Concetti Chiave
- Le subunità del canale BK presentano un segmento transmembrana aggiuntivo (S0) e una lunga regione C-terminale, a differenza dei canali ionici voltaggio-dipendenti.
- La regione N-terminale del canale BK contiene una sequenza di 28 aminoacidi altamente conservata, fondamentale per il suo corretto funzionamento.
- Studi di mutagenesi indicano che la densità di carica negativa nella regione N-terminale è cruciale per la sensibilità del canale BK agli ioni Ca.
- Esperimenti hanno confermato che il Ca-bowl è un sito di legame per gli ioni Ca, poiché l'incorporazione di un dominio del canale BK in una proteina batterica le conferisce questa capacità.
- La sostituzione di aminoacidi carichi negativamente nel Ca-bowl riduce l'affinità per il Ca, dimostrando l'importanza di queste cariche nella funzionalità del canale BK.
Differenze strutturali nei canali BK
Appare subito evidente che esistono delle significative differenze nella struttura di questo canale rispetto a quella proposta per i canali ionici voltaggio-dipendenti. Innanzitutto le subunità formanti il poro del canale BK presentano, nella loro estremità N-terminale, un segmento transmembrana aggiuntivo (S0), oltre a quelli anche posseduti dai canali voltaggio-dipendenti (S1-S6). In secondo luogo questa subunità α possiede una lunga regione C-terminale, localizzata nel versante intracellulare, formata da altre 4 regioni a α-elica (S7-S10).
Importanza della sequenza N-terminale
Studi di mutagenesi sito-specifica indicherebbero che in questa regione N-terminale è presente una sequenza di 28 aminoacidi. La Ca-bowl include ben 10 cariche negative, 5 delle quali sono portate da 5 residui consecutivi di acido aspartico. Questa sequenza è altamente conservata nei canali BK di specie molto diverse tra loro, che vanno dai nematodi all’uomo, suggerendo che la sua presenza è essenziale per il corretto funzionamento di questo canale.
Esperimenti di mutagenesi e Ca-bowl
L’elevata densità di carica negativa presente in questa regione portò presto a formulare l’ipotesi che essa potesse rappresentare un sito di legame per gli ioni Ca, ipotesi confermata da esperimenti di mutagenesi. Si osservò infatti che la sostituzione dei vari aminoacidi carichi negativamente presenti in questa regione con residui neutri portava a un significativo decremento della sensibilità al Ca dei canali BK. Simili risultati si ottennero anche dopo delezione completa di questa regione. Sebbene gli esperimenti di mutagenesi appena descritti siano in linea con l’ipotesi che il Ca-bowl rappresenti un sito di legame per gli ioni Ca, altre possibilità esistono. A esempio mutazioni in questa regione potrebbero influenzare la Ca-sensibilità indirettamente, modificando il comportamento cinetico del canale, e senza alterare il legame del Ca al suo sito sul canale BK.
Conferma del legame del Ca-bowl
Per poter definitivamente concludere che il Ca-bowl sia effettivamente la regione del canale a cui il Ca si lega, fu condotto il seguente esperimento. Partendo da una proteina batterica che non presenta la capacità di legare Ca, si trovò che l’incorporazione, in questa proteina, di un dominio aggiuntivo identico alla regione C-terminale del canale BK, che includeva il Ca-bowl, conferiva alla proteina stessa la capacità di legare Ca. L’affinità per il Ca di questa proteina ricombinante veniva inoltre ridotta se alcuni degli aminoacidi carichi negativamente del Ca-bowl venivano sostituiti con residui neutri.
Domande da interrogazione
- Quali sono le principali differenze strutturali tra i canali BK e i canali ionici voltaggio-dipendenti?
- Perché la sequenza N-terminale è considerata fondamentale per il funzionamento dei canali BK?
- Come è stata confermata l'ipotesi che il Ca-bowl rappresenti un sito di legame per gli ioni Ca?
I canali BK presentano un segmento transmembrana aggiuntivo (S0) nella loro estremità N-terminale e una lunga regione C-terminale con altre 4 regioni a α-elica (S7-S10), a differenza dei canali voltaggio-dipendenti che hanno solo i segmenti S1-S6.
La sequenza N-terminale, composta da 28 aminoacidi e caratterizzata da un'elevata densità di cariche negative, è altamente conservata tra diverse specie e sembra essere essenziale per la corretta funzionalità del canale, come suggerito da studi di mutagenesi.
L'ipotesi è stata confermata attraverso esperimenti di mutagenesi che hanno mostrato un decremento della sensibilità al Ca quando gli aminoacidi carichi negativamente del Ca-bowl venivano sostituiti con residui neutri, e da un esperimento che ha dimostrato che l'incorporazione del Ca-bowl in una proteina batterica conferiva la capacità di legare Ca.
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