Analisi dei medicinali I

A.A: 2021/2022 Analisi dei medicinali IP: Crof Icherogiada Traverso

Sommario

• Preparazione del campione ....................................................................................................... 2
• Proprietà del campione ............................................................................................................... 7
• Purificazione del campione ....................................................................................................... 14
• Metodi separativi ....................................................................................................................... 25
• Cromatografia e analisi strumentale ........................................................................................ 39
• Spettroscopia e analisi strumentale .......................................................................................... 55
• Rivelatori in HPLC ........................................................................................................................ 60
• Rivelatori in GC ........................................................................................................................... 62
• Analisi quantitativa in GC e HPLC ............................................................................................. 63

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Tecniche di preparazione del campione e metodi estrattivi

Preparazione del campione

1. Preparazione del campione

• Campione: porzione di materiale prelevato per le analisi.
• Matrice: l’intero gruppo di sostanze che costituiscono il campione.
• Metodo analitico: tecnica utilizzata per studiare e determinare l’analita.
• Analita: sostanza in esame presente nel campione.

Componente principale 1-100%

Componente minore 0.01-1%

Componente traccia <0.01%

Il campionamento e la preparazione del campione rappresentano i passaggi preliminari dell’intera sequenza analitica.

• Rappresentatività: la porzione di materiale prelevata deve essere sufficientemente rappresentativa del tutto.
• Stabilità: il campione deve mantenere le sue caratteristiche costanti nel tempo. La concentrazione dell’analita deve risultare invariata fino al momento dell’analisi.
• Quantità di campione: dipende dal numero, dal tipo di analisi e di metodo da applicare.
• Numero di campioni: dipende dall’esigenza di rappresentatività e dalla eventuale necessità di campioni di confronto (controcampioni).
• Caratteristiche del recipiente: riguardano la natura del materiale, per conservarlo opportunamente.

1. Campionamento: selezione di una porzione di materiale da analizzare.
2. Scelta del metodo di analisi.
3. Preparazione (pretrattamento) del campione per l’analisi: dipende strettamente dal metodo di analisi prescelto.

• Metodi estrattivi: per isolare un determinato componente dalla matrice del campione.
• Metodi separativi: per separare al meglio/purificare un determinato componente, da altri eventualmente ancora presenti o co-estratti.

4. Esecuzione dell’analisi: prevede la misura di un determinato dato sperimentale correlato all’analita.
5. Elaborazione ed interpretazione dei dati: trattamento statistico dei risultati per stabilire l’attendibilità dell’informazione ottenuta.
6. Presentazione dei risultati.

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2. Classificazione metodi di analisi

Metodi analitici

I principali metodi analitici si basano su:

• Proprietà chimiche: metodi gravimetrici e volumetrici.
• Proprietà fisiche e chimico-fisiche: metodi strumentali.

Gravimetria: metodi basati sulla misura del peso.

Analisi classica Volumetria: metodi basati sulla misura del volume.

Quantità o concentrazione di campione risposta analita.

Spettroscopia: metodi basati sull’interazione dell’analita con la radiazione elettromagnetica.

Analisi strumentale Cromatografia: separazione dei componenti di una miscela grazie alla loro diversa interazione con due fasi diverse, tecnica separativa.

Elettrochimica: basata sulla misura di proprietà elettriche del sistema (es. potenziale, corrente ecc.).

Sollecitazione metodo campione quantità o concentrazione di segnale di misura analita.

La classificazione si può basare anche sulla quantità di campione e dal tipo di costituenti.

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3. Strumenti di laboratorio per movimentare il campione

Misure di massa

La bilancia

• La risoluzione (indicata anche come sensibilità), indica il più piccolo incremento di massa che lo strumento può rilevare.
• La portata rappresenta il carico massimo che la bilancia può sopportare.
• La temperatura di esercizio, dato dall’intervallo di temperatura in cui la bilancia è affidabile, ossia rispetta le specifiche dichiarate dal costruttore.
• L’accuratezza, indicativa della concordanza tra la misura effettuata ed il valore standard di riferimento.
• La precisione (o riproducibilità), indicativa dalla concordanza di misure ripetute dello stesso oggetto.

Tipi di bilance:

• Bilance tecniche: hanno una portata di 0,5-2 kg ed una risoluzione di 0,1-0,01 g.
• Bilance analitiche (macrobilance): hanno una portata di circa 200 g ed una risoluzione di 0,1 mg.
• Bilance analitiche di precisione (semi-micro e micro): permettono di leggere fino a 5-6 cifre decimali, con una risoluzione di 0,01 mg o addirittura 0,001 mg.

(Le semi-micro hanno una portata massima che va dai 10 ai 30 g, mentre le microanalitiche da 1 a 3 g.)

Errori nella pesata

• Spinta fluidostatica: se si pesa un oggetto la cui densità è considerevolmente diversa da quella delle masse utilizzate come standard, la spinta aerostatica dovuta all’aria può essere così diversa da causare errori significativi.

La densità delle masse usate nelle bilance a piatto unico o per tarare quelle elettroniche varia da 7,8 a 8,4 g/cm³.

• Effetti della temperatura: si può assistere ad un errore significativo nella pesata se l’oggetto ha una temperatura diversa dall’ambiente circostante.

Moti convettivi all’interno della teca esercitano un effetto di sollevamento sul piatto e sull’oggetto.

L’aria calda contenuta in un recipiente chiuso pesa meno rispetto allo stesso volume a temperatura più bassa.

[Entrambi gli effetti risultano in una massa apparente dell’oggetto più bassa]

• Cariche elettrostatiche: se l’ambiente è particolarmente secco, gli oggetti accumulano cariche elettrostatiche che possono portare a errori nella misura di massa.

Precauzione nell’uso della bilancia

• Gli oggetti da pesare, quando possibile, non andrebbero toccati con le mani.
• Il contenitore ed il campione vanno posti al centro del piattello.
• Tutte le sostanze vanno pesate in recipienti opportuni, accuratamente puliti (pesafiltri).
• Non deve mai essere superata la portata della bilancia.
• Per pesare sostanze volatili è bene ricorrere a contenitori chiusi.
• Il campione deve avere all’incirca la stessa temperatura della bilancia.
• Quando non è utilizzata, va tenuta in ordine e a sportelli chiusi.

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Misure di volume

La vetreria destinata a misurare i volumi si divide in due categorie:

• Quella destinata a contenere un volume (In o TC) Becher, beute, palloni, provette (scala volumetrica sulle pareti, valore puramente indicativo); matracci, matracci tarati (volumi accuratamente determinati; dai 5 ml ai 5L).

Portare a volume in matraccio: si intende l’operazione attraverso cui un campione, viene posto in un recipiente tarato (ad es. matraccio) e progressivamente diluito con solvente, fino a raggiungere la tacca di taratura. Si procede come segue:

1. Trasferimento quantitativo in matraccio, dove sarà portato a volume. Ogni oggetto entrato in contatto con il campione va ripetutamente lavato con il solvente e la soluzione di lavaggio va raccolta nel matraccio.
2. Si aggiunge solvente quasi fino alla tacca di taratura.
3. Si arriva a volume lentamente con contagocce.
4. Si tappa il matraccio e si mescola capovolgendo più volte, in modo da evitare che vi siano strati a concentrazione diversa.

• Quella destinata ad erogare volumi (Ex o TD) Cilindri graduati, pipette graduate, pipette tarate, burette, sono destinati a misurare volumi da erogare.

I cilindri hanno la scala graduata sulle pareti, la misura del volume è meno accurata di quella di altri dispositivi, pertanto, si usano per determinare soluzioni a concentrazione approssimativamente nota.

Le pipette tarate (a bolla) misurano accuratamente volumi da dispensare: se a doppia tacca il volume è quello contenuto tra le due tacche, se a singola il volume indicato corrisponde allo svuotamento della pipetta. Le pipette a singola tacca erogano il volume nominale per scolamento completo, mentre quelle a due tacche prevedono lo svuotamento a livello della seconda tacca, che non deve essere superata! Le pipette graduate consentono di scegliere volumi intermedi rispetto alla capacità massima.

Per tutte le pipette dette, il liquido viene aspirato per mezzo di un aspiratore automatico, chiamato propipetta fino a superare la tacca corrispondente al volume da misurare.

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Inizialmente si scarica aria premendo A, poi si aspira il liquido premendo S, si lascia uscire lentamente il liquido in eccesso arrestandosi nel punto voluto: il volume così misurato viene infine scaricato nel recipiente di raccolta (si eroga mediante E). Il deflusso del liquido deve avvenire per gravità, senza soffiare nella pipetta, né per accelerare lo scarico né per favorire l’uscita della piccola quantità di liquido che rimane inevitabilmente sulla punta.

Burette: di classe A e B, e in generale possono contenere volumi fra i 10 e i 100 mL. Consentono una precisione maggiore di quella raggiungibile con la pipetta. Viene utilizzata nella tecnica della titolazione.

Avvinare o normalizzare lo strumento.

Si usa un piccolo volume della soluzione da manipolare per lavare e lasciare bagnato con essa lo strumento (buretta) da utilizzare, in modo che la concentrazione della soluzione sulle pareti sia la stessa di quella da ospitare.

Le burette vanno riempite oltre la tacca dello zero e poi azzerate, assicurandosi che a valle del rubinetto non vi sia una bolla d’aria. Se questo avviene è necessario espellere la bolla d’aria, aprendo di colpo e richiudendo il rubinetto (se occorre più volte), prima di procedere all’azzeramento (quindi prima di iniziare qualsiasi titolazione!). Prima di leggere il volume di liquido erogato, è bene attendere che il livello di liquido in buretta si stabilizzi in seguito allo scorrimento del liquido stesso sulle pareti della buretta.

• Letture di volume: vengono effettuate osservando la corrispondenza tra il livello del liquido e una tacca, che di norma è incisa su una parte cilindrica del dispositivo, dove la superficie del liquido forma una curva detta menisco.

La lettura del menisco è facilitata da una striscia su fondo latteo che le percorre per tutta la lunghezza, la cosiddetta striscia di Schellbach. In corrispondenza del menisco, per un effetto ottico, la striscia risulta come ‘‘spezzata’’ formando l’immagine di due punte convergenti sul valore da leggere della scala graduata.

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Proprietà del campione

4. Caratteristiche del campione

Caratteristiche della molecola o delle molecole di interesse nel campione:

1. Stato fisico, aspetto, colore, odore ecc.
2. Comportamento (solubilità/miscibilità, acido-base) metodi estrattivi e separativi.

Sia lo stato fisico sia la solubilità dei composti ed il relativo punto di fusione risentono delle forze intermolecolari tra molecola e molecola.

Acido-base

La possibilità per molecole acide o basiche di esistere in 2 diverse forme (una priva di carica e la specie coniugata dotata di carica) influenza il tipo di interazioni intermolecolari possibili, di conseguenza spiega diversi comportamenti in termini di solubilità nei solventi.

Forze intermolecolari

• Interazioni ioniche: più forte che si può instaurare (20-40 kJ mol^-1).
• Interazioni a idrogeno: ha luogo tra un eteroatomo elettron-ricco e un idrogeno elettron-povero.
• Interazioni ione-dipolo: si instaura quando una porzione carica di una molecola o uno ione interagisce con un dipolo permanente. La forza di queste interazioni è inversamente proporzionale alla quarta potenza della distanza tra i gruppi coinvolti.
• Interazione dipolo-dipolo: sono correlate alla presenza nella molecola di atomi o gruppi con elettronegatività diversa. (Ad es. un gruppo carbonilico ha un momento di dipolo permanente dovuto alla differente elettronegatività di ossigeno e carbonio).

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La forza di queste interazioni è inversamente proporzionale alla terza potenza della distanza tra i gruppi coinvolti.

• Interazioni di Van der Waals (forze di London): molto deboli, tipicamente (2-4 kJ mol^-1), coinvolgono regioni idrofobiche di differenti molecole. La forza di queste interazioni è inversamente proporzionale alla settima potenza della distanza tra i gruppi coinvolti.

Esempio di commento in termini di valutazione delle interazioni e della eventuale solubilità in solventi acquosi oppure organici.

• Alcoli: i gruppi alifatici individuati in giallo possono dare interazioni di Van der Waals, mentre il gruppo alcolico (esposto) può dare interazioni a idrogeno (O funge da accettore e H legato a O da donatore), dando inoltre interazioni dipolo-dipolo. Incrementando il numero di atomi di C da metanolo a etanolo fino a propanolo, si ottengono alcoli miscibili con acqua, da pentanolo in avanti la solubilità decresce (pesa di più il contributo lipofilo di quello polare).
• Eteri: atomo di ossigeno può comportarsi da accettore di legame a idrogeno ma a fronte di questo, questo viene mascherato da due catene alifatiche apolari evidenziate in giallo, che concorrono dando interazioni idrofobiche (van der Waals). La risultante è un mezzo poco miscibile con acqua e più affine per mezzi organici, ad esempio acetone o benzene.

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• Fenoli e acidi organici mostrati (indissociati): atomo di ossigeno del carbonile/carbossile o del fenolo (in blu) possono dare interazioni a idrogeno, essendo la funzione ammidica e quella carbossilica anche in grado di dare interazioni dipolo-dipolo. Gli anelli aromatici (in giallo) concorrono dando interazioni idrofobiche (van der Waals). La risultante è una scarsa (nel caso del paracetamolo) e nulla (nel caso acido benzoico) solubilità in acqua, più affini invece per mezzi organici.

Basi coniugate dei fenoli ed acidi organici mostrati: anione fenato o carbossilato possono dare interazioni a idrogeno, dipolo, ioniche, favorendo una maggiore solubilità in ambiente polare. Gli anelli aromatici (in giallo) concorrono dando interazioni idrofobiche (van der Waals). Essendo più forti eventuali interazioni di carica, la risultante è una maggiore solubilità in acqua, rispetto ai mezzi organici lipofili.

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5. Parametri chimico-fisici

I composti organici sono caratterizzati da proprietà chimiche, direttamente correlate ai gruppi funzionali presenti, e da proprietà fisiche, dipendenti dalla struttura della molecola, rilevabili attraverso le costanti fisiche quali punto di fusione e punto di ebollizione.

Punto di fusione

Il punto di fusione di una sostanza è dato dalla temperatura in cui, a pressione atmosferica, coesistono in equilibrio fase solida e fase liquida.

Per un composto puro la temperatura alla quale avviene il passaggio di stato solido/liquido ha un valore netto e si realizza a temperatura costante. Si misura l’intervallo di fusione: corrisponde all’intervallo che ha inizio con la formazione delle prime goccioline liquide e la temperatura alla quale si assiste a completa liquefazione.

Riscaldamento

Amorfa cristallina

Forze di Van der Waals – dipolo/dipolo permanente – legami ad H – int. ioni.

Molte sostanze fondono con decomposizione che si realizza con comparsa di colorazioni, imbrunimento e/o evoluzione di gas (formazione di bolle entro il capillare) a temperature che possono risultare differenti per una sostanza, in dipendenza della velocità di riscaldamento. Tiamina cloridrato: 248 °C (d)

In generale, i prodotti di decomposizione costituiscono impurezza, che pertanto abbassano il punto di fusione. Ci sono composti organici che subiscono fenomeni di rammollimento o contrazione, dovuti a variazioni della loro forma cristallina o a perdita di solvente di cristallizzazione.

Per sostanze particolarmente termolabili è bene introdurre il capillare nel bagno preriscaldato ad una temperatura di 10-20 °C inferiore al pf presunto.

Miscele abbassamento e ampliamento dell’intervallo di fusione.

Miscela binaria: A (acido benzoico; pf = 128 °C), B (acido cinnamico; pf = 136 °C), completamente solubili allo stato liquido.

I punti T e T corrispondono ai punti di fusione dei componenti A e B puri.

A B

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Si consideri il raffreddamento di una miscela liquida di composizione ‘M’ (A: 80%, B: 20%) alla temperatura T (118 °C): iniziano a formarsi i primi M cristalli di A che vanno aumentando man mano che la temperatura si abbassa verso T (82 °C). E Con le formazioni di cristalli di A, la miscela (liquido!) si arricchisce di B spostandosi lungo la retta T -E. A Appena la miscela arriva alla temperatura T, E scompare la fase liquida ed i due componenti la miscela solidificheranno insieme (eutettico).

Eutettico: rappresenta la più bassa temperatura possibile di fusione per una miscela A+B.

Determinazione del punto di fusione

Utilizzati:

• Apparecchio di Thiele: si tratta di un apparecchio costituito da un’ampolla di vetro contenente olio di silicone (come liquido riscaldante) con due imboccature laterali per permettere l’inserimento dei capillari, consentendo una contemporanea doppia determinazione.