegata dal concetto di evoluzione chimica, la cui plausibilità scientifica è stata validata negli anni '50 dal celebre esperimento di Miller-Urey. Ricreando all'interno di un circuito chiuso l'atmosfera primitiva sottoposta a calore e a scariche elettriche ad alta tensione simulanti i fulmini, gli scienziati constatarono la sintesi spontanea di biomolecole fondamentali presenti nelle cellule odierne, tra cui amminoacidi, zuccheri e basi azotate puriniche e pirimidiniche.

Il passaggio successivo risiede nella polimerizzazione di queste subunità in macromolecole, evento guidato, secondo l'ipotesi più accreditata, dal paradigma dell'RNA World. L'acido ribonucleico, infatti, possiede l'intrinseca capacità sia di conservare l'informazione genetica sia di catalizzare reazioni chimiche in qualità di ribozima. Si presume che la prima cellula primordiale, o protocellula, abbia avuto origine nel momento in cui una molecola di RNA autoreplicante sia stata compartimentata all'interno di una membrana composta da fosfolipidi.

Da questa evoluzione chimica è scaturita l'evoluzione biologica, che per oltre l'80% della storia evolutiva ha visto la presenza esclusiva di procarioti unicellulari nei mari primitivi, prima della transizione verso gli eucarioti e gli organismi multicellulari. L'analisi comparativa dei viventi evidenzia marcate somiglianze strutturali, biochimiche e genetiche che suggeriscono la discendenza da un antenato comune universale, denominato L.U.C.A. (Last Universal Common Ancestor).

Sulla base dei criteri filogenetici proposti da Carl Woese, la classificazione dei viventi si articola in tre domini fondamentali e sei regni: i domini dei procarioti Bacteria e Archaea, e il dominio Eucarya, che ricomprende i regni di Protisti, Funghi, Piante e Animali. Il motore di questa immensa diversificazione risiede nei meccanismi evolutivi, storicamente spiegati da diversi paradigmi teorici:

• La teoria gradualista di Darwin, la quale postula che l'evoluzione proceda mediante un accumulo lento e costante di modificazioni ereditarie, guidate dalla selezione naturale che premia i fenotipi più adatti nella competizione per la sopravvivenza;
• La teoria del saltazionismo, o degli equilibri intermittenti, introdotta da Stephen Jay Gould negli anni '70, che propone un andamento non lineare, caratterizzato da brevi periodi di speciazione repentina alternati a lunghi periodi di stasi evolutiva; tale teoria fornisce una solida spiegazione alla mancanza di forme di transizione nella documentazione fossile;
• Il Neodarwinismo, o sintesi moderna, che integra la selezione naturale darwiniana con la genetica molecolare, definendo l'evoluzione come il cambiamento delle frequenze alleliche in una popolazione, determinato da mutazioni casuali causate da errori nella replicazione del DNA e dalla ricombinazione genica tramite il crossing-over meiotico.

In questo panorama, i virus occupano una posizione di incerta classificazione biologica, venendo esclusi dall'albero dei tre domini poiché privi di una struttura cellulare e di un metabolismo autonomo. Definiti efficacemente dall'immunologo Peter Medawar come “una brutta notizia avvolta in una proteina”, i virus sono parassiti endocellulari obbligati di dimensioni submicroscopiche, compresi tra i 20 e i 300 nanometri.

Essi mancano totalmente di ribosomi ed enzimi metabolici; pertanto, per replicarsi, devono necessariamente infettare una cellula ospite e dirottarne i macchinari biochimici. Sotto il profilo strutturale, la particella virale isolata ed infettante prende il nome di virione. La sua architettura minima prevede un nucleo o core contenente il genoma virale, a DNA o RNA, racchiuso in un guscio proteico protettivo denominato capside; l'insieme di questi due elementi costituisce il nucleocapside.

In alcune famiglie virali, il capside è ulteriormente rivestito da una membrana lipidica esterna detta pericapside o envelope, acquisita per gemmazione dalla membrana plasmatica della cellula ospite e arricchita da spicole glicoproteiche virali essenziali per il riconoscimento cellulare. I virus mostrano una straordinaria eterogeneità, sia per la simmetria del capside, che può essere elicoidale, icosaedrica o complessa, sia per il genoma, classificato secondo la Classificazione di Baltimore.

Questa suddivide i virus in base alla natura del loro acido nucleico e alla strategia di produzione dell'mRNA, distinguendo i virus a DNA, a doppio filamento dsDNA o singolo filamento ssDNA, e i virus a RNA, a doppio filamento dsRNA, singolo filamento positivo ssRNA+ direttamente fungibile come mRNA, e singolo filamento negativo ssRNA- che richiede un filamento complementare positivo.

I meccanismi di infezione virale dipendono strettamente dall'adesione, ovvero dall'interazione stereospecifica tra le proteine di superficie del virus e i recettori specifici espressi sulla membrana della cellula ospite, determinando un'elevata selettività e il fenomeno dello spillover. Due modelli patogenetici di assoluto rilievo clinico possono essere:

• Il modello dei Coronavirus, es. SARS-CoV-2: si tratta di virus a RNA a singolo filamento positivo, ssRNA+, dotati di envelope. L'adesione cellulare è mediata dalle glicoproteine esterne denominate proteine Spike (S), le quali riconoscono e si legano selettivamente al recettore cellulare ACE2 situato sulla membrana della cellula ospite. In seguito all'interazione con la proteasi cellulare TMPRSS2, che si occupa del priming della proteina Spike, avviene la penetrazione del virus e il rilascio del genoma a RNA nel citosol, dove, essendo a polarità positiva, viene direttamente tradotto dai ribosomi cellulari per la sintesi delle proteine virali;
• L'HIV è un virus animale a RNA a singolo filamento, caratterizzato dalla presenza nel virione dell'enzima trascrittasi inversa. Il ciclo riproduttivo inizia quando la glicoproteina pericapsidica gp120 interagisce specificamente con il recettore CD4 espresso sulla superficie dei linfociti T helper. In seguito alla fusione dell'involucro virale con la membrana plasmatica e alla spoliazione del capside, l'RNA virale viene rilasciato nel citosol. Qui la trascrittasi inversa opera una sintesi enzimatica convertendo l'RNA a singolo filamento in un DNA a doppio filamento, cDNA, il quale trasmigra nel nucleo e si integra stabilmente nel cromosoma dell'ospite sotto forma di provirus. A questo punto il virus si garantisce un'infezione latente, rimanendo quiescente come serbatoio inamovibile, oppure attiva l'infezione cronica o attiva, dirigendo la sintesi di nuovi mRNA e proteine virali che si assemblano ed escono per gemmazione, portando nel tempo a un esito fatale per la cellula e per