Tecniche biotecnologiche e il ruolo del DNA ricombinante

Possiamo definire biotecnologie tutte quelle tecniche che, basandosi sull’utilizzo di organismi viventi o di loro derivati, siano volte alla produzione di sostanze specifiche. Le conoscenze chimiche sulla struttura degli acidi nucleici, sulle proprietà di determinati enzimi e sulle regole di complementarietà delle basi sono il punto di partenza per manipolare il DNA.

Tecnica del DNA ricombinante

La tecnica del DNA ricombinante è alla base delle moderne biotecnologie perché permette di inserire nel genoma di un organismo a nostra scelta un segmento di DNA proveniente da un altro genoma di un altro organismo e quindi ciò permette di far riprodurre una determinata proteina all’interno dell’organismo ricevente.

Produzione di insulina ricombinante

L’esempio più classico di questo procedimento è fornito dalla produzione dell’insulina ricombinante in cui il batterio Escherichia coli è stato geneticamente modificato.

La tecnica consiste nell’isolare il gene di interesse, inserirlo in un vettore, un elemento del DNA che permetta di inserirlo all’interno del genoma dell’organismo ricevente e far sì che il segmento di DNA sia trascritto e tradotto in proteina.

Vantaggi del DNA ricombinante

E’ una tecnica vantaggiosa dal momento che il segmento di DNA inserito in un altro elemento è in grado di essere integrato stabilmente all’interno del genoma dell’organismo ricevente, quindi anche le cellule figlie dell’organismo iniziale in cui avviene l’inserimento del DNA ricombinante saranno in grado di mantenere l’informazione genetica e continuare a produrre la proteina che si vuole far produrre all’organismo.

E’ importante, inoltre, il sistema biologico in cui si sceglie di far tradurre una proteina scelta:

1. Batteri che sono degli organismi più semplici
2. Virus
3. Cellule di mammifero

Scelta dell'organismo ricevente

La scelta dell’organismo ricevente è determinata dalla grandezza del frammento di DNA che si deve inserire, quindi più il frammento è piccolo meno sarà necessario spazio e complessità, per cui si potrebbe utilizzare un batterio mentre più il segmento è grande più l’organismo ospitante dovrà essere grande e complesso (virus o cellule di mammifero).

Ruolo dei vettori

I vettori sono quegli elementi che permettono di trasferire il DNA ricombinante all’interno nella cellula ospite nel quale la sequenza del DNA verrà trascritta e tradotta.

Si parla, perciò, di plasmidi, ovvero elementi di DNA batterico che hanno una forma circolare e sono in grado di replicarsi all’interno dell’organismo in cui vengono inseriti.

Sono denominati materiale genetico accessorio, poiché al loro interno essi non contengono tratti codificanti necessari alla vita o alla replicazione del batterio, bensì includono delle regioni che codificano per geni non indispensabili alla sopravvivenza, ma che la rendono migliore.

Raramente i plasmidi presentano omologie di sequenza con la molecola di DNA cromosomico e per questo motivo vengono anche considerati come materiale genetico estraneo.

Isolamento del gene di interesse

Il primo passaggio è quello di isolare il gene dal genoma da cui lo si preleva. Ciò avviene grazie a degli enzimi di restrizione (proteine sintetizzate dai batteri per proteggersi dalle infezioni virali) che sono in grado di tagliare il DNA in punti precisi. Quello più versatile e utilizzato è “ecor1 (one)” che riconosce la sequenza di basi azotate G-A-A-T-T-C. Questo enzima di riduzione è lo stesso che viene usato per tagliare il plasmide, quindi il vettore in cui il frammento deve essere inserito. In questo modo le estremità saranno compatibili e il frammento di DNA si potrà inserire all’interno del plasmide tagliato. I legami tra i nucleotidi saranno ristabiliti attraverso una DNA ligasi che è in grado di riformare il legame tra i nucleotidi partendo da un gruppo H di un nucleoide e un gruppo fosfato del nucleotide adiacente.

Inserimento del plasmide

Il secondo passaggio è l’inserimento del plasmide all’interno del sistema biologico. Ciò avviene mettendo entrambi gli elementi all’interno di una soluzione di calcio cloruro. Gli ioni calcio si attaccano alla parete dell’organismo. Alzando la temperatura a circa 42 gradi per un tempo di circa 30 secondi, avviene uno shock termico in grado di creare dei pori sulla membrana dell’organismo e fanno entrare il DNA ricombinante all’ interno di esso (integrazione). Questo processo, però, avviene con successo solamente su una cellula su 5. Bisognerà, quindi, andare a selezionare le cellule in cui è avvenuta l’integrazione e metterle in coltura per ottenere in grande scala il prodotto che serve. In questo processo il vettore è fondamentale in quanto è l’elemento che consente al DNA ricombinante di entrare nell’organismo ospitante. In particolare è necessario un vettore d’espressione, ossia un vettore che contenga anche il promotore della trascrizione del batterio o dell’organismo in cui si reinserisce il DNA ricombinante.

Clonaggio e selezione delle cellule

Tutta questa prima fase si chiama clonaggio del gene di interesse.

Il vettore è, inoltre, fondamentale per la selezione delle cellule in cui l’integrazione è avvenuta perché nel vettore stesso verranno inserite delle sequenze geniche che siano in grado di creare delle resistenze rispetto a diversi antibiotici. In questo modo all’interno della coltura in si hanno diversi organismi in cui non si sa esattamente quale di essi contengano il DNA ricombinante, quando di va ad immettere un antibiotico si otterrà che solamente le cellule che codificano per i geni della resistenza l’antibiotico inserito riusciranno a sopravvivere.

Nelle cellule rimanenti si potrà ingegnerizzare il sistema in modo tale che riesca ad espellere nel mezzo la proteina ricombinante di interesse.