Chemioterapia e farmaci biologici

Chemioterapia e farmaci biologici

Prof. Elisabetta Vegeto 29.09.2021

La chemioterapia antitumorale, antinfettiva o immunomodulante sono accomunate dal fatto che la malattia è costituita da cellule che proliferano all'interno del nostro organismo e queste sono cellule molto diverse dalle nostre. Lo scopo di queste tre classi di farmaci è di portare alla morte le specifiche cellule (batteriche, virali e immunitarie anomale).

Covid-19: fisiopatologia e farmacologia

Il covid-19 è una malattia infettiva causata dal virus SARS-Cov-2. L’evoluzione di questa malattia e la diffusione delle informazioni relative alla malattia iniziano al 30 dicembre 2019 in cui vengono riportati casi di polmoniti atipiche ad origine sconosciuta e il 12 gennaio venne sequenziato il genoma di questo virus completamente nuovo e veniva così condiviso all'interno della Comunità scientifica Nazionale. Questo si è tradotto in una rapidità impressionante nello sviluppo di farmaci (vaccino). In 5 giorni è iniziata così la produzione di un vaccino e in pochissimi mesi è stato reso disponibile e ad oggi tutto il mondo sta utilizzando il vaccino Pfizer, vaccino a mRNA.

Il SARS-Cov-2 è un coronavirus, virus presenti sulla Terra da migliaia di anni, ed è possibile dividerli in 4 sottofamiglie (a, b, g, d) dove le prime due sono virus specifici per mammiferi, mentre le altre due oltre per i mammiferi infettano anche specie aviarie. All’interno delle varie sottofamiglie le specie che interessano l’uomo sono 7 (2a e 5b) tra cui SARS-Cov-1 e MERS di cui il SARS-Cov-1 è stato individuato nel 2009 mentre il MERS nel 2012. La SARS è una sindrome respiratoria acuta, mentre il MERS è una sindrome respiratoria del Medio Oriente poiché è stato individuato il virus proprio nel Medio Oriente. Queste hanno somiglianze e differenze con il SARS-Cov-2 soprattutto il fatto che i sintomi si sviluppano immediatamente dopo l’infezione, mentre per il COVID-19 si possono avere infezioni asintomatiche o sintomatiche con diversi giorni di latenza (fino a 14gg).

Sono stati fatti diversi studi che analizzano la sequenza genomica e la mettono a confronto con altri coronavirus e quello di SARS-Cov-2 si nota essere molto simile ad alcuni virus che infettano. Da dove derivi il virus e da quale virus ancestrale il virus deriva non si sa ancora.

I coronavirus

Coronavirus perché hanno una struttura particolare, comune a tutti i coronavirus. Infatti, hanno una struttura a corona dove nella porzione esterna hanno proteine che emergono sulla superficie, cioè dall'envelope. Queste proteine sono le proteine S o Spike. Quindi hanno un envelope lipidico in cui sono presenti anche alcune proteine come la proteina S e la glicoproteina di membrana. Quest'ultima mantiene in una forma stabile quello che è contenuto nella particella virale, cioè l'acido nucleico. Il genoma dei coronavirus è un genoma a RNA a singolo filamento positivo piuttosto lungo. Solitamente i virus a RNA hanno un filamento piccolo, mentre quello dei coronavirus è molto lungo (30KDa).

Tutti i coronavirus hanno la proteina S responsabile dell'attacco alle cellule bersaglio, cioè cellule che esprimono il recettore specifico per la proteina S. SARS-Cov-1 e COVID hanno lo stesso recettore perché la proteina S è simile in entrambi i virus, mentre altri coronavirus hanno proteine S un po' diverse per cui riconoscono recettori diversi. Conoscere queste cose può essere utile perché avere informazioni su virus simili, come il virus MERS e SARS-Cov-1, queste informazioni possono essere utili per cercare di limitare l'infezione di SARS-Cov-2.

La proteina S è posta sulla membrana con 2 domini:

• Dominio S2: dominio ancorato alla membrana
• Dominio S1: dominio più esterno su cui sono presenti domini più piccoli che sono i Receptor binding domain, cioè quella parte di proteina S all'interno del dominio S1 che fa contatto diretto con il recettore sulle nostre cellule

La proteina S fa un trimero: la presenza delle 3 porzioni così vicine aumenta l'affinità di legame al recettore. La proteina S deve essere leggermente modificata quando è in uno stato attivo. Se si vuole sfruttare la conoscenza della presenza della proteina bisogna conoscere la forma e struttura per bloccarla o mimarla in modo tale da usare farmaci che prevengano l'attacco della particella virale con i nostri recettori.

Se si vuole usare una proteina S come competitore della capacità del virus di entrare nelle nostre cellule bisogna fare una proteina trimerica, che sia sufficientemente stabile in modo tale che in circolo possa competere con la Spike endogena del virus. Se non è trimerica la Spike somministrata avrà un'affinità molto più bassa per il recettore rispetto alla Spike virale per cui la competizione sarà vinta dalla proteina virale e non dal farmaco. Per riuscire ad ottenere una spike trimerica stabile è necessario fare delle mutazioni sulla Spike stessa.

Esperimenti fatti prima del COVID, ma con SARS-1 mostrano che il genoma del COVID ha una lunga sequenza di RNA; al terminale 5’ i primi spazi aperti alla lettura (ORF), cioè quelli che sono poi tradotti in proteina, sono comuni cioè molto molto simili tra le diverse specie SARS e MERS. Invece, le sequenze successive sono un po' più diverse. La proteina S è piuttosto simile per SARS-Cov-1 e SARS-Cov-2. La SARS 1 e la MERS hanno una mortalità molto superiore, ma sono molto limitate dal punto di vista geografico. COVID-19 ha invece una diffusione molto più ampia per la sua elevata trasmissibilità.

Cosa succede quando inaliamo particelle virali?

Queste particelle hanno la proteina S sulla superficie e questi possono incontrare il loro recettore, cioè l’ACE-2 (enzima che converte l’angiotensina II). Alcune cellule del tratto respiratorio hanno questo recettore e questo è molto espresso a livello degli alveoli polmonari, cioè sugli pneumoniti 2, ma è molto presente anche a livello dei bronchi e della cavità nasale. Attraverso la presenza di questo recettore e alla proteina Spike il virus riesce ad attaccarsi alle cellule umane: dominio S1 della proteina Spike sulla parte più esterna ha il dominio di legame al recettore ACE.

Non solo a livello polmonare, ma questa è la prima sede che incontra il virus, infatti anche altre cellule esprimono il recettore ACE 2 come il tratto GI, a livello endoteliale ecc. Da qui deriva la gravità dell’infezione perché tramite il torrente ematico il virus può arrivare a molti tessuti. Gli pneumociti di tipo 2 sono quelli che producono il surfactante a differenza di quelle di tipo 1 che fanno scambi gassosi. La cellula infettata dal virus risulta così danneggiata per cui inizia a funzionare male anche se può essere che un soggetto infettato non si accorga di essere affetto (situazione asintomatica). La particella virale una volta ancorata alla membrana può entrare tramite un processo di endocitosi oppure a seguito del legame con ACE-2 interviene un’altra proteina che è una proteasi dell’ospite presente su cellule che esprimono ACE-2. Questa proteasi altera la proteina S in modo tale che ACE-2 riesca a staccare S1 da S2 e la nuova conformazione di S2 si ancora alla membrana e permette l’ingresso del materiale genetico. Quindi, o attraverso l’endosoma che poi rilascia il genoma nel citoplasma oppure tramite il rilascio del genoma grazie all’azione di proteasi di membrana si ha l’entrata del virus nella cellula umana.

Una volta all’interno delle cellule il genoma è pronto ad essere tradotto per cui una parte dell’RNA virale dà origine a proteine e per una parte si ha una trascrizione discontinua da cui si generano proteine strutturali come quella S, l’envelope ecc. Le proteine che sono trascritte subito fanno parte di un complesso di replicazione in modo tale che queste proteine prodotte possano replicare il materiale genetico del virus. Il genoma virale entrato nella cellula viene immediatamente tradotto in RNA polimerasi RNA-dipendente in modo tale che questa possa duplicare l’RNA virale.

Questo enzima è sufficientemente diverso dalla polimerasi dell’ospite, che duplica DNA da uno stampo di DNA, per cui si possono individuare punti di attacco selettivi per colpire esclusivamente la duplicazione del genoma virale. Una volta che il genoma virale è stato duplicato viene assemblato in una nuova particella virale insieme alle proteine strutturali prodotte in modo tale che il virione maturo possa essere liberato per esocitosi andando ad infettare altre cellule.

ACE: recettore molto importante

L'ACE è fondamentale nel controllo della pressione arteriosa e di tante altre funzioni perché è espressa anche sull’epitelio polmonare. L’angiotensinogeno è un peptide che viene accorciato grazie all’azione della renina ad angiotensina 1 e grazie all’azione di un altro enzima si forma angiotensina 2 che lega il recettore AT1R (recettore dell’angiotensina 2 di tipo 1) che è molto dannoso perché scatena: infiammazione, fibrosi, trombosi ecc. Esistono quindi farmaci che possono inibire AT1R o farmaci che inibiscono l’enzima che converte l’angiotensina 1 in angiotensina 2, cioè l’ACE 1. Si hanno quindi inibitori ACE-1 o inibitori del recettore AT1R molto utili per il controllo della pressione arteriosa. Invece, ACE 2 ha un’azione benefica per cui è sbagliato bloccare ACE 2 per spegnere l’infezione, infatti ACE 2 ha un ruolo di protezione cellulare. ACE 2 diminuisce le dimensioni di angiotensina 2 a dare angiotensina 1-7 oppure agisce su angiotensina 1 a dare angiotensina 1-9 e queste molecole agiscono su recettori diversi che sono collegati con vie di segnali intracellulari per bloccare l’azione di AT1R mentre inducono protezione cellulare. L’azione di ACE-2 è benefica.

ACE-2 si trova anche in forma solubile e questo è importante. ACE-2 di membrana può essere tagliato a dare solo una porzione extracellulare solubile che è ancora in grado di legare i suoi bersagli, ma anche altre molecole. Ci sono quindi diversi studi che valutano le azioni di ACE-2 solubili, infatti si sta studiando se somministrando ACE-2 solubile si riesce a bloccare l’infezione di COVID. Per produrre ACE-2 solubile bisogna usare tecniche biotecnologiche quindi ad oggi siamo in grado di produrre proteine ricombinanti che possono essere somministrate all’uomo. All’inizio del COVID non si sapeva se continuare o interrompere la terapia con inibitori di ACE-2 perché questi farmaci aumentano l’espressione di ACE-2 per cui si temeva che si avesse un effetto negativo dei farmaci che aumentassero la capacità del virus di penetrare le cellule. Tuttavia, sono stati fatti tanti studi e si è affermato che si può continuare terapia con ACE inibitori in soggetti con COVID.

Attacco e ingresso del virus

Se si vuole bloccare questo ingresso è bene capire come avviene. Sotto si vede la membrana epiteliale della cellula ospite dove è espresso il recettore ACE mentre quella sopra è la membrana del virus dove è espressa la proteina spike. Quando si forma l’interazione proteina S-ACE si ha modifica conformazionale di S1 che si stacca fisicamente da S2 lasciando libero S2. Il dominio S2 in realtà ha una porzione, il peptide di fusione, che si aggancia alla membrana dell’ospite permettendo la fusione della membrana virale con quella dell’ospite e facendo sì che il genoma virale, a questo punto, sia a contatto diretto con il citoplasma dell’ospite. Il peptide di fusione è presente a livello del dominio S2 che dopo distacco del dominio S1 viene attivato. Per bloccare questa fase si possono progettare farmaci che agiscono su ACE-2 o che modificano la proteina S. Ad oggi sono usati farmaci che bloccano proprio questi passaggi e questi sono anticorpi monoclonali che attaccano la proteina S, cioè il siero convalescente cioè siero di soggetti guariti dal COVID che presentano anticorpi che interagiscono con Spike. Il siero convalescente in alcuni pazienti blocca proprio la proteina S per cui si blocca la fusione del virus.

Traduzione del genoma virale

L’RNA una volta entrato nella cellula ospite viene tradotto. Infatti, la prima porzione è immediatamente tradotta dai nostri ribosomi, che non lo riconoscono come diverso. In realtà si forma un polipeptide che viene tagliato poi a dare molte diverse proteine e queste proteine codificate dal segmento iniziale sono 16 aventi attività diversa. Inizialmente tutte le proteine sono unite in un unico polipeptide che successivamente è tagliato con delle proteasi in 16 frammenti più piccoli. Tra queste proteine che si formano si hanno:

• RNA polimerasi RNA dipendente
• Proteasi
• Elicasi
• Altre

Sicuramente tra tutte, 2 sono le proteine più importanti che sono codificate dai segmenti iniziali 3 e 5: proteasi PLpro e proteasi Mpro. Queste proteasi continuano a scindere i legami amminoacidi presenti nel polipeptide dando origine ad altre proteine ciascuna con la propria attività. Lpro ha solo alcuni siti di attacco, mentre la Mpro ha molti più siti di attacco ed è quella che è in grado di generare la RNA polimerasi RNA dipendente. Su queste proteasi si trovano bersagli farmacologici essenziali, infatti se si hanno inibitori della proteasi, il virus infetta le cellule ma non è in grado di replicare perché non si forma la RNA polimerasi. Quindi, bloccando le proteasi si riesce a bloccare la generazione del complesso che duplicherebbe poi i segmenti più a valle del virus.

Il gene della replicasi è un gene unico che dà origine a tante proteine coinvolte nella replicazione. A valle si hanno diversi geni che vengono tradotti tramite la trascrizione discontinua grazie all’enzima che si forma per taglio delle proteasi. Le Msp sono tutte vicine e sono proteine NON strutturali, cioè sono proteine che hanno attività di replicasi. Ci sono siti di attacco interessanti per sviluppare farmaci che hanno azione selettiva su proteine virali: farmaci che bloccano la replicazione virale. La problematica delle varianti di SARS-COV-2 è data dalla replicazione discontinua in cui il virus può inserire degli errori/mutazioni molto facilmente. Tuttavia, una delle proteine dell’Msp sono esonucleasi, cioè enzimi che riparano le mutazioni per cui se solo una mutazione riesce ad inserirsi, a causa dell’enorme diffusione del virus si creano problemi. Le varianti sicuramente sono più trasmissibili perché altrimenti sarebbe uno svantaggio per il virus. Quella più importante è la mutazione all’interno di Spike perché è una mutazione che cambia la conformazione di Spike e la rende più efficace nel legame con ACE. Quindi, questo fa sì che il virus sia meglio trasmesso e sicuramente si ha anche un cambiamento della risposta immunitaria che può tradursi in una riduzione dell’efficacia dei vaccini.

Presentazione clinica

• Primo stadio: dell'infezione è la fase virale: tante particelle virali in cui l'infezione è nella fase precoce per cui può essere asintomatica e può dare dai 5 giorni in poi. In questa fase si ha la propagazione del virus perché il virus entra, il genoma viene tradotto, si forma la polimerasi e tutte le proteine necessarie alla formazione di virioni maturi che possono essere rilasciati per poter infettare altre cellule. In questa fase si può già creare un danno a cellule che hanno.
• Secondo stadio: è la fase polmonare perché in questo stadio si ha lesioni parenchimali per cui si ha collasso degli alveoli ed edema.
• Terzo stadio: fase iper-infiammatoria scatenata dall'infezione virale ma anche dalla reazione che il tessuto ha all'infezione. Il sistema immunitario risulta iper-attivo e questo aggrava il danno dando insufficienza respiratoria dovuta NON dal virus ma dalla risposta immunitaria. Il virus in questa fase può anche essere completamente assente, ma si può avere risposta iperinfiamamtoria per iper-attivazione del sistema immunitario.

Sintomi

Slide e parametri clinici/sierologici (RT-PCR: la PCR è una reazione a catena che amplifica il DNA, quindi con l’RNA dà risultato negativo. Con la RT-PCR prima si utilizza un enzima che retro-trascrive RNA in DNA così RNA virale viene riconosciuto con selettività. Questo metodo che serve per rilevare qualsiasi tipo di DNA, a patto che si conosca la sequenza. La trascrittasi inversa è un enzima che retrotrascrive RNA a DNA per cui se nel campione che si analizza è presente RNA, l’enzima lo trascrive. Quindi, tutto l’RNA è trascritto a DNA grazie alla retrotrascittasi ma in questa versione RT-PCR si usano strumenti che riconoscono unicamente il DNA virale, di cui si conoscenza la sequenza poiché è diverso dal DNA umano. Metodo che permette di capire se è presente l’infezione). Si possono usare anche metodi sierologici che guarda la nostra reazione al virus, infatti permettono di verificare se ci sono gli anticorpi oppure se è presente il virus nel siero. La risposta iper-infiammatoria del terzo stadio si scatena perché ovviamente vengono richiamate le cellule dell’in.