Analisi chimiche - Appunti delle lezioni

Analisi chimiche

Fondamentali per la qualità e la sicurezza degli alimenti, si chiede da questi alimenti di non provocare un danno quindi chi produce deve mantenere e garantire la qualità per restare sul mercato.

Una filiera alimentare è formata da azienda che produce, agenzie di controllo e mercato. Per questo si ha la necessità di avere metodi di analisi per controllare quello che si mette sul mercato.

Le analisi sono funzionali anche all’innovazione del prodotto o di processo.

Tra chi produce e chi vende si hanno le Agenzie di controllo che devono, per legge, fare un certo numero di analisi per garantire il consumatore e la concorrenza.

Tutto questo sistema necessita di avere a disposizione adeguati metodi di analisi.

Quando l’analisi viene effettuata a livello di autocontrollo aziendale, si può utilizzare un metodo di analisi interno che soddisfi i miei parametri perché questi non si riflettono sulla salute del consumatore.

Quando ricevo una materia prima posso sempre utilizzare metodi di analisi interni che hanno requisiti meno astringenti.

Nel momento in cui il controllo deve essere adeguato ad un controllo ufficiale, che ha come risultato o l’immissione sul mercato o il sequestro, il metodo di analisi che viene utilizzato deve essere validato, collaudato, secondo una normativa comunitaria che descrive i requisiti che deve avere il metodo analitico. Questo collaudo viene effettuato a livello di circuiti nazionali e internazionali in laboratori di riferimento.

Tra i principi della normativa si ha il ring test -> più laboratori della rete ricevono una serie di campioni e devono analizzare il campione a contenuto noto con il loro metodo e come risultato devono dare la stessa performance che deve seguire date caratteristiche.

La normativa non indica quali metodi devono essere utilizzati.

*Precisione= descrive la riproducibilità di una misura, ovvero la vicinanza di misure ripetute. È descritta da ripetibilità, repliche effettuate sullo stesso campione dallo stesso operatore con la stessa strumentazione, e riproducibilità, stesso campioni ma laboratorio e operatori diversi. Si calcola attraverso deviazione standard e deviazione standard relativa.

*Accuratezza= indica la vicinanza della misura al valore vero o al valore accettato. Si esprime con l’errore assoluto o relativo.

Dal campione al risultato

Il campione deve essere rappresentativo, quindi deve avere le stesse caratteristiche della popolazione intera.

Nel processo analitico dobbiamo sottoporre il campione al metodo di analisi che ci dia poi il risultato, a seconda che sia solido o liquido espressa in massa o volume.

*ppm =microgrammo/grammo (10^-6), ppp=nanogrammo/grammo (10^-9).

*In un risultato di chimica analitica NON si può scrivere che la concentrazione=0 perché si ha il limite minimo di rilevabilità che varia dallo strumento, quindi si riporta la dicitura “inferiore a LOD”.

*Rivedere LOQ, LOD

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Limite di rilevabilità (LOD)= la più piccola quantità determinabile con il metodo con un certo livello di fiducia.

Limite di quantificazione (LOQ)= la più piccola quantità quantificabile con il metodo livello di fiducia superiore.

Componenti del campione

Il campione è formato da:

• Analita: la molecola o il gruppo di molecola che vogliamo andare a determinare, gli oggetti della nostra analisi.
• Matrice: tutti i componenti nel campione che possono o no interagire con l’analita, non danno una risposta al metodo di analisi, ma possono mascherare l’analita al metodo di analisi.
• Interferenti: sostanze diverse dall’analita che producono una risposta proporzionale alla loro concentrazione durante il metodo di analisi. Rispondono al metodo di analisi secondo una legge matematica che si può discostare dalla legge alla quale risponde l’analita. Gli interferenti possono quindi dare un falso positivo, ovvero un campione che non contiene l’analita e che darebbe un segnale inferiore al limite di rilevabilità del metodo invece di dare una risposta che posso utilizzare. Sono sostanze diverse dall’analita che però hanno un comportamento analitico simile, quindi hanno una relazione tra concentrazione e segnale.

Il processo analitico

Stabilizzazione

1. Stabilizzazione= la mancata stabilizzazione comporta una differenza di corrispondenza, quindi un’interferenza. Si va a stabilizzare per garantire che il campione non si modifichi dal momento in cui arriva al momento dell’analisi.

I fattori che possono influenzare la stabilità del campione sono: ossigeno, può essere contenuto nel campione liquido o può venire a contatto con il campione solido, luce, raggi UV che possono dare reazioni di foto ossidazione, enzimi endogeni, naturalmente contenuti nell’alimento, contaminazione microbica, temperatura può influenzare tutti gli agenti indicati perché aumenta la cinetica di queste reazioni, dobbiamo considerare un intervallo all’interno del quale si ha l’aumento di questi fenomeni, un intervallo dove alcuni fenomeni possono essere bloccati, il problema della temp è che al di sopra di alcuni valori si ha una trasformazione della matrice, porta trasformazioni chimiche del campione stesso, può allontanare componenti dell’alimento come i composti volatili.

Allora devo mettere in atto una serie di fattori che limitano questi fenomeni, per l’ossigeno ho due sistemi, per un campione liquido nel porta campioni limito lo spazio di testa, quindi l’ossigeno che rimane è solo quello disciolto che poi si porta in alto; con lo strumento posso gorgogliare gas inerte come azoto nel campione in modo da allontanare l’ossigeno disciolto; la luce si evita usando contenitori opachi che non trattengono la radiazione ultravioletta; gli enzimi possono essere controllati abbassando la temp del campione, controllando il ph del campione, oppure aggiungendo inibitori dell’attività enzimatica, sconsigliato; la contaminazione microbica si controlla lavorando in sterilità, e se è propria dell’alimento devo controllare la crescita batterica con la temperatura.

Omogenizzazione

2. Omogenizzazione: serve per rendere omogenea la matrice e disponibile l’analita al solvente di estrazione. Si ottiene attraverso una triturazione meccanica delle strutture per liberare il più possibile le sostanze da analizzare.

Trattamenti pre-estrazione

2.1 Trattamenti pre-estrazione: consentono di estrarre l’analita in assenza di componenti interferenti.

Gli obiettivi sono: rendere omogenee matrici non omogenee; rendere disponibile l’analita.

I metodi sono: triturazione, triturando il campione aumento la sua aerea superficiale e quindi si raggiunge l’equilibrio di ripartizione verso il mezzo solvente più velocemente che consente agli analiti di diffondere più facilmente, permette solvatazione dell’analita, ma nei processi di triturazione meccanica l’energia meccanica viene trasformata in energia termica e questo può portare instabilità del campione, per controllare l’aumento di temp o metto i contenitori che contengono il campione in un bagno di ghiaccio, oppure utilizzo mixer con lame ceramiche con sistemi che controllano la temp, inoltre nella triturazione posso andare a inglobare ossigeno negativo per il campione, per eliminare ossigeno devo triturare in sottovuoto o con azoto. La triturazione è importante per tutti gli alimenti solidi che non sono omogenei; mescolamento.

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Le problematiche sono: instabilità dell’analita.

Estrazione

3. Estrazione: sono in presenza di due fasi non miscibili fra di loro, quindi, hanno polarità diversa, separazione dell’analita da matrice ed interferenti. Ha come obiettivo il recupero dell’analita, quantitativo, in assenza di interferenti, significa estrarre il 100% dell’analita presente e trasportarlo in una soluzione che contiene solo il solvente di estrazione e l’analita.

I metodi sono:

• Liquido liquido: molto utile perché non necessita di strumentazione, si mettono a contatto due fasi liquide non miscibili e le sostanze migrano in base alla loro polarità.
• L’estrazione con solvente può avvenire anche con una matrice solido quindi si parla di Solido-Liquido. In una tecnica di estrazione è fondamentale l’immiscibilità delle fasi perché altrimenti non le posso separare.
• Spe: estrazione in fase solida, prevede come fase estraente un solido al posto del solvente, invece la matrice da estrarre è un liquido. Funziona come un filtro chimico quindi ci sono molecole, palline di gel di silice funzionalizzate che trattengono l’analita, in grado di trattenerne altre sulla base dell’affinità chimica della fase estraente con i composti con cui viene a contatto. Si usano le colonnine spe che lavorano in ritenzione di analita o ritenzione di interferenti.
• Spme: estrazione dove si hanno due fasi non miscibili fra di loro messe a contatto, la fase estraente è un solido contenuta al di sopra di un cilindretto sottile fatto di silice fusa, ma la fase attiva di questo cilindro sono materiali polimerici che vengono depositati, e la fase che viene estratta.
• Ase: da al solvente che abbiamo scelto di usare per estrarre 2 caratteristiche -> trovarsi a elevata temp e elevata pressione. Si effettua con un apparecchio dove ho una bombola.

Tutte le tecniche si basano sulla differente riparazione che l’analita ha tra la fase campione e quella estraente, rivedere coefficiente di ripartizione. Quando faccio un’estrazione cerco di mettere a contatto il campione con una fase che sia in grado di legare quello che voglio estrarre, in base anche alla polarità.

Se ho una matrice lipofila liquida, olio evo, e la metto a contatto con un solvente polare, miscela idroalcolica 20%metanolo 80%acqua, le sostanze più polari disciolti nella matrice lipofila si ripartiscono nel solvente polare, semplicemente perché sono più solubili nel solvente polare, questo è un metodo liquido liquido usato per estrarre dall’olio le sostanze fenoliche.

Per calcolare il coefficiente di ripartizione le due fasi devono non essere miscibili tra di loro, il coefficiente di ripartizione è dato dal rapporto tra

Purificazione

4. Purificazione: ulteriore separazione che allontana i residui di componenti che non vengono estratti nella fase precedente. Ha come obiettivo l’eliminazione di possibili interferenti in funzione della metodica analitica utilizzata.

Per fare la purificazione sfrutto la capacità di alcune molecole, anticorpi, di riconoscere selettivamente strutture; o sfrutto sistemi che escludono le molecole che hanno un taglio diverso da quello di mio interesse colonne che sono setacci molecolari che selezionano in base alla dimensione.

Se il metodo di analisi è molto selettivo si hanno i metodi rapidi di analisi che allontanano tutto ciò che non è di mio interesse. Con le tecniche strumentali posso invece avere interferenti.

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Per valutare che un’estrazione sia efficiente, efficacie e quantitativa si fanno gli studi di recupero.

Definizioni e strumenti

Coefficiente di ripartizione= rapporto tra le concentrazioni di un composto all’interno delle due fasi di una miscela di due liquidi immiscibili all’equilibrio. Ci dice come il nostro analita si ripartisce nelle due fasi.

Soluzione= miscela omogenea composta da solvente e soluto

Diffusione= metodo con il quale si ha trasporto di massa/trasporto di membrana

Solubilità= massima quantità in grammi di soluto che, a una data temp, può essere disciolta in 100g di solvente

*Diluizioni= per fare una curva di calibrazione è necessario conoscere l’equazione della diluizione (M1XV1=M2XV2). Le diluizione seriali hanno un grande vantaggio in chimica analiticaà l’incertezza della pesata di uno standard secondario vene diminuito mano mano che procedo con le diluizioni, mentre se procedessi con 5 pesate diverse manterrei lo stesso errore.

*Rivedi titolazioni

*Essiccatore= si usa per le analisi chimiche (mg/g in s.s.) per allontanare residui di acqua nel campione. Dopo aver scaldato il campione in stufa non posso pesare direttamente sulla bilancia ma occorrono dei cicli di raffreddamento che avvengono nell’essiccatore che mantiene a temp ambiente. L’essiccatore tramite gel di silice richiama acqua, è ermeticamente chiuso. Quindi serve per raffreddare sostanze mantenendole in assenza di umidità.

Per pesare i volumi gli strumenti che abbiamo per avere la massima precisione sono i palloni, batracci tarati.

Quando si effettua una titolazione l’errore più comune è legata ad una sottostima/sovrastima a causa della sbagliata visione da parte dell’operatore, si usano quindi pipette graduate.

Le micropipette lavorano con volumi molto piccoli, sono utili quando si maneggiano volumi di ordine di decine di microlitri.

Spe per estrazione polifenoli dall’olio

Spe per estrazione polifenoli dall’olio= i polifenoli hanno elevata capacità antiossidante, sono in grado di effettuare attività contro ros e rns.

L’olio è una matrice difficile con cui lavorare perché è grassa. I polifenoli nell’olio sono n mezzo ad acidi grassi, steroli, alcoli, tutte molecole apolari.

Per solubilizzare l’olio si usa l’esano che è apolare.

Per estrarre con la colonna si deve prima:

• Condizionamento= apro le catene c18, funzionalizzate sul gel di silice, per renderle disponibili a ricevere l’analita. Si fa con metanolo ed esano, come apro le catene creo solvatazione intorno alle catene, l’estrazione avviene all’interfaccia, affinchè l’analita passi nella colonna e venga trattenuto dalla fase solida.
• Le interazioni che ci sono tra analita e fase solida NON sono covalenti, ma sono deboli così che sono facili da disequilibrare e poter recuperare analita.
• Caricamento del campione
• Lavaggi colonna= lavo dalla fase solida con esano tutto ciò che non voglio e tiro via interferenti. Lo faccio con il coefficiente di ripartizione, trovo un solvente che sia affine a quello che non mi interessa così da staccarlo dalla fase solida.
• Recupero analita=metto un solvente, metanolo in questo caso, per eluire l’analita dalla colonna.
• Analisi = può essere cromatografica, ottica, elettrochimica.

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La spe ci permette di fare un’estrazione, ma anche di concentrare l’analita, ci permette di purificare il campione.

Ci permette di cambiare il solvente, parto da analita in esano, finisco con analita in metanolo.

Preparazione del campione

Tecniche estrattive

Tecniche estrattive: quando bisogna scegliere la tecnica, la scegliamo conoscendo il campione, il metodo di analisi e conoscendo la composizione chimica con cui abbiamo a che fare -> quindi la natura del quesito analitico.

Bisogna conoscere la natura del campione -> solido, gassoso, liquido

Natura dell’analita -> struttura chimica dell’analita

Strumentazione analitica disponibile.

Natura del quesito

Natura del quesito:

• Analisi di tracce
• Analisi multicomponente
• Analisi quali e quantitative

Ad esempio i polifenoli possono essere analizzati sia come classe di composti attraverso un metodo colorimetrico che sfrutta reazione classe specifica che porta allo sviluppo di una colorazione, in questo modo conosco il quantitativo.

*I fenoli contengono gruppi fenolici con uno o più h che in base ai sostituenti hanno delle caratteristiche. Esempio ortodifenolo = maggiori anti ossidanti perché hanno 2 fenoli in posizione orto.

L’analisi multicomponente permette di individuare la presenza di molecole e la loro quantità. L’analisi classe specifica invece no.

Natura del campione

Natura del campione:

• Solida, liquida, gassosa
• Semplice o complessa
• Interazioni analiti-matrice -> sono interazioni o di natura dipolo-dipolo, cariche che permettono all’analita di interagire con la matrice carica.
• Concentrazione presunta dell’analita in matrice -> possiamo avere analisi nell’ordine del nanogrammo, microgrammo o quantità maggiori. La concentrazione presunta è fondamentale per indirizzare la procedura di estrazione da usare perché più basso è il livello di analita, maggiore sarà la possibilità di avere estrazioni non quantitative ma accettabili come valore.

Natura analita

Natura analita:

• Determina le proprietà chimico-fisiche della sostanza, a temp e a pressione ambiente quell’analità è liquido/solido/gas.
• Conoscere reattività -> posso sfruttare alcuni gruppi funzionali della molecola a fini analitici, ch3cooh ch3 + c=ooh, la reattività è utile perché una sostanza può essere non rilevabileà tramite una misura spettrofotometrica ma avere gruppi funzionali ed essere funzionalizzata.

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Nei gruppi reattivi posso funzionalizzare, aggiungere un struttura per rendere rilevabile una molecole che non lo è.

*La reattività è anche utile per i sistemi di derivatizzazione, magari la struttura non è identificabile da una spettrofotometria ma magari ha gruppi funzionali reattivi per cui se uso un eccesso di reagente con un derivatore, leghiamo questi derivatori, rilevabili, facendoli reagire con il gruppo funzionale dell’analita, ovviamente la reazione deve procedere velocemente.

• Rilevabilità analitica -> presenza di gruppi rilevabili

Preparazione campione=operazione di laboratorio che consiste nel rendere il campione adatto alla tecnica analitica prescelta.

Dovremo usare solventi appropriati, la maggior parte delle tecniche avviene con soluzioni, che deve avere la caratteristica di solubilizzare o completamente il campione o solubilizzare solo parte del campione di mio interesse, in questo caso dovremo fare una separazione della parte non disciolta.

Bisogna controllare poi il ph, usare un ph che porti la sostanza o nella forma indissociata o dissociata perché poi si riversa sull’efficienza dell’estrazione, recupero, ma anche per avere un coefficiente molare medio rilevabile.

Dobbiamo aver presente quale concentrazione ci aspettiamo e quale è l’intervallo misurabile che il mio metodo ha, intervallo tra l