Analisi dei medicinali II

Analisi dei medicinali: i metodi fisici e chimico-fisici per il riconoscimento delle sostanze organiche

Il riconoscimento delle sostanze organiche può essere effettuato mediante l’utilizzo di metodi basati sulle proprietà chimiche.

Metodi basati sulle proprietà fisiche o chimico-fisiche

• Spettroscopia → Consente di ottenere informazioni sulla struttura di una determinata sostanza senza la necessità di disporre di un campione noto. Tecniche:
• Risonanza magnetica nucleare (RMN, NMR) permette di distinguere gli enantiomeri e gli isomeri → permette di costruire la molecola.
• Spettroscopia infrarossa consente di ottenere informazioni sul gruppo funzionale della molecola. Non esistono due molecole sovrapponibili → mai due spettri uguali anche sono simili, tipo impronta digitale.
• Spettroscopia ultravioletto-visibile consente di ottenere informazioni sulla coniugazione della molecola.
• Spettrometria di massa consente di ottenere il PM della molecola, si frammenta una molecola con un campo magnetico ad alta intensità e così analizzando i frammenti riesci a risalire alla struttura.
• Raggi X viene “fotografata” la molecola, si usa per molecole solide, per composti che possono cristallizzare in un determinato modo.

I metodi fisici sono più sicuri, non dipendono dall’operatore → meno errori.

Radiazione elettromagnetica

La radiazione elettromagnetica, luce, è una forma di energia che si trasmette nello spazio a enorme velocità. Molti e diversi fenomeni avvengono per interazione tra radiazione elettromagnetica e materia:

• Alcuni sono razionalizzati mediante la teoria ondulatoria classica, radiazione è un’onda → rifrattometria, indice di rifrazione, polarimetria, come ruota il piano della luce → potere ottico rotatorio…
• Altri dalla teoria quantistica, radiazione fascio di particelle che portano energia → assorbimento ed emissione di energia radiante.

Teoria ondulatoria classica

La radiazione elettromagnetica è rappresentata da un campo elettrico e un campo magnetico che oscillano su piani perpendicolari in modo sinusoidale.

Radiazione monocromatica polarizzata → vettore che oscilla in un unico piano perpendicolare alla direzione di propagazione.

Definizioni:

• Ampiezza → lunghezza del vettore, al massimo della curva.
• Lunghezza d’onda, λ → distanza lineare tra due massimi o due minimi.
• Frequenza → numero di onde che passa nell’unità di tempo.

Moltiplicando la lunghezza d’onda per la frequenza otteniamo la velocità → v = λ x ν m/s.

La velocità è massima nel vuoto, 3x10⁸ m/s, e nell’aria, e cambia molto nei mezzi condensati, es. nei liquidi. Questa differenza è alla base del fenomeno della rifrazione.

Teoria quantistica

La radiazione elettromagnetica è un fascio di particelle distinte dette fotoni o quanti la cui energia è direttamente proporzionale alla frequenza della radiazione.

L’energia è direttamente proporzionale alla frequenza e indirettamente proporzionale alla lunghezza d’onda.

Assorbimento

È un processo in cui una specie chimica posta in un mezzo trasparente attenua in modo selettivo determinate frequenze di un’onda elettromagnetica.

Ogni sostanza ha un determinato set di stati di energia, in condizioni normali la molecola sta nel set di riposo, quello a minore energia. Se viene fornita energia arriva allo stato eccitato, che però è instabile e quindi tende a tornare allo stato di riposo molto rapidamente → rilassamento. Per spostarsi allo step successivo devo fornire esattamente l’energia necessaria, né di più né di meno → l’assorbimento è possibile solo se l’energia del fotone è esattamente corrispondente alla differenza di energia tra lo stato eccitato e lo stato fondamentale → ΔE = hν.

Spettro elettromagnetico

• Ultravioletto → lunghezza d’onda tra 100 e 800 nm, perturbazione grande, si rompono i legami.
• Infrarosso → gli elettroni non cambiano orbitale, si allungano/accorciano i legami, si deformano.
• Microonde → varia lo spin nucleare, viene invertita la rotazione.
• Radiofrequenza → usata nella risonanza magnetica, uguale a quella di sopra.

Abbiamo una sorgente di radiazione che emette radiazioni a lunghezze d’onda crescenti in un certo intervallo. Il raggio emesso dalla sorgente si divide in due, il raggio di riferimento e il raggio incidente che attraversa il campione. Il rilevatore serve per percepire una differenza tra i due raggi quando il campione assorbe la radiazione.

Quando la radiazione emessa dalla sorgente arriva alla lunghezza d’onda corrispondente all’energia corrispondente alla differenza tra lo stato fondamentale e quello eccitato il raggio trasmesso avrà un’intensità diversa da quella del raggio di riferimento.

Questa differenza viene percepita dal rilevatore e io ottengo un picco nel grafico, sulle x ho lunghezza d’onda, frequenza o numero d’onda, sulle y la trasmittanza o assorbanza.

Spettroscopia UV-visibile

È utile per studiare la struttura elettronica delle molecole e per misurare l’entità della loro coniugazione. Quando una molecola viene colpita/interagisce con una radiazione avviene una transizione elettronica → si rompono dei legami.

La transizione si definisce HOMO, orbitale molecolare occupato ad energia più alta, e LUMO, orbitale molecolare non occupato a energia più bassa.

Un orbitale è la regione dello spazio in cui c’è la massima probabilità di trovare l’elettrone. Dal punto di vista matematico è una funzione che definisce una regione dello spazio.

Quando due atomi si legano per raggiungere l’ottetto, e quindi la stabilità, si forma un legame covalente. Se due atomi condividono un doppietto elettronico non si parla più di orbitali atomici, ma molecolari che hanno una propria forma. Derivano dalla combinazioni delle funzioni d’onda che descrivono gli orbitali atomici.

Gli orbitali molecolari che si formano sono 2, uno dalla combinazione in fase delle due funzioni d’onda → legante, e uno che deriva dalla combinazione fuori fase → antilegante.

Es. H ha 1 elettrone nell’orbitale 1s → si combinano due atomi per raggiungere la combinazione del gas nobile He. Si forma un orbitale di legame sigma e uno di antilegame sigma*. Nell’orbitale sigma gli elettroni stanno nella zona di fusione, in quello di antilegame stanno esterni.

Quando viene assorbita la radiazione un elettrone passa dall’orbitale a energia più bassa a quello ad energia più alta.

L’energia degli orbitali sigma e sigma* sono caratteristici dell’atomo.

Es. CH4 ho gli orbitali 1s dell’idrogeno e quelli sp3 del C, sul C rimane un orbitale p ciascuno con un elettrone, questo per sovrapposizione laterale forma legami, sopra e sotto il piano del legame, e l’orbitale molecolare che si forma è di tipo pigreco. Energia dell’orbitale pigreco/pigreco* è intermedia rispetto a quelli sigma. Il metano usa orbitali ibridi sp3 per fare legami.

La transizione HOMO-LUMO non è più sigma-sigma*, ma pigreco-pigreco*, che richiede un’energia minore rispetto al sigma.

Gli orbitali sigma derivano da qualsiasi interazione frontale, anche s-p o sp-sp o p-p…

Orbitali con la stessa energia si chiamano degeneri.

Regioni studiate

• UV lontano o nel vuoto → lunghezza d’onda 100-200 nm ed E = 286-145 Kcal/mol, in cui possono avvenire le transizioni sigma-sigma*, poco usata, c’è interferenza con i gas.
• UV vicino → lunghezza d’onda 200-400 nm ed E = 145-72 Kcal/mol, transizioni pigreco-pigreco* e un’altra che porta gli orbitali di non-legame degli eteroatomi come O, N, alogeni…
• Visibile → lunghezza d’onda 400-800 nm ed E = 72-36 Kcal/mol, assorbono i composti colorati.

La sostanza assorbita di solito si presenta con delle grandi bande, non ha una grande risoluzione perché la transizione elettronica è accompagnata da transizioni rotovibrazionali.

Lo stato elettronico fondamentale e quello eccitato sono divisi in stati energetici più piccoli in cui il legame non si rompe, ma si stira o cambia l’angolo di legame. In teoria posso passare in uno qualsiasi dei sottostrati fondamentali a uno qualsiasi di quelli eccitati e questo determina un allargamento delle bande, con la stessa energia posso avere diverse transizioni.

In ordinata l’assorbanza o la trasmittanza e sulle ascisse la lunghezza d’onda → c’è scritto nella monografia quali sono i massimi assorbimenti e a quali lunghezze d’onda e qual è il coefficiente di estinzione molare della sostanza, mol/L. Misurazioni nel matraccio.

Regole di selezione

• Regola di selezione di simmetria → non sono consentite transizioni tra situazioni descritte da funzioni d’onda con diversa simmetria, gli orbitali n non hanno orbitali di antilegami possono andare sia a sigma che a pigreco.
• Sono consentite transizioni tra stati di uguale molteplicità.
• Sono consentite transizioni monoelettroniche.

Definizioni

• Cromoforo = gruppo insaturo responsabile dell’assorbimento nell’UV vicino/visibile, es. carbonile.
• Auxocromo = gruppo saturo che legato ad un cromoforo determina un aumento della lunghezza d’onda e del coefficiente di estinzione molare.
• Spostamento batocromico = spostamento del massimo di assorbimento verso lunghezze d’onda più alte.
• Spostamento ipsocromico = spostamento del massimo di assorbimento verso lunghezze d’onda più basse.
• Effetto ipercromico = aumento del coefficiente di estinzione molare.
• Effetto ipsocromico = diminuzione del coefficiente di estinzione molare.

Gruppi che assorbono

• Molecole sature → es. alcani, ho solo orbitali di tipo sigma quindi l’unica transizione possibile è sigma-sigma*, hanno un’E = 300-350 Kcal/mol, sono nella regione dell’UV lontano, non si usano, bisognerebbe lavorare nel vuoto → assorbono anche gas atmosferici.
• Composti con eteroatomi → possono fare transizioni sigma-sigma* e n-sigma*, E più bassa, per l’O siamo ancora nella regione dell’UV lontano, per N, S e alogeni all’inizio dell’UV vicino, si vedono.
• Molecole insature → possono fare transizioni sigma-sigma* o pigreco-pigreco*, E più bassa, per composti non coniugati cade nella regione UV lontano, per quelli coniugati nell’UV vicino, elettroni delocalizzati per risonanza, la coniugazione diminuisce l’energia necessaria per la transizione aumentando la lunghezza d’onda e lo spettro si sposta.
• Cromoforo etilenico → può fare transizioni pigreco-pigreco*, cade nella regione dell’UV lontano.
• Cromoforo etilenico coniugato → può fare transizioni pigreco2-pigreco3*, cade nell’UV vicino. Più sono coniugati più l’effetto aumenta.

Aumentando il numero di doppi legami l’energia richiesta per la transizione HOMO-LUMO a minore energia diventa sempre più piccola fino ad arrivare ad uno spostamento batocromico e un effetto ipercromico e si arriva ai composti colorati, sopra 400 nm → a 450 rosso-arancio, a 550 violetto, a 650 blu.

• Sistemi aromatici:
• Benzene → 3 insaturazioni che entrano in coniugazione tra loro, 3 orbitali leganti pigreco di cui 2 con la stessa energia e uno con l’energia più bassa, in questi ci sono i 6 elettroni, specularmente ci sono i 3 orbitali di non-legame. Le transizioni possibili sono diverse, tra qualsiasi pigreco di legame e qualsiasi di non-legame. Tipicamente dà origine a 3 bande: banda E1 lunghezza d’onda 180 nm, UV lontano, e coefficiente 600000, banda E2 204 nm, inizio UV vicino, e 7900, banda B 256 nm, UV vicino, più intensa, e 200. Lo spettro è influenzato dalla coniugazione e dalla presenza di sostituenti.
• Molecole insature → con C, H, O, da sigma a sigma* UV lontano, da pigreco a pigreco* E più bassa, risente della coniugazione, da n a pigreco* UV vicino, E più bassa, ma molto poco intenso → avviene tra due orbitali che sono perpendicolari tra di loro, py fa il legame, px e pz hanno due elettroni ciascuno → orbitali n, perpendicolari, risente del tipo di sostituzione, es. gruppo carbonilico → gruppo cromoforo, orbitali n dati dai doppietti di O hanno energia intermedia tra pigreco e pigreco* dati dai 2p di O e C.

Se il cromoforo carbonilico è coniugato si alzano entrambe le bande e compare una terza banda che va a lunghezze d’onde maggiori, la epsilon rimane piccola.

Non tutte le sostanze che assorbono nell’UV hanno questo dato nella monografia.

Densità

La densità relativa è il rapporto tra la massa di un volume della sostanza in esame e la massa di uno stesso volume di acqua entrambi pesati a 20°C, rapporto tra le densità assolute. d H2O = 0,998230 g/ml.

Per determinare la densità relativa si usa il picnometro, recipiente di vetro, noi useremo un matraccino da 1 ml. Si fanno 3 pesate, o tutte con tappo o tutte senza tappo: matraccino vuoto, matraccino + sostanza e poi matraccino + acqua, dopo aver lavato e fatto raffreddare → d relativa x d20 assoluta H2O = d assoluta sostanza.

Polarimetria

Segue la teoria ondulatoria, come la rifrattometria. È la branca che studia l’interazione tra la radiazione elettromagnetica e le sostanze otticamente attive, quelle che interagiscono con una radiazione monocromatica polarizzata, modificano il piano di rotazione di un angolo alfa. Devono essere per forza sostanze chirali.

• Luce bianca ordinaria → caratterizzata da onde di lunghezza d’onda variabile che vibrano in tutti i piani possibili perpendicolari alla direzione di propagazione.
• Radiazione monocromatica → radiazione caratterizzata da un’unica lunghezza d’onda, si ottiene per mezzo di filtri o utilizzando sorgenti luminose polari, vibra su tutti i piani possibili perpendicolari alla direzione di propagazione.
• Radiazione monocromatica polarizzata → ha una sola lunghezza d’onda che oscilla su un solo piano perpendicolare alla direzione di propagazione.

Il polarimetro ha una sorgente luminosa che emette una radiazione monocromatica, dopo c’è un polarizzatore, tipo griglia verticale, che seleziona solo un piano di oscillazione → diventa monocromatica polarizzata, poi attraversa il campione. Se interagisce modifica il piano di oscillazione altrimenti rimane uguale. Dopo la cella ho un’altra griglia verticale come la prima, mobile → se non interagisce passa direttamente, se ha interagito ne passa meno, ha un’intensità diversa, per renderla uguale ruoto la seconda griglia finché non è nella nuova direzione della seconda e così posso capire quanto è stata ruotata. La griglia possono essere filtri polaroid o prismi di Nicol, questi sono nello strumento, costituito da due cristalli di calcite CaO tagliati e incollati secondo angoli precisi e tenuti insieme dal balsamo del Canadà.

Quando l’onda monocromatica incide sul primo cristallo il fenomeno della rifrazione porta ad avere il passaggio di due vettori perpendicolari tra loro, nel secondo uno viene riflesso e l’altro passa → ottengo un’onda polarizzata monocromatica. La seconda griglia è un altro prisma di Nicol che però può ruotare.

Lunghezza d’onda di riferimento → 589.3 nm, del Na.

Esistono due polarimetri in laboratorio → uno che dà l’angolo direttamente, l’altro in cui devi ruotare manualmente finché non vedi la stessa intensità luminosa.

L’angolo che ottengo dipende dalla concentrazione della soluzione, dalla lunghezza d’onda e dalla temperatura. In farmacopea trovo il potere ottico rotatorio specifico, caratteristico della sostanza, ed è dato dall’angolo letto fratto la concentrazione, g/ml, per la lunghezza della cella del polarimetro, 1 dm.

Devo sapere la concentrazione quindi preparo la soluzione nel matraccio, 10 ml. Se ho una sostanza liquida riempio la cella direttamente con la sostanza e al posto della concentrazione metto la densità, g/ml.

Serve anche una beuta con il solvente e basta per andare al polarimetro in laboratorio.

Il potere ottico rotatorio è utile per determinare la purezza ottica di una sostanza → ciò che differenzia i due enantiomeri è l’interazione con la luce.

La purezza ottica si esprime in % è data da 100 → potere ottico rotatorio specifico sperimentale fratto quello ottico rotatorio specifico teorico, riportato sulla FU, tutto per 100. Es. se è 80% vuol dire che l’80% è l’enantiomero L e il 20% il racemo che non fa ruotare il piano ottico. La % dell’enantiomero prevalente si calcola facendo 100 - 100 - + 2, quello meno presente è 2.

Rifrattometria

L’indice di rifrazione si basa.