Analisi enochimiche

ANALISI ENOCHIMIC HE

1.0 DETERMINAZIONE DEL GRADO ALCOLICO

→ Titolo alcolometrico volumico effettivo (CEE) (Gradazione alcolica o grado alcolico o alcol svolto): il

titolo alcolometrico effettivo effettivo è definito come parti in volume di alcol puro alla temperatura di 20°C

contenuto in 100 parti in volume del vino.

→ Titolo alcolometrico volumico potenziale (Alcol da svolgere): il titolo alcolometrioco volumico

potenziale è definito come parti in volume di alcol puro alla temperatura di 20°C che possono essere prodotti

dalla fermentazione totale degli zuccheri contenuti in 100 parti in volume del vino.

→ Titolo alcolometrico volumico totale (Grado alcolico complessivo): il titolo alcolometrico volumico

totale è la somma della gradazione alcolica effettiva e potenziale.

Titolo Alcol .Volumico Totale=Titolo Alcolo . Volumico effettivo−Titolo Alcol , Volumico potenziale

1.0.1 FERMENTAZIONE ALCOLICA

Si dice fermentazione alcolica la trasformazione biochimica del glucosio e del fruttosio in alcol etilico e

anidride carbonica secondo l'equazione:

+2CO ∗2

C H O →2 CH CH OH ATP(Glicolisi)

6 12 6 3 2 2

Nel caso di una fermentazione riguardante il vino, non si ha una fermentazione alcolica pura, in quanto una

certa porzione di molecole di zucchero vengono degradate per fermentazione glicero – piruvica.

Nella fermentazione alcolica l'acido piruvico che si forma in seguito alla glicolisi viene decarbossilato e

l'acetaldeide viene ridotta in alcol per mezzo del NADH che si era precedentemente formato

2

dall'ossidazione della gliceraldeide-3-fosfato.

I prodotti principali della fermentazione alcolica:

Etanolo, Glicerolo , Acetaldeide e Acido Succinico

Tra i prodotti secondari della fermentazione alcolica ci sono:

 Alcoli superiori: tra i prodotti secondari della fermentazione alcolica ci sono alcoli con pesi

molecolari ed ebollizione superiore a quelli dell’etanolo (ad eccezione del metanolo). Hanno

caratteristiche aromatiche molto importanti.

Gli alcoli superiori derivano da trasformazioni a carico degli amminoacidi:

1

Questi alcoli possono andare incontro a una reazione di esterificazione, in particolare con acido

acetico con la formazione di esteri acetati che possono essere molto apprezzati nel vino perché

danno vita a note fruttate.

Alcuni lieviti hanno enzimi detti esterasi che scindono il legame tra R – COOR’ con la produzione di

un alcol e un acido carbossilico.

 Acidi carbossilici: più di cento acidi carbossilici sono prodotti durante la fermentazione alcolica,

molti sono già presenti nel mosto o ritrovati come modificazioni di questi ultimi.

1.1 METODO DENSIMETRICO (ESPERIENZA 1 IN LABORATORIO)

La determinazione del grado alcolico per via densimetrica sfrutta la diversa densità di soluzioni idroalcoliche

a diversa concentrazione.

L’acqua ha una densità a 20°C pari ad 1.

L’alcol puro, nelle medesime condizioni, ha invece una densità pari a 0,789.

Di conseguenze le soluzioni idroalcoliche avranno una densità compresa tra i due valori.

Anche se il vino è una soluzione prevalentemente idroalcolica, non si può misurare direttamente la sua

densità in quanto sono presenti in soluzione diversi composti interferenti quali zuccheri residui, sali,

amminoacidi e polifenoli.

Per questo motivo è necessario eliminarli per procedere alla determinazione del grado alcolico.

Si esegue, quindi, una distillazione che permette la separazione della miscela idroalcolica dagli interferenti.

Il metodo densimetrico consta di due fasi:

 Distillazione del campione in esame

 Misura densimetrica del distillato

A questo punto, per mezzo di apposite tabelle dalla densità del distillato si risale al grado alcolico.

1.1.1 STRUMENTI E SOSTANZE UTILIZZATE

Per determinare il grado alcolico con il metodo densimetrico si utilizzano come strumenti:

 Distillatore Elettronico Enochimico (D.E.E.) Gibertini.

 Bilancia idrostatica elettronica (Gibertini).

 Bagno termostatico a 20°C.

 Matraccio da 100 mL Gibertini (tipo Kohlrauch).

 Cilindro Gibertini con intercapedine.

Mentre i reagenti sono:

 Latte di calce: CaO al 12% in H O

2

 Antischiuma siliconico al 2% in H O

2 2

1.1.2 PROCEDIMENTO

Per determinare il titolo alcolometrico con il Metodo Densimetrico bisogna:

1) Per prima cosa occorre decarbonicare il campione in esame (è sufficiente filtrarlo su un filtro a

pieghe) in quanto la CO presente, passando nel distillato come acido carbonico, porterebbe ad un

2

incremento della densità del distillato stesso e quindi ad una diminuzione del grado alcolico.

Questa procedura si può non impiegare nel caso di analisi sui vini fermi.

2) Si pongono 100 mL di campione nel matraccio tarato Gibertini e si versano successivamente

nell’ampolla del distillatore, sciacquando accuratamente il matraccio stesso più volte con acqua

distillata.

3) Si aggiungono circa 8 mL di latte di calce ed alcune gocce di antischiuma siliconico diluito.

Il campione viene portato rapidamente alla temperatura di ebollizione grazie a due elettrodi posti

all’interno dell’ampolla, i quali creano un circuito di corrente.

Il processo di distillazione si arresta automaticamente, grazie ad una bilancia elettronica di

precisione, quando sono stati raccolti all’interno del matraccio circa 75 – 80 mL di distillato.

Il tempo necessario per un ciclo di distillazione è di circa 5 – 6 minuti.

4) Si aggiunge acqua distillata portando quasi a volume e si pone il matraccio nel bagno termostatico a

20°C.

Trascorsi circa 10 minuti e dopo aver verificato la corretta temperatura con un termometro, si porta a

volume con acqua distillata, agitando poi più volte per omogeneizzare il campione.

5) Si procede, quindi, alla lettura della densità relativa mediante la bilancia idrostatica elettronica, la

quale permette la misurazione della densità relativa in un “range” compreso tra 0,5 e 2,25.

Per questa operazione si versa il distillato nell’apposito cilindro munito di intercapedine, avendo

cura di non superare la tacca presente e lo si posiziona sulla bilancia.

Successivamente, si immerge con molta attenzione il pescante (è il pezzo “delicato”).

Il valore che compare sul display, caratterizzato da 5 cifre decimali, va raffrontato sulle apposite tabelle per

risalire al grado alcolico.

1.1.3 NOTE E COMMENTI

Per evitare eventuali errori dovuti ad una taratura non perfetta della vetreria impiegata, per raccogliere il

distillato si pone sotto al condensatore lo stesso matraccio utilizzato precedentemente per il campione in

esame.

È utile bagnare il fondo del matraccio con acqua distillata (pochi millilitri) per evitare la volatilizzazione

delle prime gocce di alcol che condensano.

Inoltre, è importante prelevare il campione alla stessa temperatura con cui poi si farà la pesata alla bilancia

idrostatica.

Uno scarto di ± 2 °C può ritenersi accettabile.

Il latte di calce viene aggiunto per basificare l’ambiente: riesce a fissare la CO senza che si abbiano

2

apprezzabili cambiamenti del valore del pH, essendo il CaCO insolubile.

3

Inoltre, in queste condizioni si salificano gli acidi organici volatili, come ad esempio l’acido acetico, che

altrimenti passerebbero nel distillato.

La presenza di questi acidi si traduce in un incremento della densità con un conseguente abbassamento del

valore della gradazione alcolica.

Non si impiega NaOH perché i suoi sali non precipitano.

Inoltre, l’aggiunta di soda porta ad un innalzamento del pH a valori intorno a 12 e ciò potrebbe causare la

formazione di composti chetonici ed aldeidici volatili (prodotti di degradazione degli zuccheri) che

passerebbero nel distillato portando così a una sovrastima del risultato.

La basificazione del campione produce la saponificazione degli esteri volatili come l’etilacetato e gli altri

esteri superiori, con la conseguente liberazione di etanolo e l’innalzamento del valore del grado alcolico

In caso contrario, gli esteri passerebbero nel distillato con un errore nella lettura che può arrivare fino a –

0,1°.

Basificando eccessivamente l’ambiente si potrebbe liberare ammoniaca dagli amminoacidi la quale, in

ambiente basico, risulta essere volatile. 3

Ad ogni modo, anche se l’ammoniaca liberata passasse totalmente nel distillato, porterebbe in pratica ad un

errore trascurabile.

Basti pensare che se fossero presenti all’incirca 20 mg/L di ammoniaca in un vino, l’errore nella lettura del

grado alcolico si aggirerebbe intorno al centesimo di grado.

L’antischiuma siliconico diluito viene aggiunto perché impedisce la formazione di schiume la cui presenza

potrebbe rallentare il processo di distillazione ed ostacolare, inoltre, il passaggio dei vapori di alcol etilico

nel distillato.

1.2 METODO EBULLIOMETRICO (ESPERIENZA 2)

Il metodo ebulliometrico può essere considerato come il più pratico in quanto il suo utilizzo non presenta

particolari difficoltà anche per un operatore non esperto ed inoltre si ottengono dei risultati in un tempo

relativamente contenuto.

Tuttavia questo metodo non è ufficiale.

Pur essendo molte volte criticato per non risultare molto preciso, ancora oggi viene impiegato per le

valutazioni commerciali correnti ed anche per le definizioni delle D.O.C.

Anche se in moltissime cantine si fa ancora uso di tale metodo, la maggior parte dei laboratori di analisi

hanno però abbandonato l’impiego degli ebulliometri preferendo strumentazioni molto più sofisticate e

costose (che sono in grado di effettuare anche altre determinazioni analitiche) le quali garantiscono, in tempi

alquanto ristretti, risultati molto precisi e riproducibili, in linea con quelle che sono le esigenze attuali.

Il principio su cui si basa questa determinazione è di tipo fisico, ovvero si sfrutta la proprietà ebullioscopica

di un liquido.

Poiché il punto di ebollizione dell’acqua a pressione atmosferica è di 100 °C mentre quello dell’alcol etilico

è di 78,4°C, una miscela di acqua ed alcol avrà di fatto una temperatura di ebollizione compresa tra questi

due valori e sarà tanto più bassa quanto più alcol sarà presente.

È una metodica, come già accennato, soggetta ad errori a volte rilevanti dovuti al fatto che il punto di

ebollizione varia al variare della pressione atmosferica.

Per tale motivo lo strumento deve essere tarato più volte durante la giornata.

È chiaro, ad esempio, che la pressione atmosferica risulterà essere diversa se si è in presenza di un temporale

o di una giornata caratterizzata da bel tempo.

La taratura va eseguita con acqua, meglio se distillata.

Infatti, l’acqua rappresenta l’ideale soluzione idroalcolica standard a concentrazione nota in quanto ha una

gradazione alcolica pari a zero.

In definitiva, il grado alcolico non viene determinato semplicemente dalla temperatura di ebollizione del

campione, ma dalla differenza tra le due temperature di ebollizione, operando nelle medesime condizioni di

pressione atmosferica.

1.2.1 STRUMENTI E SOSTANZE UTILIZZATE

Per determinare il grado alcolico con il metodo ebulliometrico, viene impiegato l’ebulliometro (o

ebullioscopio) di Malligand, che è composto da 4 parti principali:

 Una caldaia con termosifone e caminetto.

 Un coperchio, che si avvita sulla caldaia, munito di termometro a squadra con scala alcolica

regolabile.

 Un refrigerante (o condensatore) con camicia.

 Un fornelletto ad alcol. 4

Fig. 1: Ebulliometro di Malligand (SATI snc)

Inoltre, per facilitare tale analisi, nel “kit” sono talvolta presenti:

 Una pipetta per portare a livello il liquido nella caldaia.

 Un termometro per misurare la temperatura del liquido di raffreddamento (cioè per sapere quando la

lettura cade nel range ottimale di temperatura).

 Dei tabulati di correzione dei dati ottenuti a seconda della sovra o sottopressione cui è soggetto il

sistema.

1.2.2 PROCEDIMENTO

Per determinare il titolo alcolometrico con il Metodo Ebulliometrico o Ebullioscopico bisogna:

1) Prima di eseguire l’analisi sul mosto o sul vino lo strumento deve essere tarato utilizzando acqua di

rete o distillata (quest’ultima è da preferirsi per evitare che si formino incrostazioni all’interno della

caldaia) con la quale si risciacqua accuratamente per allontanare eventuali impurità.

L’acqua viene versata nella caldaia fino alla tacca più bassa (si preleva l’eventuale eccesso con la

pipetta in dotazione al “kit”) in modo che il bulbo del termometro venga a contatto solo con il vapore

a 100°C e non con il liquido (che presenta una temperatura più bassa).

Si avvita il coperchio e su questo il refrigerante senza acqua.

Dopo aver montato il refrigerante si accende quindi il fornelletto ad alcol.

È opportuno, prima di ogni analisi, verificare che il fornelletto sia pieno di alcol e lo stoppino sia in

buono stato in quanto è importante che l’intensità della fiamma (circa 3 – 4 cm) sia sempre costante

e non si modifichi durante il riscaldamento.

Dopo qualche minuto, quando la colonnina di mercurio si è stabilizzata (solitamente corrisponde al

momento in cui si ha la fuoriuscita di vapore dal condensatore), si fissa lo zero sulla scala graduata,

regolabile con apposita vite, si spegne la fiamma e si lascia raffreddare.

L’apparecchio si trova così al momento dell’analisi regolato per la pressione atmosferica esistente.

2) Si vuota la caldaia e, quando è sufficientemente fredda, si sciacqua diverse volte con il campione in

esame e si riempie fino a livello della tacca superiore.

In questo caso il bulbo risulta immerso nel liquido.

È infatti importante misurare la temperatura del campione in ebollizione e non quella dei suoi vapori

che si formano, in quanto risultano essere più ricchi in alcol.

Si avvita il coperchio e su questo il condensatore, questa volta riempito con acqua fredda.

Quando comincia a bollire il liquido, si osserva il mercurio salire all’interno dell’asta del

termometro, dapprima con piccole scosse e successivamente in maniera più lenta e regolare.

La lettura va eseguita quando l’indicazione del termometro rimane costante e quando il condensatore

risulta tiepido al tatto (all’incirca la temperatura corporea).

Se si ha a disposizione il piccolo termometro in dotazione al “kit”, che si posiziona all’interno del

condensatore grazie ad un astuccio in acciaio, si può eseguire la lettura del grado alcolico quando il

livello della colonnina di mercurio del piccolo termometro è compresa tra le due tacche (Min –

Max). 5

1.2.3 NOTE E COMMENTI

L’ebulliometro di Malligand risulta essere impreciso nella determinazione del grado alcolico determinazione

non solo per i motivi legati alle variazioni di pressione atmosferica, come già accennato in precedenza, ma

anche perché il vino non è una semplice miscela idroalcolica.

Infatti, presenta in soluzione composti volatili (come la CO ) e fissi (come gli zuccheri) che influiscono sulla

2

temperatura di ebollizione in maniera differente.

 Alcuni esteri volatili (bassobollenti), quali l’acetato di etile, abbassando il punto di ebollizione della

soluzione idroalcolica, determinano una sovrastima del risultato per la loro alta volatilità.

 Al contrario, la presenza di sostanze non volatili, quali gli zuccheri ed i polifenoli, conduce a una

sottostima del valore del grado alcolico innalzando, di fatto, il punto ebullioscopico (secondo la

legge di Raoult).

Questi due effetti generalmente tendono a compensarsi di modo tale che la temperatura di ebollizione del

campione in esame sia, in pratica, quella di una soluzione idroalcolica che presenta la medesima gradazione.

In presenza di vini dolci aventi una alta concentrazione zuccherina, si ha una lettura del grado alcolico

superiore al reale in quanto gli zuccheri, sottraendo volume all’acqua, tendono a concentrare l’alcol e lo

strumento, per tale motivo, segnerà un valore superiore a quello reale.

Per ovviare a tali interferenze si può impiegare lo strumento operando sul distillato del campione.

↓

Un’altra causa di errore dovuta all’impiego degli ebulliometri è l’inesattezza della prova che segue la taratura

dello strumento.

Si possono verificare errori di lettura di circa 0,1 C°.

Ciò deriva dal fatto che nella prima prova, durante l’ebollizione del campione in esame, i primi vapori

alcolici che si formano sono quelli che presentano un titolo alcolometrico più elevato (50° e anche più).

Tali vapori tendono a riempire lo spazio di testa della caldaia e quindi a condensarsi sulle pareti del

refrigerante.

Il campione quindi alla lettura avrà una gradazione alcolica inferiore.

Ripetendo la determinazione questo errore non si presenta più in quanto tra una misura e l’altra lo spazio di

testa della caldaia e della colonna del condensatore risultano impregnati di vapore e di liquido.

↓

I vantaggi che derivano dall’utilizzo dell’ebulliometro di Malligand sono diversi:

 È un apparecchio compatto e di costruzione robusta il cui costo è abbastanza contenuto;

 Per effettuare l’analisi non si impiega alcun tipo di reagente o coadiuvante, eccezion fatta per l’alcol

del fornelletto;

 Richiede una scarsissima manutenzione, limitata alla pulizia della serpentina a contatto della fiamma

e all’allontanamento di eventuali incrostazioni che si possono formare sulle pareti interne della

caldaia.

In questo ultimo caso è utile farvi bollire una soluzione al 10% di Na CO sciacquando poi con

2 3

acqua distillata.

 Permette di ottenere un risultato, anche se non molto preciso, in breve tempo, senza dover pre –

trattare il campione.

Il tempo impiegato per una analisi, considerando anche quello ne