Diagnostica in genetica medica

Lezione 1 – 03/06/2020

Diagnostica in genetica medica – prof. Massimo Gennarelli

Malattie neuromuscolari

L’oggetto della lezione sono le malattie neuromuscolari e tutto ciò legato alla diagnostica genetica, oltre che ai test genetici relativi a queste malattie.

Tra le malattie neuromuscolari vi sono le distrofie muscolari ma ne esistono anche altre, definite a loro volta distrofie muscolari, nonostante non siano dovute prettamente a difetti della costituzione fisica del muscolo oppure a un’alterazione muscolare, ma sono caratterizzate dall’alterazione della funzione delle placche neuromuscolari e del trasporto sinaptico dei segnali all’interno delle fibre muscolari che causano anomalie nel funzionamento fisiologico del muscolo.

Ci sono poi delle miopatie metaboliche legate a problemi metabolici e quindi all’accumulo di diverse sostanze all’interno della fibra muscolare.

Tra i muscoli del corpo è compreso ovviamente anche il cuore e quindi molte volte le distrofie hanno una maggiore prevalenza ed effetto a livello del sistema cardiaco (cardiomiopatie ereditarie).

Vi sono inoltre malattie che non interessano direttamente il muscolo in sé, ma sono dovute a problemi di autoimmunità, malattie che colpiscono specificatamente il motoneurone o alcune strutture del midollo spinale come per esempio le atrofie muscolari spinali (Es. la sclerosi laterale amiotrofica che causano un deficit del sistema neuromuscolare).

Vi sono poi le atassie spino-cerebellari caratterizzate anche da alterazioni a livello del sistema nervoso centrale che possono creare problemi nel controllo e nella gestione del movimento e del coordinamento.

Infine, esistono malattie che hanno influenza sempre a livello del movimento, ma perché viene inficiato il sistema di trasferimento delle informazioni e dei segnali anche a livello periferico, sono classificate come neuropatie più sensitivo-motorie oltre ad altre patologie legate a paresi spastiche o tremori.

Distrofia muscolare

Nelle varie forme di distrofie muscolari vi sono alcune caratteristiche comuni come: la presenza di morte a livello delle cellule muscolari con tentativi di rigenerazione parziale che spesso non portano alla ricostituzione completa di una fibra perfettamente funzionante, e normalmente quando c’è morte cellulare, come conseguenza, vi è anche l’infiltrazione di tessuto connettivo fibroso o di tessuto adiposo.

Nella figura 1 si osserva come, dal punto di vista istologico, dovrebbero esserci tutta una serie di fibre regolari ma ci sono molte fibre in necrosi con un’alterazione ben evidente e con infiltrazioni di tessuto grasso (zone più chiare). È evidente in questa biopsia una sofferenza muscolare e un problema rilevante nella funzionalità del muscolo, specialmente quello scheletrico.

Gli effetti di questa condizione portano a: Figura 1

• Debolezza muscolare.
• Alterazioni della postura e dell’andatura (a volte completamente compromessa).
• Alterazioni delle masse muscolari in diversi distretti del corpo, in alcuni casi queste alterazioni sono localizzate nel cingolo scapolare o nel cingolo pelvico.

Vi è una certa differenziazione di queste patologie dovuta alla compromissione di alcuni muscoli particolari in specifici distretti. Differenze patologiche sfruttate per classificare e descrivere le differenti distrofie (esempi: distrofia facciale, distrofia dei cingoli, cardiomiopatie…).

Nella distrofia muscolare di Duchenne e di Becker vi è il coinvolgimento di quasi tutti i muscoli scheletrici compreso il miocardio. Altre distrofie vengono definite come distrofie dei cingoli oppure facio-scapolo-omerali, distrofie distali (interessano solo muscoli distali) ma anche distrofie che colpiscono muscoli specifici come i muscoli oculari.

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Quindi ci possono essere distretti corporei particolarmente compromessi e ciò può essere dovuto all’alterazione di determinati geni che hanno una particolare funzione in un determinato periodo dello sviluppo.

Dal punto di vista genetico le distrofie possono essere sia autosomiche dominanti sia autosomiche recessive e anche X-linked come la distrofia muscolare di Duchenne e di Becker che hanno una serie di compromissioni che le rendono differenti dal punto di vista dei soggetti affetti, infatti colpisce quasi esclusivamente i maschi mentre le femmine possono esserne affette solo in particolari condizioni molto rare, infatti la distrofia di Duchenne in omozigosi è altamente improbabile se non impossibile.

Distrofia muscolare miotonica

La distrofia muscolare miotonica è una delle forme autosomiche dominanti più diffuse negli adulti, in questo caso la mutazione viene detta dinamica poiché dovuta dall’espansione di una tripletta in una regione non codificante.

Dal punto di vista funzionale c’è una certa eterogeneità dei distretti genomici colpiti e ciò porta inevitabilmente ad un’eterogeneità clinica mostrata da diversi pazienti (figura 2). Vi è una eterogeneità quindi legata Figura 2 alla modalità di trasmissione e alla genetica (autosomico dominante/recessiva o X-linked) ed esistono modelli di malattia specifici come nel caso di espansioni di una tripletta ripetuta. Vi è una grossa eterogeneità anche nella gravità e in particolare nell’esordio della malattia.

Infatti, nella distrofia dei cingoli vi sono moltissime forme sia dominanti che recessive con numerosi geni coinvolti che codificano per proteine alterate, vi sono forme che possono essere congenite (con esordio nei primi anni dell’infanzia) ed altre che esordiscono nell’adulto. Nel caso della distrofia di Duchenne l’esordio avviene in genere prima dei 5 anni di vita, mentre nella distrofia di Becker solitamente nella 2° o 3° decade di vita. Per quanto riguarda la distrofia miotonica vi è una grossa variabilità di esordio. Si può avere una differente compromissione anche dal punto di vista della sintomatologia: debolezza muscolare, ipotonia (mancanza di tono muscolare). In alcuni casi sono malattie molto progressive e quindi prima esordiscono e più gravi diventano col passare del tempo mentre altre volte si mantengono più stabili.

Viene spesso coinvolto il sistema cardiaco ma anche il sistema nervoso centrale causando problematiche specifiche legate alle capacità cognitive (ritardo mentale) o alla formazione del SNC stesso.

Essenzialmente i geni colpiti si esprimono prevalentemente a livello del tessuto muscolare, ma in alcuni casi gli stessi geni mutati possono esprimersi anche a livello del sistema nervoso centrale.

Numerosi anni fa si notò che alcuni bambini avevano difficoltà ad alzarsi e facevano un tipico movimento: prima eseguivano l’estensione delle gambe e dopo si alzavano con le braccia. Questo fu denominato segno di Gowers e per molto tempo tutte queste malattie che mostravano questo aspetto tipico furono chiamate malattie di Gowers.

Poi si notò che questo segno caratteristico era presente maggiormente in particolari tipologie di distrofie muscolari in particolare quella di Duchenne.

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Segno di Gowers

Caratteristiche cliniche della distrofia di Duchenne

È una patologia che presenta un esordio molto precoce, i pazienti mostrano il segno di Gowers a partire dai 3 anni con andatura anserina (dondolante), inoltre è presente la perdita progressiva della forza.

L’esordio avviene durante 1° decade di vita e il soggetto perde molto rapidamente la forza muscolare, necessitando della sedia a rotelle.

In alcuni casi si deve ricorrere precocemente ad interventi di fisioterapia e di chirurgia per poter migliorare la vita del paziente e rallentare la progressione della patologia, anche se alla fine si ha comunque un aumento della gravità sino a circa ai 20 anni quando iniziano i problemi più gravi tra cui c’è una notevole difficoltà respiratoria e problemi cardiaci (compromissioni principali).

Sono coinvolti un gran numero di muscoli, compresi cuore e muscolatura liscia del sistema gastrointestinale, creando inevitabilmente problemi anche a livello di questo distretto. Spesso sono presenti problemi a livello cognitivo legati a ritardi psico-motori e psico-cognitivi, dovuti al fatto che sono presenti fisiologicamente isoforme di distrofina (proteina che nel caso della distrofia muscolare di Duchenne risulta essere mutata) che hanno una specifica funzione anche a livello cerebrale.

Il gene è stato scoperto alla fine degli anni ‘80 (1986-1987) ma tuttora non sono stati introdotti significativi miglioramenti nell’approccio terapeutico. Sono state migliorate le tecniche di riabilitazione respiratoria e il contenimento di alcuni sintomi cardiaci, ma di fatto resta una malattia che non ha una cura definitiva¹.

È una malattia molto grave e ha una compromissione dal punto di vista sistemico ma soprattutto a livello muscolare che porta a morte circa alla 3°-4° decade di vita.

La diagnosi viene effettuata osservando anche delle analisi strumentali, come l’elettromiografia che è un sistema utilizzato per vedere il funzionamento delle fibre muscolari, utilizzata spesso anche per diagnosi differenziali.

Di solito la conferma avviene anche mediante prelievo bioptico poiché nella maggior parte dei casi, vi è un quadro degenerativo necrotico tipico di questa patologia.

Gene responsabile e trasmissione X-linked

È una malattia legata al cromosoma X, ciò è stato intuito dallo studio degli alberi genealogici, successivamente è stato possibile identificare una regione specifica del braccio corto nella regione Xp21.1 e Xp21.2, regione scoperta semplicemente perché vi erano dei soggetti di sesso femminile che manifestavano la distrofia di Becker, non erano soggetti omozigoti, ma avevano una traslocazione X-autosomica e il punto di rottura era situato appunto in questa regione del braccio corto (Xp21.1/21.2). Traslocazioni bilanciate normalmente potrebbero non avere effetti fenotipici, però quando si rompe un gene possono insorgere dei problemi.

In questo caso vi era un’ulteriore complicazione, infatti l’inattivazione funzionava solo sull’X normale e quindi questi soggetti avevano solo l’X traslocato funzionante, e siccome si andava a rompere un gene nel braccio corto nel punto di rottura della traslocazione questo ha portato alla mappatura della regione del locus per la distrofia muscolare di Duchenne.

Successivamente sono stati individuati anche soggetti che possedevano una microdelezione, visibile dal punto di vista citogenetico ad alta risoluzione proprio in quella regione precedentemente identificata. Utilizzando il DNA di questi pazienti poi si è potuto identificare definitivamente il gene.

¹ Nell’ultima lezione del corso si parlerà di terapie specifiche per malattie genetiche e si farà qualche riferimento sulla distrofia di Duchenne poiché si sta introducendo qualche nuova possibilità di terapia innovativa.

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Essendo ancora nel periodo precedente al sequenziamento genomico (“epoca pre-genomica”), il procedimento per l’identificazione genetica di una patologia prevedeva: prima di mappare il locus malattia con aberrazioni citogenetiche o con analisi di associazione su molte famiglie. Solo successivamente si analizzavano quali geni erano presenti in quelle regioni, e se erano presenti mutazioni.

In questo caso è stato molto semplice poiché una volta localizzata la zona ed una volta capito che c’era un gene molto grande (gene per la distrofina) si scoprì che nei pazienti mancavano porzioni di quest’ultimo. Questo gene si esprime a livello di tanti distretti corporei, compreso il sistema nervoso centrale.

In figura 3 si può osservare un tipico albero genealogico di una malattia legata all’X. Se si avesse solamente un pedigree di questo tipo (rettangolo blu) non si avrebbe la certezza che la signora in questione sia portatrice (cerchiata in rosso). Ma se ci sono più casi in famiglia (nel caso della figura 3, l’intero albero presente nell’immagine) si può dimostrare che la donna è sicuramente portatrice.

Sapere quindi che c’è un unico caso in famiglia o se ce n’è Figura 3 più di uno è importante, poiché proprio nel caso della distrofia muscolare di Duchenne si sa che più di 1/3 dei casi sono dovuti a mutazioni de novo, quindi si potrebbe pensare che la femmina presa in considerazione precedentemente non sia portatrice.

Questo è rilevante perché se la signora non fosse portatrice non è presente nessun rischio di avere un ulteriore figlio affetto, mentre se fosse portatrice potrebbe avere una probabilità del 50% di avere figli maschi affetti. Successivamente si potrà cercare la mutazione nel figlio affetto, vedendo se la madre la possiede la stessa mutazione in eterozigosi (condizione necessaria per essere portatrice sana) confermando l’ipotesi che sia o non sia una portatrice sana.

Un individuo di sesso femminile, in casi molto rari, può manifestare il fenotipo patologico semplicemente perché, per qualche motivo, viene inattivato preferenzialmente l’X normale e viene mantenuto attivo il cromosoma X patologico (es. traslocazioni X-autosomiche).

Per definire e confermare delle donne portatrici si deve effettuare una diagnosi strumentale o un’analisi genetica, perché in alcuni casi la presenza della mutazione (X) viene espressa nel 50% (condizione bilanciata normale dell’espressione del cromosoma X) delle cellule, mentre le restanti cellule presentano l’espressione del cromosoma X non patologico. Ciò è determinante del fatto che non è sufficiente per l’insorgenza dei sintomi della distrofia, anche se potrebbero essere presenti dei segni di sofferenza muscolare. Nella situazione in cui si ha sofferenza muscolare nella madre e il figlio è affetto, allora è molto probabile che la donna sia portatrice.

Distrofina e struttura della cellula muscolare

Il gene responsabile della distrofia muscolare di Duchenne è molto grande, è costituito da 2.4 Mb, 85 esoni e soprattutto ha una funzione importante, perché codificata per una proteina che serve da ancoraggio tra sarcolemma (membrana della cellula muscolare) e il citoscheletro, formato da F-actina della fibra muscolare.

La proteina codificata ha 2 terminazioni, una N-terminale e una C-terminale che sono fondamentali, infatti se manca uno dei due, non avverrà l’aggancio del sarcolemma con il citoscheletro, che per la cellula muscolare è una condizione fondamentale poiché sottoposta ad una trazione molto forte. (Figura 4) Figura 4

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Se manca la proteina vi è una alterazione strutturale di tutta la cellula muscolare. A B C

Attraverso l’utilizzo di un anticorpo specifico in grado di produrre una reazione di immunofluorescenza verso la distrofina si può osservare (figura 5):

• Soggetto sano: (fig.5A distrofina, fig.5B a-sarcoglicano, fig.5C laminina a2) le proteine d’interesse localizzate vicino alla membrana, è in quantità sufficiente e disposte in maniera eterogenea in tutte le cellule; Figura 5.
• Soggetto Duchenne (D,E,F rispettivamente la mancanza delle proteine rispetto alle immagini corrispondenti sovrastanti A,B,C): l’anticorpo non trova nulla a cui legarsi, quindi manca la porzione di proteina ricercata. Lo stesso principio lo si può sfruttare anche per altre forme di distrofie muscolari in cui vi è la mutazione di a-sarcoglicano (figura 5E) o di laminina a2 (figura 5F). L’immunofluorescenza sarà in grado di mostrare la mancanza della proteina completare, e se ciò dovesse verificarsi, il risultato della diagnosi sarebbe positivo, quindi il soggetto affetto dalla distrofia muscolare di Duchenne.

Distrofia muscolare di Becker e diagnosi molecolare delle distrofie muscolari

È possibile però che altri domini proteici, caratterizzati da segmenti a tripla elica, potrebbero essere assenti, mantenendo ugualmente la funzionalità fisiologica della proteina (almeno parzialmente) ed è ciò che accade per la distrofia muscolare di Becker. Anch’essa è una distrofinopatia in cui vi è un’anomalia a livello della distrofina. È una forma meno grave, ma ci sono comunque indicatori di sofferenza muscolare con degli elevati livelli di creatin-chinasi (CK) e la presenza di un’elettromiografia alterata con quadro di sofferenza primitiva delle fibre muscolari.

Dal punto di vista della distrofia di Becker è presente una certa quantità di proteina funzionante ma che risulta ugualmente alterata e distribuita in maniera non omogenea.

Se si deve effettuare una diagnosi di questa patologia, dal punto di vista molecolare, è possibile individuare la presenza di una mutazione all’interno del gene della distrofina. Si potrebbe effettuare il sequenziamento completo dell’individuo affetto di sesso maschile, anche se non risulta essere l’approccio più ottimale. È possibile sequenziare unicamente: il cromosoma X, il gene della distrofina oppure si può effettuare una PCR (amplificazione enzimatica in vitro) degli esoni in posizione 45-46 che sono degli hotspot di delezione, dove si noterebbe, attraverso purificazione in vitro, dei buchi a livello dell’elettroforesi (indice di delezione avvenuta). Nei casi in cui vi siano dei buchi a livello dell’elettroforesi su gel, quindi la vera e propria assenza di determinate bande, è indicativo di una delezione. (figura 6)

Figura 6

Quindi è abbastanza semplice effettuare una conferma diagnostica dal punto di vista molecolare della mutazione più prevalente del gene responsabile, in questo caso è la delezione.

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Si può eseguire anche una elettroforesi capillare e successivamente analizzare i vari picchi risultanti (ogni picco corrisponde ad un esone).

Ad esempio, se il bambino presenta una delezione dell’esone 53, è possibile effettuare un’analisi quantitativa anche della madre per vedere se anch&rsqu