Analisi dei medicinali 3

ANALISI DEI MEDICINALI 3

Prof. Mattia Sturlese & Prof.ssa Valentina Gandin

Cristian Farris, Anna Gallina, Giada Riga 3° anno CTF A. A. 2025 – 2026

INDICE

Sturlese.......................................................................................................................................................2

Cromatografia..............................................................................................................................................2

Gas cromatografia.......................................................................................................................................22

Radiazione elettromagnetica.......................................................................................................................37

Polarimetria................................................................................................................................................39

Metodi separativi.........................................................................................................................................52

Proprietà fisico-chimiche dei farmaci e ruolo nello sviluppo dei farmaci.........................................................66

Identità digitale per composti chimici...........................................................................................................78

Analisi dei farmaci biologici.........................................................................................................................82

Articolo scientifico....................................................................................................................................100

Gandin.....................................................................................................................................................103

Fasi di identificazione di una sostanza........................................................................................................103

Saggi preliminari.......................................................................................................................................104

Saggi di riconoscimento di carattere generale..............................................................................................113

Saggi di riconoscimento degli zuccheri.......................................................................................................124

............................................................................................127

Saggi per le sostanze insolubili in acqua .............129

Saggi di riconoscimento per le penicilline e le cefalosporine.........................................................

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ANALISI dei MEDICINALI 3 - Sturlese

Tecniche di Purificazione

- Distillazione (Temperatura di ebollizione)

- Cristallizzazione (Solubilità)

- Estrazione con solventi (Ripartizione tra fasi)

- Cromatografia (Ripartizione tra fasi)

CROMATOGRAFIA

Principi generali

La cromatografia comprende tutta una serie di tecniche analitiche di separazione che sfrutta la diversa

affinità delle molecole alle due fasi, una stazionaria e una mobile, dove le sostanze si distribuiscono in quantità

diverse; in particolare, ogni sostanza si distribuisce secondo una K che è il coefficiente di ripartizione.

- Fase stazionaria, FS→ può essere un solido o un liquido supportato su solido (ossido di silicio, ossido

di alluminio, cellulosa...)

- Fase mobile, FM→ liquida o gassosa, che viene fatta fluire in continuo sulla fase stazionaria.

La fase stazionaria (FS) è immobilizzata, mentre la fase mobile (FM) è fatta scorrere in modo continuo sulla FS: i

composti che hanno maggiore affinità per la FS rimarranno ancorati e si sposteranno più lentamente, mentre i

composti che hanno maggiore affinità con la FM si muoveranno con essa.

Quindi, in ogni istante si verifica una competizione tra la fase mobile e la sostanza eluita per la fase stazionaria;

si tratta di un processo dinamico di trasferimento tra le due fasi.

Coefficiente di ripartizione

Il parametro più importante in cromatografia è il coefficiente di ripartizione, che esprime quanto l’analita si

ripartisce fra la FM e la FS; si misura facendo

È un parametro che dipende sia dalla natura dell’analita, che della natura delle sostanze utilizzate per la FS e la

FM, oltre che dalla temperatura di lavoro, visto che si tratta di una grandezza termodinamica. Proprio per

questo è importante trovare la FM ottimale per eseguire un’efficiente separazione cromatografica.

Fase stazionaria (FS)

In cromatografia le fasi stazionarie devono avere determinate caratteristiche:

- Non devono reagire con il soluto né catalizzare reazioni di decomposizione, polimerizzazione o idrolisi.

- Non devono legare irreversibilmente il soluto.

- Non devono solubilizzarsi nella fase mobile né reagire in alcun modo con essa.

- Devono essere in grado di adsorbire un gran numero di sostanze in maniera selettiva, riproducibile e

senza dar luogo a fenomeni di saturazione.

- Devono permettere un facile percolamento dell’eluente.

Fase mobile (FM) 2

In cromatografia le fasi mobili (eluenti) devono avere determinate caratteristiche:

- Non devono reagire con il soluto né catalizzare reazioni di decomposizione, polimerizzazione o idrolisi.

- Devono far migrare i componenti della miscela da separare.

- Non devono solubilizzare la fase stazionaria né reagire in alcun modo con essa.

- Devono avere un basso punto di ebollizione così da permettere un facile recupero dei soluti per

evaporazione dopo separazione.

- Non devono contenere composti tossici e devono avere costi contenuti.

Classificazione delle tecniche cromatografiche

Le tecniche cromatografiche vengono classificate in base a:

- Tipo (stato fisico) della FM:

• Cromatografia liquida: può essere sia liquido/solido (LSC) che liquido/liquido (LLC)

• Gas-cromatografia: può essere sia gas/solido (GSC) che gas/liquido GLC)

• Cromatografia con fluido supercritico (SFC)

- Tecnica di eluizione:

• Su colonna: principalmente per analisi preparative o quantitative, ma anche per analisi

qualitative.

• Planare: può essere paper cromatography o thin layer cromatography; entrambe sono

utilizzate principalmente per analisi qualitative e raramente per analisi preparative.

- Meccanismo di separazione:

a) Ripartizione: La FS è un liquido supportato da un solido inerte e il soluto si solubilizza nelle due

fasi immiscibili e si ripartisce secondo il suo coefficiente di ripartizione in ciascuna di esse. Può

essere sia liquido/liquido che gas/liquido.

Può essere:

Fase normale: la FS è una sostanza più polare rispetto alla FM.

o Di solito viene utilizzata per zuccheri, amminoacidi, proteine e peptidi.

In HILIC (una variante) la fase mobile è prevalentemente organica con una piccola

percentuale di acqua. Gli analiti polari vengono trattenuti dalla fase stazionaria polare e

dallo strato acquoso adsorbito su di essa. L’aumento della percentuale di acqua nella

fase mobile riduce la ritenzione perché compete con gli analiti per i siti di interazione,

facilitandone l’eluizione. A parità di condizioni, gli analiti più idrofili risultano comunque

più trattenuti e quindi eluiscono più tardi.

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Fase inversa: la FS è una sostanza meno polare della FM, solitamente idrofobica e legata

o a un gel di silice. Viene più comunemente impiegata per la separazione delle sostanze

organiche in analisi quantitativa e qualitativa.

Quindi, la FS è apolare, mentre la FM è molto polare.

Il costo della fase stazionaria è molto elevato, ma può essere riutilizzata

svariate volte lavandola con una fase mobile apolare per eleminare i

composti ritenuti sulla fase stazionaria. Spesso si esegue un gradiente

di eluente, ossia da quello più polare a quello meno polare per separare

i vari componenti della miscela.

La cromatografia a interazione idrofobica (HIC) è una tecnica utilizzata per la

separazione di biomolecole, come le proteine, in condizioni acquose che ne preservano

la struttura nativa. Essa si basa sull’interazione tra regioni idrofobiche degli analiti e una

fase stazionaria moderatamente idrofobica (es. gruppi butile o fenile). A elevate

concentrazioni saline, le interazioni idrofobiche sono favorite e le proteine si legano alla

fase stazionaria. L’eluizione avviene mediante diminuzione della forza ionica, che

indebolisce tali interazioni. Gli analiti eluiscono in ordine crescente di idrofobicità, con

quelli più idrofobici che eluiscono per ultimi.

b) Adsorbimento: si basa sull’interazione con una superficie solida (differenza

con cromatografia di ripartizione).

La cromatografia ad adsorbimento liquido-solido (SLC) si basa

sull’interazione tra il soluto e i siti attivi della fase stazionaria solida, con

conseguente accumulo del soluto sulla superficie di separazione tra le due

fasi.

Anche in questo caso la FM può essere sia liquida sia gassosa, mentre la FS è solida.

La ritenzione è dovuta a interazioni reversibili, come legami a idrogeno, forze di Van der Waals e

interazioni dipolari.

È utilizzata per separare sostanze neutre, polari o debolmente ioniche, sia organiche che

inorganiche, ed è ampiamente impiegata in tecniche come la TLC e nelle separazioni preparative,

grazie al basso costo delle fasi stazionarie.

Poiché l’adsorbimento è un fenomeno superficiale, la fase stazionaria deve avere elevata area

superficiale e particelle di dimensioni uniformi (nell’ordine dei micrometri), spesso descritte

anche tramite il numero di mesh (unità di derivazione anglosassone che rappresenta il numero

di maglie per pollice lineare (2,54 cm) di un setaccio): a un numero di mesh più elevato

corrispondono particelle più piccole e una maggiore efficienza separativa.

La fase stazionaria più comune è il gel di silice (SiO₂), materiale polare e altamente poroso.

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Il potere eluente della fase mobile è descritto dalla serie eluotropica, che ordina i solventi in

base alla loro capacità di competere con il soluto per i siti di adsorbimento.

L’adsorbimento dipende principalmente dalla polarità: composti più polari interagiscono

maggiormente con la fase stazionaria. Inoltre, la formazione di legami a idrogeno con la fase

stazionaria aumenta la ritenzione, mentre l’interazione con il solvente la riduce.

In particolare, in alcune tecniche si usa come FS la terra di diatomee (Kieselguhr), un materiale

siliceo naturale derivato dai resti fossili delle diatomee, un tipo di alghe microscopiche con pareti

cellulari ricche di biossido di silicio (SiO₂). È altamente porosa e ha una grande area

superficiale, il che la rende un eccellente adsorbente, infatti è possibile fare un adsorbimento

fisico e chimico dovuto alla polarità della silice; oltre a questo, resiste a elevate temperature ed

è chimicamente inerte nella maggior parte delle condizioni.

c) Scambio ionico: si basa su interazioni di tipo elettrostatico fra gli ioni presenti nella FM e nella

FS; infatti, si tratta di una tecnica che viene impiegata per la separazione di sostanze ioniche o

ionizzabili.

La FS è una resina scambiatrice, un materiale polimerico insolubile e reticolato (resina) che

presenta gruppi funzionali acidi o basici, ionizzati o capaci di ionizzarsi; quindi, può essere

scambiatrice di anioni o di cationi. 5

I due metodi di eluizione sono:

Gradiente di forza ionica: la competizione per lo scambiatore è tra gli ioni e le molecole

o analizzate.

Gradiente di pH: la variazione della carica della molecola comporta il distacco dallo

o scambiatore.

Per entrambi i metodi è necessario un gradiente per spostare l’analita.

d) Affinità:

La cromatografia di affinità è una tecnica di separazione basata sull’adsorbimento reversibile

delle biomolecole tramite interazioni biospecifiche con un ligando immobilizzato sulla fase

stazionaria (FS).

Il ligando può essere una piccola molecola, un peptide, una proteina, un metallo oppure acidi

nucleici (DNA/RNA). Grazie a queste interazioni, si ha un riconoscimento molecolare

altamente specifico tra analita e fase stazionaria.

Questa tecnica è ampiamente utilizzata per la purificazione di campioni complessi, in

particolare di proteine e altre biomolecole. Solo le molecole che possiedono affinità per il

ligando vengono trattenute nella colonna, mentre le altre vengono eluite perché incapaci di

interagire con esso.

L’interazione tra proteina e ligando deve essere:

specifica, per garantire selettività

o sufficientemente forte, per permettere la ritenzione

o

Successivamente, per recuperare l’analita, è necessario rompere questa interazione. Ciò avviene

generalmente tramite:

aggiunta di uno spiazzante competitivo,

o modifica delle condizioni della fase mobile (pH, forza ionica, ecc.)

o

Tipi di ligandi e matrici più utilizzati:

coloranti (dye-ligand): non specifici, ma mimano substrati biologici;

o Glutatione: usato per proteine ricombinanti marcate GST;

o 6

Eparina: ligando generalizzato per proteine della coagulazione, enzimi degli acidi

o nucleici e lipasi;

Avidina/Biotina: sfruttano una delle interazioni più forti note in natura;

o Immunoaffinità: basata su interazioni altamente specifiche tra antigene e anticorpo

o Metalli immobilizzati (IMAC): interazioni tra ioni metallici e proteine (es. proteine

o con His-tag)

Nucleotidi/coenzimi: per enzimi come deidrogenasi, chinasi e transaminasi

o Acidi nucleici: per isolare mRNA, DNA, rRNA e oligonucleotidi

o Proteina A/G: utilizzata per la purificazione delle immunoglobuline

o

e) Esclusione (EC): metodo di separazione cromatografica che si basa sulle diverse dimensioni

molecolari (esclusione dimensionale) delle biomolecole che si separano mentre attraversano la

colonna cromatografica, impaccata solitamente da un gel.

Solitamente la FS è costituita da un solido poroso o gel, una matrice polimerica piena di cross-

links; mentre la FM è solitamente liquida.

In particolare, si distinguono

Gel permeazione: si utilizzano eluenti organici.

o Gel filtrazione: si utilizzano eluenti acquosi.

o 7

Procedimento cromatografico

Il campione è introdotto nella FM, la quale eluisce in continuo attraverso la FS.

I componenti più affini alla FS vengono trattenuti, mentre i componenti più affini

alla FM si sposteranno più velocemente.

La separazione dei componenti avviene grazie alla distribuzione caratteristica tra

le due fasi di ogni sostanza.

Il cromatogramma

Il processo di separazione dei componenti di una miscela può essere monitorato tramite un rivelatore posto

all’uscita della colonna, il quale misura la concentrazione delle sostanze che escono dalla colonna e registra il

segnale nel tempo, producendo un grafico chiamato cromatogramma.

Nel cromatogramma l’asse delle ascisse rappresenta il tempo, mentre l’asse delle ordinate rappresenta il

segnale del detector.

Ogni sostanza separata dalla colonna appare come un picco. La posizione del picco lungo l’asse dei tempi

fornisce un’informazione qualitativa, perché permette di identificare il composto in base al suo tempo di

ritenzione.

L’area sottesa al picco è proporzionale alla quantità di sostanza presente nel campione e viene utilizzata

per l’analisi quantitativa. 8

Idealmente, i picchi cromatografici hanno una forma gaussiana, cioè simmetrica.

La forma del picco è un parametro molto importante perché riflette l’efficienza della separazione e la qualità

del sistema cromatografico.

Un picco può essere descritto matematicamente attraverso diversi parametri, tra cui l’altezza del picco, la

larghezza alla base, la larghezza a metà altezza, il tempo di ritenzione, il volume di ritenzione, il tempo morto ed

il tempo di ritenzione corretto.

TEMPO MORTO (t ) E TEMPO DI RITENZIONE (tR)

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Uno dei parametri più importanti è il tempo di ritenzione (tR), cioè il tempo che un analita impiega per

attraversare la colonna e raggiungere il rivelatore. Questo tempo dipende dall’interazione tra la sostanza

analizzata, la fase mobile e la fase stazionaria.

Per interpretare correttamente il tempo di ritenzione si introduce il concetto di tempo morto (tM o t0): è il tempo

impiegato da una sostanza che non interagisce con la fase stazionaria per attraversare la colonna.

In cromatografia liquida a fase inversa (RP-HPLC) si utilizza spesso l’uracile; mentre nella HPLC normale si usa

spesso l’esano.

Sottraendo il tempo morto dal tempo di ritenzione si ottiene il tempo di ritenzione corretto (t’R), che

rappresenta il tempo effettivo durante il quale l’analita interagisce con la FS.

t’R = tR − tM

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Fattore di ritenzione (fattore di capacità, k’)

Parametro sperimentale usato per descrivere la velocità di migrazione del soluto.

Esprime quanto tempo un composto rimane nella colonna rispetto al tempo necessario da un composto

non trattenuto per attraversarla.

Il fattore di ritenzione rappresenta, quindi, il rapporto tra il tempo trascorso dall’analita nella fase stazionaria e

quello trascorso nella fase mobile.

Inoltre, il fattore di ritenzione dipende anche dalla quantità del soluto nelle due fasi:

In un flusso a velocità costante→la distribuzione del soluto fra la FS e la FM avviene allo stesso modo,

indipendentemente dalla quantità di soluto in colonna ed è regolata dal coefficiente di distribuzione

Si può quindi sostituire il coefficiente di distribuzione nell’equazione del fattore di distribuzione e si ottiene:

Si ha quindi un’equazione che descrive la relazione tra il fattore di ritenzione e il coefficiente di distribuzione,

mettendo in evidenza la dipendenza del k’ dalla natura del soluto (k) e dal tipo di colonna (Vs/Vm).

Ciò è molto utile per il confronto della ritenzione dei picchi cromatografici