Cellule staminali

Cellule staminali

Si deve a Haeckel il merito per avere coniato nel 1868 il termine “staminale” per indicare una cellula capostipite. Per essere definite staminali le cellule devono rispondere a due criteri fondamentali: possedere potenza differenziativa e capacità di auto-rinnovamento (self-renewal). La cellula staminale, infatti, è una cellula che è in grado di dividersi per un tempo illimitato dando luogo ad una divisione asimmetrica.

La divisione asimmetrica implica che le due cellule figlie vadano incontro a destini differenti: una delle due sarà una cellula progenitrice, l’altra, esattamente come la madre, sarà una cellula staminale. Tuttavia se consideriamo una determinata popolazione staminale, può accadere che una cellula dia luogo anche a una divisione simmetrica originando quindi o due progenitori o due staminali, a seconda delle necessità di quella determinata nicchia staminale.

Per esempio, in seguito ad un danno si può manifestare la necessità di sostituire molte cellule differenziate ed allora sarà preferibile l’attuazione di una divisione simmetrica dove la staminale origina due progenitori proliferanti che dividendosi per un tempo definito genereranno due progenitori che dividendosi a loro volta, porteranno a cellule terminalmente differenziate. Si può verificare anche la situazione opposta in cui un depauperamento della nicchia terminale rende necessaria una divisione simmetrica che porti alla formazione di due cellule staminali le quali sosterranno la generazione di un elevato numero di progenitori.

Determinare la staminalità

Una cellula staminale deve avere la capacità di mantenere il self-renewal e la potenza differenziativa; tuttavia determinare la staminalità di una cellula non è semplice perché richiede uno studio approfondito e pertanto comporta un alto rischio di danneggiare la cellula e di alterarne il comportamento.

Saggio retrospettivo funzionale

Un animale viene letalmente irradiato: lo si sottopone ad una dose di radiazioni tale da uccidere tutte le sue staminali multipotenti ematopoietiche. È possibile trapiantare da un topo sano il midollo osseo e di fatto permettere la vita del topo letalmente irradiato.

Il saggio retrospettivo funzionale può essere inquadrato in questi termini: il topo letalmente irradiato vivrà se sono state trapiantate delle staminali che generano un pool di cellule che rimarrà attivo per tutta la vita del topo. Al contrario, se ad essere trapiantati sono dei progenitori proliferanti, osserverò che il topo per un breve tempo sta bene ma dopo non molto muore perché queste cellule trapiantate non hanno capacità di self-renewal. È possibile sfruttare la fluorescenza delle GFP (proteine fluorescenti verdi che i topi transgenici esprimono sulle loro cellule) per marcare le cellule dell’organismo donatore.

Classificazione delle cellule staminali

Le cellule staminali possono essere classificate sulla base del quantitativo di tipi cellulari a cui sono in grado di differenziare.

• Cellula totipotente: è in grado, dividendosi, di sostenere la generazione di tutti i tipi cellulari che caratterizzano l’organismo compresi i tessuti extra-embrionali. L’unica cellula totipotente è rappresentata dallo zigote.
• Cellula pluripotente: cellule ESC presenti nella massa cellulare interna (embrioblasto) della blastocisti, poco prima dell’impianto nella mucosa uterina, stadio molto precoce nello sviluppo embrionale. Si tratta di cellule che sono in grado di dare origine a progenitori che possono differenziarsi in uno qualsiasi dei tessuti che derivano dai tre foglietti embrionali; endoderma, mesoderma, ectoderma.
• Cellula multipotente/oligopotente: cellule che hanno la capacità di differenziarsi in diversi tipi cellulari di solito residenti in quel tessuto.
• Cellula bipotente/unipotente: in grado di dare luogo solo a uno o due tipi cellulari.

Cellule ESC

Le cellule ESC presenti nella massa cellulare interna (embrioblasto) della blastocisti, poco prima dell’impianto nella mucosa uterina, stadio molto precoce nello sviluppo embrionale. Si tratta di cellule che sono in grado di dare origine a progenitori che possono differenziarsi in uno qualsiasi dei tessuti che derivano dai tre foglietti embrionali; endoderma, mesoderma, ectoderma.

Le staminali embrionali sono state isolate per la prima volta da Evans e Kauffman i quali sono riusciti partendo da una blastocisti, a rimuovere il trofoblasto ed a isolare queste cellule. Una volta messe in coltura esse dimostrarono capacità di self-renewal per un tempo illimitato.

Test per dimostrare la pluripotenza

• Test del differenziamento in vitro: partendo da cellule che crescono su un feeder layer, si verifica che queste cellule siano effettivamente in grado di generare progenitori proliferanti.
• Formazione di chimere: iniezione di queste cellule nel blastocele di una blastocisti ospite. Queste cellule vanno a cooperare con le ESC della cellula per sostenere lo sviluppo dell’embrione. Se le cellule iniettate sono effettivamente pluripotenti, significa che dovranno andare a sostenere la formazione di qualsiasi tessuto derivante da uno dei tre foglietti embrionali, pertanto, mi aspetterò di trovare in tutti i tessuti dell’embrione una situazione chimerica con due tipi cellulari con forma diversa. Se la situazione chimerica è verificata solo in alcuni distretti tissutali, tali cellule non sono pluripotenti perché non hanno contribuito alla formazione di tutti i tessuti.
• Formazione di teratomi: i teratomi sono tumori dei tessuti embrionali, le cellule ESC portano con sé la caratteristica della tumorigenicità. Inietto le cellule che voglio testare sottocute in un topo immunodepresso, che quindi non reagisce identificando le cellule come not-self, se queste cellule portano alla formazione di teratomi avrò la prova tangibile della loro effettiva pluripotenza. La tumorigenicità non può essere ignorata per questo non è ancora possibile utilizzare queste cellule in sicurezza sui pazienti.

Nel 1998 James Thompson pubblica su Science i dati di una ricerca: era riuscito ad isolare le ESC da una blastocisti umana. L’utilizzo di blastocisti umane scatenò un enorme polverone di natura etica. In certi casi di infertilità è possibile intraprendere l’IVF, in pratica la fecondazione avviene in provetta dopodiché quando lo sviluppo embrionale è iniziato, si procede con l’impianto.

Prima che ciò avvenga, la donna viene sottoposta a stimolazione embrionale attraverso estrogeni in modo che si abbia la formazione di un numero di ovociti superiore a 1 i quali vengono poi fecondati laboratorialmente ed impiantati dopo un paio di giorni. Se la stimolazione ormonale porta alla formazione di molti ovociti, questi non vengono tutti impiantati ma congelati in azoto liquido e conservati come scorta.

In USA sono state usate queste blastocisti per gli esperimenti sulle cellule ESC. È chiaro che rispetto alle staminali adulte, le ESC lascino intravedere molti più utilizzi, ad oggi queste cellule non sono utilizzate in medicina rigenerativa per il problema della sicurezza riguardo alla formazione di teratomi inoltre sarebbero poi necessarie terapie con immunosoppressori.

Cellule ASC

Virtualmente si ritrovano in tutti i distretti tissutali dato il loro ruolo nella rigenerazione dei tessuti. Negli anni ’90 Weiss e Brent Reynold identificarono le cellule staminali neurali e nel cervello maturo nella zona sottoventricolare e nell’ippocampo. Queste cellule sono capaci di generare nuovi neuroni che sono cellule post-mitotiche. Queste staminali sono poche nei tessuti e poco proliferanti.

Nella nicchia si automantengono e sono in grado di generare cellule differenziate. Sono in grado di dividersi in modo asimmetrico ma può accadere che vadano incontro a divisione simmetrica in caso di necessità. In condizioni di equilibrio la divisione è asimmetrica con 50% di figlie staminali e 50% di progenitori proliferanti.

Sono stati ipotizzati due meccanismi per spiegare il mantenimento in condizioni di equilibrio di queste percentuali: l’asimmetria ambientale e l’asimmetria divisionale. Secondo la teoria dell’asimmetria divisionale la divisione asimmetrica genera un’asimmetria interna in base alla quale le cellule figlie sono dotate di determinanti diversi già al momento della nascita.

Secondo invece la teoria della divisione ambientale, non c'è un'asimmetria interna ma è l'ambiente a influenzare i destini delle due cellule figlie; infatti inizialmente le due figlie sono simili, indistinguibili, è l'ambiente con le sue differenti influenze che, dopo la nascita, esercita una fortissima influenza in queste cellule tale da indirizzarne una al destino staminale una al destino da progenitore. I due modelli si integrano e cooperano nel tentativo di spiegare la generazione di questa simmetria.

È indubbio che la divisione asimmetrica porti alla generazione di una cellula che non è più staminale appunto esistono nei vantaggi nel disporre di una cellula che è un progenitore ancora in grado di proliferare; infatti tali progenitori proliferano per un periodo limitato nel tempo e vengono indicati con il termine di TA progenitors. Questi tipi cellulari transitano dal carattere staminale al carattere differenziato e grazie alla loro capacità di proliferare amplificano il numero di progenie differenziata.

A sostegno dell’asimmetria divisionale va una formulata negli anni ’70 che va sotto il nome di Teoria dei Filamenti Immortali. Si tratta di un meccanismo messo in campo dalle staminali per evitare di accumulare mutazioni potenzialmente rischiose per l’insorgenza di tumori. Si tratta di una teoria non universalmente accettata ma tuttavia dimostrata in vari tipi di staminali: satelliti del muscolo scheletrico, epiteliali.

Le molecole di DNA delle staminali sarebbero in qualche modo marcate un filamento è marcato, ha un tratto dell'immortalità. Nel momento in cui la staminale duplica il proprio genoma (fase S) e va incontro (fase M) a ripartizione del materiale genetico, un meccanismo molecolare non ancora identificato fa sì che nella divisione asimmetrica la cellula figlia che rimarrà staminale, e non quella destinata a divenire progenitore, erediti quella molecola di DNA che contiene il filamento marcato.

Secondo questa ipotesi si ammette che le cellule staminali siano in grado di segregare in modo asimmetrico le loro molecole di DNA in modo tale che il filamento immortalizzato venga mantenuto nella cellula futura staminale e non nell’altra: si contribuisce al mantenimento della staminalità di questo genoma.

Via di segnalazione di WNT beta-catenina

Studi condotti su tumori del colon e del retto hanno permesso di fare numerose scoperte. È stata osservata una predisposizione allo sviluppo di certi tumori del colon come la poliposi ereditaria del colon che è riconducibile a mutazioni a carico del gene codificante la proteina APC: adenomatose poliposis coli.

L’adenoma si origina in quelle cellule in cui entrambe le copie del gene codificante per APC sono perse. Questa proteina APC è infatti coinvolta in un’importante via di segnalazione: la via di segnalazione di WNT e quando il gene è mutato questa segnalazione subirà un’aberrazione impropria e self-renewal e controllo della proliferazione saranno compromessi.

WNT sono importantissime proteine secrete con funzione di mediatori locali. Nell’uomo esistono 19 proteine WNT diverse. Queste proteine agiscono durante lo sviluppo, sono infatti importanti morfogeni. La via di segnalazione di WNT è stata osservata per la prima volta in Drosophila melanogaster dove le WNT codificano per il gene wing-less che se mutato porta allo sviluppo anomalo di mosche prive di ali e a cui la stessa via di segnalazione deve il proprio nome. Lo stesso gene che in Drosophila prende il nome di WNT, nel topo è definito INT ed è coinvolto nello sviluppo di tumori della mammella.

Queste proteine WNT sono appositamente modificate all’estremità ammino-terminale per aggiunta di un acido grasso che facilita l’ancoraggio con la membrana plasmatica dove WNT si legherà al suo recettore.

Quindi WNT non è altro che il ligando di un recettore che si trova sulla membrana plasmatica, si forma così un complesso ligando-recettore che porta al reclutamento intracellulare della proteina dishevelled che sarà importante per iniziare la cascata segnalatoria intracellulare a valle. Esistono tre diverse vie di segnalazione attivate dal legame di WNT con il proprio recettore qui analizziamo la prima.

Via canonica della beta-catenina

Troviamo la beta-catenina nelle giunzioni aderenti delle cellule epiteliali dove di fatto collega le caderine, che sono coinvolte nell’adesione cellula-cellula, col versante intracellulare, in particolare con i microfilamenti actinici.

Sulla membrana plasmatica è presente il recettore Fizzled, un recettore specifico per WNT, accoppiato a g-proteine eterodimeriche che attraversa 7 volte la membrana. Fzl tuttavia non è da solo perché sulla membrana plasmatica si trova anche un altro recettore: LRP “proteina correlata al recettore lipoproteine”, questo funziona da co-recettore.

Cosa succede in assenza di WNT

• Se WNT è assente non può legarsi al proprio recettore Fzl, di conseguenza a livello di Fzl non viene reclutata la proteina dishevelled.
• In queste condizioni è presente nel citoplasma un complesso che fosforila la beta-catenina.
• La beta-catenina viene fosforilata e tale fosforilazione costituisce un segnale che la destina alla poliubiquitinazione: un’etichetta per la degradazione a livello proteosomale.
• Di conseguenza la beta-catenina non si accumula.
• In assenza di WNT la fosforilazione della beta-catenina viene catalizzata da specifiche proteine con attività chinasica in particolare GSK3 e CK1; in assenza di WNT queste chinasi fosforilano la beta-catenina che verrà poliubiquitinata e degradata a livello del proteosoma.
• Tuttavia queste due chinasi agiscono una di seguito all’altra e possono svolgere la loro funzione correttamente solo se formano un complesso ben strutturato con altre due proteine scaffold che sono la axina e la APC.
• Il ruolo delle scaffold è quello di mantenere in un complesso ben organizzato le due chinasi che dovranno fosforilare la beta-catenina.

WNT: assente

• Non si lega a Fzl.
• La beta-catenina viene fosforilata ad opera di CK1 e GSK3 unite in complesso con APC e axina.
• La beta-catenina non si accumula.

Cosa succede in presenza di WNT

• WNT si lega al suo recettore Fzl che coopera a sua volta con il co-recettore LRP.
• Questo legame induce la formazione del complesso ligando-recettore-corecettore.
• A questo punto la proteina dishevelled, che prima era inattiva, viene attivata e reclutata a livello del recettore Fzl.
• La formazione del complesso ligando-recettore-corecettore provoca un disasemblaggio del complesso responsabile della fosforilazione della beta-catenina. Questo accade perché le due chinasi e l’axina vengono reclutate a livello della coda citosolica di LRP.
• Quindi se WNT è presente, il complesso responsabile della fosforilazione della beta-catenina è distrutto in quanto le sue componenti vengono in parte reclutate a livello della membrana plasmatica. Di conseguenza la beta-catenina non potrà essere poliubiquitinata e degradata.
• La beta-catenina diventa stabile, si accumula e trasloca dal citoplasma al nucleo.
• Nel nucleo la beta-catenina si lega al promotore dei geni bersaglio per WNT. La beta-catenina, infatti, è un coattivatore trascrizionale che agisce con altre proteine che sono LEF1/TCF; con queste beta-catenina forma un complesso che promuove la trascrizione dei geni bersaglio per WNT che sono potenti stimolatori della proliferazione cellulare. Normalmente l’espressione di questi geni è silenziata dal repressore Groucho che viene spazzato via dalla beta-catenina.

WNT: presente

• Si lega a Fzl che coopera con LRP.
• Viene attivata e reclutata dishevelled.
• Si disassembla il complesso proteico responsabile della fosforilazione della beta-catenina perché le chinasi sono reclutate a livello della coda citosolica di LRP.
• La beta-catenina non viene fosforilata, diventa stabile.
• La beta-catenina passa al nucleo dove funge da coattivatore trascrizionale.

Se APC non funziona in modo corretto nel formare il complesso responsabile della fosforilazione della beta-catenina, si avrà una segnalazione aberrante per cui anche in assenza di WNT la beta-catenina è stabile e si accumula provocando la poliposi.

Apc mutato = beta-catenina sempre stabile = funge sempre da coattivatore di geni stimolatori della proliferazione cellulare = proliferazione incontrollata.

La via di segnalazione di WNT non è fondamentale solo per il mantenimento dello stato proliferativo ma anche per garantire competenza al differenziamento. Quindi quando WNT è bloccato anche il differenziamento è anomalo, questo perché WNT attiva anche l’espressione di geni coinvolti nella via di segnalazione di Notch.

Via di segnalazione di Notch

La via di Notch controlla diversi destini differenziativi. Notch è un recettore che si trova sulla membrana in forma eterodimerica e viene attivato per processazione proteolitica. La via di segnalazione di Notch è stata osservata per la prima volta durante lo sviluppo delle cellule nervose in Drosophila dove media l’inibizione laterale.

L’inibizione laterale è un fenomeno per cui quando una cellula si differenzia ad un certo tipo cellulare, le cellule circostanti vengono inibite dall’avere il medesimo destino. Questa inibizione è mediata dall’interazione tra il recettore Notch, gli