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Chimica delle fermentazioni - Lezione 3 - 05/10/2021

Batteri lattici

Sono quei microrganismi che convergono composti carboniosi organici in acido lattico. La produzione di un acido organico dà come risultato l’acidificazione della fermentazione. Un elemento importante legato agli acidi organici è che i diversi acidi organici hanno caratteristiche diverse e, come vedremo nell’acido lattico, è lo stereoisomero di esso. Quindi tutti quegli acidi organici in cui abbiamo una chiralità è un elemento importante per le caratteristiche del prodotto.

Quando parliamo di amminoacidi proteinogenici (gli amminoacidi proteinogenici sono gli amminoacidi precursori delle proteine) parliamo di L-amminoacidi, poi ci sono dei contesti in cui si parla di D-a.a. che costituiscono la parete batterica. Nel contesto di acido lattico abbiamo microrganismi capaci di produrre L-lattato, altri che producono D-lattato e altri che producono una miscela racemica D-L. In quest’ultimi, D-L possono essere in concentrazioni maggiori o minori ciascuno. Nei processi industriali le forme D o L ottenute possono essere convertite da D a L attraverso enzimi specifici.

Quando parliamo di acido lattico come prodotto finale, lo si associa a batteri lattici (LAB) che sono organismo diversi tra di loro dal punto di vista tassonomico e metabolico. LAB sono stati studiati e isolati a partire da fermenti fermentati acidi. Nell’ambito alimentare l’acido lattico può essere un elemento di pregio o negativo che può portare all’alterazione di un prodotto.

L’acido lattico presenta un gruppo carbossilico e alcolico, un punto di ebollizione di 122 gradi, un punto di fusione di 17 gradi, ha un' elevata solubilità in acqua, è stabile in condizioni normali, ha un pKa di 3.73. Ha attività antibatterica in cui ci sono differenze tra la forma D e L. L’attività antimicrobica è rivolta a batteri gram negativi (differiscono dai positivi per la diversa sensibilità della parete cellulare).

Ci sono due enzimi differenti che riconoscono o L-lattato o D-lattato: L-lattato deidrogenasi e D-lattato deidrogenasi. La reazione con questi due enzimi coinvolge il NAD⁺ come cofattore. Misurando la quantità di NADH che si forma, siccome i rapporti sono isomolari, per ogni mole di NADH che si forma, una mole L-lattato è stata convertita nell’acido corrispondente. Se si va ad aggiungere l’altro enzima (D-lattato) e mi si continua a consumare NADH significa che oltre all’L si ha anche il D. Queste reazioni sono sfruttate per vedere quale acido lattico si ha.

Nel nostro organismo vengono prodotti entrambi questi enzimi, soltanto che la D-lattato deidrogenasi viene prodotto in quantità bassa o essere assunto attraverso alimenti. Se non si rimuove si ha l’acidosi, lo smaltimento è per via fecale o per via enzimatica. Se lo smaltimento non è efficace lo ritroviamo nelle urine.

Nel nostro sistema nervoso abbiamo gli astrociti che producono lattato, il quale è un neurotrasmettitore che comunica ai neuroni. Questo è per evidenziare che a livello evolutivo la produzione di lattato è stata adattata per la comunicazione tra le due cellule.

Caratteristiche di LAB

• Gram positivi a forma di cocco o bastoncello;
• Non producono spore. È fondamentale perché solo i gram positivi producono spore (per esempio gli actinomiceti sono gram positivi);
• Non sono mobili;
• Il contenuto in GC è basso (ricco in AT).

Dal punto di vista metabolico i batteri lattici fermentano glucosio producendo acido lattico o acido lattico + anidride carbonica ed etanolo. Sono catalisi negativi e sono tolleranti agli acidi (la cellula o espelle l’acido oppure lo converte in qualcos’altro).

Applicazione dei batteri lattici

I batteri lattici possono essere collegati alla produzione di colture starter, oppure essere collegate alla produzione di probiotici. Nell’agroindustria i LAB sono collegati alla produzione di alimenti lattici. Come per altri sistemi biologici i LAB sono di per sé un sistema studiato da un punto di vista biotecnologico ma anche modello di studi per sviluppare processi metabolici non convenzionali.

I LAB si possono manipolare geneticamente per produrre delle sostanze come poli-oli, vitamine, alanina, butanolo, etanolo, zuccheri complessi ecc. Dal punto di vista tassonomico i batteri lattici sono tanti e a seconda dei sistemi che andiamo a considerare ci sono tanti tipi. Nell’ambito caseario, per esempio, i LAB sono i microrganismi che interagiscono positivamente con altri organismi, sanno vivere in comunità. Per esempio, con la produzione del cacao dove interagiscono batteri lattici e lieviti.

La produzione di acido lattico può essere ottenuta da altri microrganismi (da lieviti, funghi) e dobbiamo andare a considerare quale forma di acido lattico è prodotto, il tipo di fermentazione che porta alla produzione di acido lattico può essere classificata come omo o etero-fermentazione. In alcuni sistemi la produzione di lattato avviene a partire da glucosio o da pentosi come xilosio. Ci sono alcuni microrganismi che producono enzimi idrolitici capaci di lavorare su polimeri come l’amido che liberano unità di glucosio che vengono convertite in lattato. Questo implica che gli enzimi idrolitici sono prodotti dall’organismo che fa fermentazione.

Il terreno M17 è utilizzato per far crescere batteri lattici come streptococchi soggetti a batteriofagi. Questo terreno contiene un pH neutro ed estratti complessi. Infatti, una delle caratteristiche dei LAB è quella di avere esigenze nutrizionali complesse. Il terreno selettivo per gli Lactobacillus ha composizione complesse come il terreno MRS è un terreno con composizione complessa.

La classificazione più semplice dei batteri lattici è quanti moli di lattato producono dal glucosio.

Chimica delle fermentazioni - Lezione 4 - 07/10/21

Fermentazione lattica

Nel processo di fermentazione non c’è bisogno di ossigeno e del sistema di trasporto elettronico per svolgere la funzione di accettore finale di elettroni che vengono estratti dalla fonte carboniosa. Ma questo non significa che non ci sia il trasporto di elettroni. Nel caso della fermentazione lattica abbiamo che il piruvato dona gli elettroni all’acido lattico attraverso la reazione ossidoriduttiva.

Il numero di molecole di ATP che vengono prodotte attraverso la fosforilazione a livello di substrato sono 2 moli di ATP per 1 mole di glucosio.

La fermentazione lattica

Quando forniamo glucosio (ma anche altri substrati al LAB) si produce ATP e il glucosio è convertito in molecole di acido lattico (3 atomi di carbonio). Quindi da 1 mole di glucosio (6 atomi di carbonio) possono essere prodotti al massimo 2 moli di acido lattico. Questa conversione di glucosio in lattato è accoppiata sia alla produzione di ATP sia alla riossidazione del NADH a NAD⁺ che serve per tenere attivo il metabolismo.

Nel caso della conversione di piruvato in lattato abbiamo una reazione ossidoriduttiva che permette di riossidare una mole di NADH per una mole di substrato consumato. Si può produrre una quantità di moli di acido lattico variabile in funzione della via catabolica utilizzata dal microrganismo. Se il lattato è l’unico prodotto si parla di omofermentanti (A) (utilizza glucosio attraverso la via glicolitica e pentosi attraverso il ciclo dei pentosi in cui da piruvato si forma lattato con ossidazione di NADH⁺ in NAD⁺ e 2 moli di ATP) sennò se ci sono più prodotti si parla di eterofermentazione (B) (utilizza glucosio o pentosi attraverso la via della fosfochetolasi). Nel caso dell’omofermentazione troviamo però qualcos’altro, oltre al lattato.

In entrambi i casi il glucosio attraverso sistemi di trasporto entra nella cellula e viene fosforilato a glucosio 6-fosfato. Però il glucosio viene portato attraverso sistemi di trasporto che lo fosforilano prima e poi lo fanno entrare oppure lo fosforilano dopo. La fosforilazione è catalizzata dalle chinasi in cui troviamo chinasi intracellulare e chinasi associata al trasporto. Il destino del glucosio-6-fosfato cambia a seconda del sistema biologico che andiamo a considerare.

Ci sono inoltre microrganismi chiamati eterofermentanti facoltativi che utilizzano il via metabolica glucosio o via metabolica non glucosio. Producono CO₂ solo se lo zucchero non è glucosio.

L’elemento centrale, è piruvato il quale si produce dalla gliceraldeide-3-fosfato. L’elemento che differenzia le due vie è cosa succede al glucosio 6-fosfato: nella via glicolitica viene isomerizzato a fruttosio 6-fosfato (da qui segue la classica via Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) con produzione di lattato) mentre nella via del fosfogluconato (via della fosfochetolasi) il glucosio-6-fosfato viene convertito in 6-fosfogluconato attraverso una reazione ossidoriduttiva che ha come cofattore il NADP il quale viene convertito in NADPH. Il NADP viene utilizzato per sintetizzare i lipidi. Formatosi il 6-fosfogluconato questo non può essere fosforilato ulteriormente e quindi può essere substrato di un’altra reazione ossidoriduttiva, che porta alla decarbossilazione ossidativa in cui si trasforma in ribulosio-5-fosfato (ovvero un pentoso-fosfato). Quest’ultimo viene isomerizzato a xilosio-5-fosfato che essendo a 5 atomi di carbonio, genera 1 mole di gliceraldeide-3-fosfato e 1 mole di acetil-fosfato. La gliceraldeide fosfato segue la via di EMP con produzione di lattato.

Un elemento importante è che l’acetil-fosfato può subire dei destini alternativi: anziché trasformarsi in etanolo si converte in acetato. L’acetil-fosfato ha un legame ad alto contenuto energetico in cui parte dell’energia viene conservata per formare un altro legame ad alta energia ovvero formare ATP. L’acetil-fosfato può donare l’energia all’ADP o produrre l’acetil CoA. A seconda delle condizioni, si può produrre altra ATP o riossidare il NADH. Nel secondo caso si forma lattato, etanolo e CO₂, nel primo caso si forma lattato, acetato e CO₂. Se si dà una miscela di esosi e pentosi si può osservare una miscela di prodotti. Il piruvato può essere convertito in lattato o in altri composti, in acetil-CoA il quale può essere convertito in altri prodotti.

Nella via omofermentante, se c’è tanto piruvato e l’enzima coinvolto non ce l’ha fa a consumarlo, nella cellula si accula il piruvato. Questo piruvato può essere dirottato in vie secondarie alternative che possono portare alla produzione di acetato o etanolo o acetil-acetoina o 2,3 butan-diolo. La complessità dei sistemi dipende dalle condizioni colturali: nello scenario omofermentante si può avere che il piruvato va ad etanolo ed acetato attraverso la via del piruvato formiato-liasi e se si ha un accumulo di piruvato e questo può essere disponibile per un enzima, quello che si ottiene come prodotto è la carbossilazione che porta a formiato e CoA. In altri sistemi vediamo che il piruvato viene convertito in acetil-fosfato e α-chetolattato; in altri sistemi ci sono sistemi di trasporto ossidativo che consentono di produrre ATP, ma meno moli, che coinvolge una ATPasi di membrana. Questo per dire che i vari sistemi dei LAB sono diversi fra di loro.

Nell’ambito della nutrizione e produzione di alimenti i LAB sono importanti per l’acidificazione, produzione di batteriocine (sostanze che sono tossiche per altri microrganismi) che oltre all’acido lattico sono responsabili della produzione di altri metaboliti. Le batteriocine possono essere prodotte per additivi alimentari o per scopo terapeutico, produrre probiotici.

Produzione di altri metaboliti dei LAB

Le vie metaboliche che portano alla produzione di aromi. Gli aromi si possono produrre a partire da molecole quali piruvato (a partire da acidi organici) o zuccheri (lattosio, glucosio). I trigliceridi possono essere convertiti mediante idrolisi e modificazioni successive in un ventaglio di prodotti che si trova all’interno del mezzo di fermentazione.

Le proteine (come le caseine nel latte) possono liberare a.a. che possono essere convertiti in aldeidi, alcoli, acidi organici e composti aromatici che possono dal punto di vista organolettico caratterizzare il prodotto finale. Oltre l’acido lattico si possono produrre tutte queste molecole elencate.

Nel caso dell’acido citrico si osserva un trasporto dall’esterno all’interno della cellula e conversione di questo in piruvato, acetato e anidride carbonica. A seconda di cosa trova il microrganismo si accumulano vari composti. L‘acido citrico può essere utilizzato come fonte di carbonio soprattutto nella slide (o testo della relazione) viene riportata la conversione del citrato in piruvato che prevede: conversione del citrato in ossalacetato e decarbossilazione di ossalacetato che comporta la formazione di piruvato e CO₂.

Nel metabolismo se diamo glicerolo come fonte di carbonio oltre al citrato e glucosio questi verranno utilizzati in sequenza (glucosio, citrato, glicerolo) ampliando il tipo di prodotti a partire dal substrato come fonte di carbonio. Parlando delle proteine, l’idrolisi delle proteine libera a.a. come la cisteina che può essere convertita in composti tiolici solfurati che sono composti che hanno una caratteristica organolettica ben definita.

Enzimi coinvolti nell’utilizzo delle proteine nei LAB

Uno dei sistemi più studiati è il Lactococcus lactis. Nei corsi precedenti dobbiamo aver acquisito cos’è una peptidasi, proteinasi perché questi sono i 2 enzimi che si ritrovano nel sistema proteolitico dei LAB che porta alla conversione di proteine in a.a. i quali sono convertiti in acidi organici. Gli acidi organici sono utilizzati per sintetizzare aldeidi, alcoli, esteri i quali (questi 3) possono caratterizzare organoletticamente un prodotto.

È fondamentale sapere come funziona la “macchina” del sistema proteolitico: la macchina del sistema proteolitico nei LAB ha 3 componenti: delle proteinasi (enzimi che operano sulle proteine idrolizzandole), sistemi di trasporto che trasportano all’interno della cellula oligopeptidi a catena lunga e peptidasi intracellulari che idrolizzano gli oligopeptidi per liberare gli a.a.; le proteinasi sono enzimi di parete in questi sistemi. I prodotti idrolizzati sono trasportati dentro da trasportatori specifici. Quello che viene portato dentro sono peptidi di 2 o 4 residui amminoacidici che poi devono essere ulteriormente sintetizzati per poter liberare gli a.a. che servono al metabolismo. E da qui si ha il coinvolgimento di peptidasi che idrolizzano questi di-tri-tetra peptidi. Il sistema sfrutta la catena carboniosa di un a.a. per fare altre sintesi. A seconda del ventaglio di prodotti che accumulano oltre all’acido lattico può essere favorevole o sgradevole.

In base alle classificazioni più recenti i LAB sono classificati nel phylum Firmicutes. Guardando i diversi generi dei LAB quello che si osserva è che ci sono alcuni sia etero che omo fermentanti come Lactobacillus (che producono ceppi che producono una miscela di D e L o uno delle due di lattato), altri che sono principalmente eterofermentanti come Leuconostoc, altri che sono omofermentanti come Lactococcus (producono l’isomero L-lattato). I batteri lattici si possono differenziare con la formazione di tetradi o non, capacità di crescere a 10 gradi o 45 gradi (quindi temperatura di crescita), tolleranza cloruro di sodio (tolleranza al sale), pH del mezzo, produzione di CO₂, isomero di acido lattico che producono.

Chimica delle fermentazioni - Lezione 5 - 12/10/21

Nella lezione precedente abbiamo guardato dal punto di vista metabolico i batteri lattici. I LAB possono utilizzare un ventaglio di composti come fonte di carbonio come zuccheri diversi dal glucosio, i quali sono trasportati all’interno della cellula. Il lattosio è costituito da glucosio e galattosio e differenziamo dal punto di vista generale sia per il lattosio che per il galattosio i trasportatori in diverse categorie. I trasportatori possono essere quelli che consumano ATP, facilitatori, antiporter o simporter. Il galattosio e il lattosio entrano nella cellula attraverso il trasporto attivo che consuma ATP come molecole fosforilate. Altri trasportatori portano il lattosio come molecola non fosforilata. Alcuni trasportatori lavorano quando la concentrazione di zucchero è alta, altri riescono a lavorare quando la concentrazione è bassa. Sul metabolismo la conseguenza è che abbiamo nella cellula il composto fosforilato o non fosforilato.

Per esempio, se nella cellula viene trasportato il lattosio come lattosio-6-fosfato, l’idrolisi determina la formazione di glucosio-6-fosfato e galattosio-6-fosfato. Analogamente portando dentro il lattosio non fosforilato all’interno della cellula, l’azione idrolitica sul lattosio determina la formazione di glucosio e β-galattosio. Il β-galattosio viene convertito in α-galattosio in quale viene trasformato in galattosio-1-fosfato che subisce ulteriori modifiche. Il galattosio-1-fosfato se si forma viene incanalato in una via particolare che porta il galattosio 1 fosfato in glucosio 1 fosfato che è convertito in glucosio 6-fosfato. Questa sequenza di passaggi viene chiamata anche pathway di Leloir.

Se nella cellula si forma il galattosio 6-fosfato viene convertito in triosio-6-fosfato in una via diversa che è quella del Tagatosio-6-fosfato. L’enzima che idrolizza il lattosio-6-fosfato è diverso da quello che idrolizza il lattosio. Il lattosio viene idrolizzato dalla beta-galattosidasi, il lattosio 6-fosfato dalla fosfo-beta-galattosidasi. Un’altra cosa caratteristica dei LAB è: ci sono dei sistemi che trasportano glucosio all’interno della cellula attraverso più trasportatori uno dei quali è un antiporter che porta 1 molecola di lattosio dentro dalla cellula e porta il 1 molecola di galattosio fuori dalla cellula e questo sistema lo troviamo in organismi che non sono c.