Biotecnologie - Processi e farmacologia

Biotecnologie: le industrie del futuro

Le biotecnologie sono le tecnologie che racchiudono il Bio: vita, sapere e il saper fare con la vita.

Tecno: saper fare. Sono le applicazioni pratiche e tecnologiche che sfruttano gli organismi viventi o loro parti subcellulari purificate (enzimi).

Logia: discorso per ottenere notevoli quantità di prodotti utili, sviluppare microrganismi utili per usi specifici, oppure per migliorare le caratteristiche di piante e animali.

Esempi: l’etanolo veniva prodotto per via chimica, oggi per via tecnologica, ovvero per fermentazione di lieviti e batteri (Saccharomyces); infatti l’etanolo è per la maggior parte bioetanolo. Il GSH può essere prodotto per via chimica o per via tecnologica, ovvero estratto dai lieviti.

Nelle biotecnologie per fermentazione si intende un processo produttivo che avviene indipendentemente dal tipo di metabolismo delle cellule utilizzate, mentre in biochimica è un processo energetico in cui l’accettore finale della catena di trasporto degli elettroni è una sostanza organica.

I prodotti delle biotecnologie possono essere nuovi o vecchi, ottenuti sempre con tecnologie nuove. Infatti, si cerca di scegliere le biotecnologie per una serie di motivazioni:

• Per l’impatto ambientale, che è minore rispetto alle industrie tradizionali.
• Per l’utilizzo delle sintesi enantioselettive, che utilizzano gli enzimi.

Il glutatione è un tripeptide costituito da tre aminoacidi (acido glutammico, glicina e cisteina). Gli amminoacidi possono avere configurazione L e D e nelle proteine sono presenti solo gli amminoacidi con configurazione L. Quando si sintetizza un aminoacido per via chimica si ottiene una miscela racemica che contiene il 50% di aa L, che hanno attività biologica, e il 50% di aa D, che invece non ce l’hanno. Quindi, visto che mi interessano solo le L, il 50% del prodotto è da scartare.

Gli enzimi utilizzati nelle vie tecnologiche, invece, sono enantioselettivi sia per i substrati, sia per le reazioni che catalizzano, sia per i prodotti che vanno a produrre; quindi, ottengo il 100% degli aminoacidi nella conformazione biologicamente attiva (L).

Perché è importante l’enantiomeria?

La talidomide L viene usata come sedativo, mentre il suo enantiomero D è teratogeno, ovvero è in grado di causare malformazioni al feto.

Limonene: una delle sue forme enantiomere è nel limone e ha il sapore di limone, l’altra è all’arancia e ha il sapore di arancia.

La penicillina G ha tre centri stereogenici, viene prodotta con la fermentazione del Penicillium, estratta e modificata.

Il cortisone ha 7 centri chirali (ha 2 enantiomeri e solo uno ha attività biologica).

Deriva dal colesterolo e si ottiene per bioconversione per mezzo di enzimi, che lo modificano tenendo presente l’enantioselettività.

Quindi l’industria biotech conviene perché è molto più precisa: permette di produrre molecole con attività biologica certa (conviene produrre il GSH con i lieviti piuttosto che mettere insieme tre aa).

Campi di applicazione delle biotecnologie

Possono essere:

• Rosse (red biotech): sono le biotech in campo sanitario e producono farmaci (vaccini) e tecniche diagnostiche sanitarie.
• Verdi (green biotech): sono le biotech in campo agroalimentare e producono specie animali e vegetali a migliore produttività.
• Grigie (grey biotech): sono le biotech ambientali che promuovono il biorisanamento (è il risanamento da parte di microrganismi dei siti inquinati, come i m.o. in grado di degradare gli idrocarburi o altre sostanze inquinanti) o il fitorisanamento (quando si utilizzano piante che hanno la capacità di assorbire metalli pesanti presenti nel terreno) e producono anche tecniche diagnostiche ambientali.
• Bianche (white biotech): sono le biotech nel campo delle industrie che producono biomateriali (come bioplastica e bioetanolo), enzimi (come l’amilasi, importante per l’industria alimentare perché produce glucosio a partire dagli amidi), processi di bioconversione (produzione di antibiotici, vitamine, aromi, carta e altri derivati della cellulosa, eccetera), bioenergie (biomasse, combustibili liquidi, biogas, biodiesel, che deriva dal mais).
• Blu (blue biotech): sono le biotecnologie per gli oceani.

Sia per la diagnostica ambientale che per quella sanitaria vengono usati biosensori: sono strumenti biodiagnostici che trattano la presenza di particolari metaboliti (come i sensori per la glicemia) o agenti tossici (A).

Le biotecnologie possono essere:

• Tradizionali, nate con i Sumeri e Babilonesi per la produzione dei cibi: vino, pane, birra, formaggio, yogurt eccetera.
• Moderne, nate con la microbiologia tra XVII e XIX secolo con Pasteur e Fleming.
• Innovative: utilizzano il DNA ricombinante.

Microbiologia industriale

Premessa: le biotecnologie in generale non utilizzano esclusivamente microrganismi, ma quelle che li utilizzano particolarmente sono le biotecnologie microbiche.

La microbiologia industriale utilizza le fermentazioni microbiche per produrre beni e servizi.

I prodotti delle biotecnologie microbiche possono essere:

• Le biomasse microbiche, come i lieviti, detti anche starter di fermentazione, fermenti lattici (Enterogermina), single cell protein, che sono integratori proteici alimentari.
• Quando sia il substrato di crescita che il catalizzatore/microrganismo stesso vanno a definire il prodotto, ad esempio lo yogurt è il risultato dei lactobacilli (catalizzatori) che vengono fatti crescere nel latte (il substrato).
• Da substrato modificato dall’attività microbica: il microrganismo viene fatto crescere sul substrato, il quale viene modificato, e successivamente rimosso. Ad esempio, per il vino il substrato è il mosto, ovvero una soluzione zuccherina di origine naturale, sul quale viene fatto crescere Saccharomyces. Una volta che è avvenuta la fermentazione alcolica e il substrato è modificato, Saccharomyces viene rimosso. La stessa cosa accade per la produzione della birra, sidro eccetera.
• Metaboliti prodotti durante la crescita dei m.o. sui substrati; possono rimanere all’interno della cellula oppure essere secreti nella cultura. Esempi di questi prodotti sono: gli amminoacidi, vitamine, etanolo, enzimi e antibiotici.
• Prodotto da bioconversione (è un servizio): quando un m.o., un enzima o una serie di enzimi vanno a modificare in pochi passaggi enzimatici un substrato. Quindi il substrato viene modificato ma non in maniera radicale dall’attività dei microrganismi presenti o di enzimi selezionati.

Esempio: produzione di latte delattosato. Enzima della lattasi, beta-galattosidasi, è immobilizzata in un filtro a maglie molto strette attraverso il quale viene fatto passare il latte. In questo modo il lattosio viene scisso dalla beta-galattosidasi in glucosio e galattosio e il latte sarà delattosato (è un substrato modificato per bioconversione), ovvero che non contiene più zuccheri sotto forma di lattosio ma di glucosio e galattosio. Il latte risulterà più dolce perché il potere dolcificante del glucosio è diverso da quello del lattosio.

Fasi del processo biotecnologico

• Upstream: individuare il microrganismo, formulare la composizione del terreno e mettere a punto le condizioni di coltura (parametri fisici: temperatura, ossigeno, pH…), coltivare il m.o., migliorare il m.o., decidere il tipo di processo e pianificare la struttura dei bioreattori (contenitore attivo all’interno del quale avviene il processo; sono funzionali e controllano le condizioni di crescita).

A questo punto all’interno del bioreattore ci sarà il m.o. che è cresciuto e il terreno di coltura.

• Downstream: avviene dopo e riguarda il recupero del prodotto. Per migliorare questa fase, che è molto complessa, si deve agire nell’upstream.

Attori dei processi biotecnologici

Sono i catalizzatori biologici:

• Cellule procariotiche: batteri.
• Cellule eucariotiche (quindi pluricellulari) di mammiferi, piante e insetti, muffe e lieviti.

Per isolare i microrganismi che hanno caratteristiche interessanti per un dato processo si effettua uno screening primario.

I microrganismi sono reperibili dalle collezioni di microrganismi, ovvero delle raccolte di m.o. noti, conservati e catalogati. A queste collezioni vi possono accedere le grandi aziende per testare dei microrganismi e stabilire se sono utili al tipo di processo industriale scelto.

Ma prima di essere collezionati i microrganismi devono essere prelevati dalle loro nicchie ecologiche, quindi dall’ambiente. E. coli, ad esempio, è stato isolato da delle derivazioni fognarie.

Posso fare uno screening primario, che mi permette di fare un isolamento e una prima identificazione:

• Usando un m.o. di una collezione, e quindi di microrganismi nuovi, dei quali vengono valutate le loro caratteristiche.
• Prelevando e isolando un microrganismo da ambienti già arricchiti in cui le condizioni ambientali hanno favorito la moltiplicazione di m.o. che si sono adattati. A seconda delle caratteristiche che si stanno cercando si possono andare a ricercare i microrganismi in ambienti in cui c’è già stata una selezione naturale.

Esempi:

Azienda biotech che si occupa di risanamento ambientale: si vuole produrre un m.o. che riesca a degradare gli idrocarburi e che quindi possa essere utilizzato per andare a risanare ambienti inquinati dal petrolio. Il m.o. in questo caso verrà isolato da un ambiente che ha già fatto una selezione.

Se si cercasse un produttore di antibiotici invece bisognerebbe fare uno screening a tappeto perché si trova ovunque, anche nelle grotte. Gli antibiotici ai batteri servono per la competizione, alcuni batteri vengono inibiti, altri no e possono crescere.

Una volta isolati e identificati determinati batteri, bisogna fare una selezione e quindi scegliere quelli che hanno caratteristiche migliori, magari quelli che producono una sostanza nuova oppure quelli che producono una sostanza già conosciuta ma in maniera più abbondante e redditizia (con una resa maggiore rispetto a processi che sono già in uso per produrre quella sostanza).

Se la sostanza prodotta è completamente nuova devono essere valutate:

• L’attività biologica (cosa fa) e la tossicità (con dei test di tipo farmacologico si determina come viene assorbita, distribuita ed escreta).

Queste ricerche fanno parte dello screening secondario.

Viene considerato un ceppo batterico X che produce una sostanza sconosciuta Y, che ha una buona attività biologica ma è prodotta in poche quantità dal batterio (la resa è molto bassa). Quindi si fa il cosiddetto miglioramento genetico per selezionare quelli che sono i ceppi altoproduttori (mutageni).

Le mutazioni sono dei cambiamenti della sequenza del DNA, sono spontanee e possono essere dovute a errori della DNA polimerasi --> mutazioni puntiformi.

Traslocazioni, inversioni e delezioni sono invece dovute a errori durante la mitosi (appaiamento tra omologhi) e interessano porzioni di DNA più grandi.

Causano variabilità genetica.

Per questo motivo devo aumentare il numero di ceppi mutanti e lo si fa aumentando la frequenza di mutazione attraverso sostanze mutagene come radiazioni UV, o sostanze chimiche come la nitrosoanilina, che è un analogo di una base (una guanina mutata). Molti batteri moriranno, altri invece sopravvivono perché è avvenuta la mutazione. Ovviamente le mutazioni non sono sito-specifiche ma generiche nel genoma.

Una volta ottenuti ceppi mutati si effettua uno screening, ovvero si selezionano i ceppi che hanno la caratteristica che sto cercando: quella di produrre Y con una resa alta rispetto al ceppo di partenza.

Questo avviene sia nel caso in cui il m.o. è nuovo e non si conosce, sia nel caso in cui la sostanza sia nuova e quindi non si conosce nemmeno la via metabolica.

Se invece viene selezionato un m.o. prelevato dall’ambiente ma che è noto e che produce o una sostanza nota (di cui si conosce anche la via metabolica) o non nota (ma di cui è possibile risalire in poco tempo alla via metabolica).

Esempio: un ceppo di E. coli produce poco triptofano.

Un microrganismo è noto quando si conoscono:

• Le procedure che permettono di manipolarlo geneticamente, come le tecniche di trasformazione, plasmidi.
• La sequenza genomica.
• La via metabolica che porta alla produzione del metabolita che si sta considerando; quindi si conosceranno anche gli enzimi, i geni e la regolazione della via metabolica.

Quindi si può clonare il gene che produce l’enzima per la sintesi del metabolita, si agisce dunque in maniera mirata (ingegneria metabolica che crea microrganismi modificati tenendo conto del risvolto metabolico).

I ceppi vengono migliorati con tecnologie differenti a seconda delle conoscenze che si hanno del microrganismo che si sta utilizzando: se è un microrganismo noto si avranno una serie di opportunità in più, con le tecnologie del DNA ricombinante; se il microrganismo è sconosciuto ci si affida alla mutagenesi random e allo screening dei mutanti per il fenotipo che si sta ricercando e quindi alla produzione del metabolita a rese più elevate.

Terreni di coltura della microbiologia industriale

I microrganismi devono poi essere coltivati e si devono utilizzare tutta una serie di sostanze nutritive. Sostanze nutritive per la formulazione dei terreni della microbiologia industriale che non hanno le stesse caratteristiche dei terreni utilizzati comunemente nella microbiologia di laboratorio.

I terreni utilizzati in laboratorio, anche quelli di cui non si conosce l’esatta composizione chimica, sono tutti purificati, si tratta quindi di prodotti costosi. La microbiologia industriale lavora con volumi di terreno molto elevati, si parte dalla scala di laboratorio e si arriva alla scala produttiva, l’obiettivo è però quello di spendere il meno possibile.

Gli ingredienti utilizzati nei terreni di coltura della microbiologia industriale devono contenere tutti i nutrienti indispensabili alla crescita del microrganismo (una fonte di carbonio, una fonte di azoto, una fonte di fosforo), ma hanno una provenienza differente, si tratta solitamente di prodotti di scarto di altre aziende, soprattutto dell’azienda alimentare.

Oltre a costare poco, vanno ad aumentare quello che è il grado di elevata sostenibilità ambientale dell’industria biotech, poiché un rifiuto è stato trasformato in una risorsa, in un bene di consumo.

Esempi:

Saccaromelasso: prodotto di scarto degli zuccherifici. Contiene, oltre ad altre sostanze, dal 40 al 50% di saccarosio. Per lo zuccherificio, poiché il saccarosio non è un prodotto ad alto valore aggiunto, estrarre quel 40-50% di saccarosio presente nel saccaromelasso non è conveniente perché per estrarlo si spende troppo rispetto al valore aggiunto che ha; agli zuccherifici conviene quindi smaltirlo.

Lo smaltimento è però un problema molto importante per questa industria; l’avvento dell’industria biotech ha permesso di utilizzare questa soluzione di acqua e zucchero molto concentrata come ingrediente di base per i terreni di coltura della microbiologia industriale.

Siero di latte: prodotto di scarto e quello che rimane del latte dopo che è stato prodotto formaggio. Anche questo per i caseifici è un prodotto di scarto e costituirebbe una fonte di spesa; il siero di latte contiene ancora molte proteine, lattosio, sali minerali, per cui è un ottimo ingrediente per i terreni di coltura della microbiologia industriale.

Acqua di macerazione del mais: ciò che rimane dalla lavorazione del mais. Contiene fosfati, composti dell’azoto, per cui è una buona fonte di fosforo e azoto.

Poiché sono delle sostanze che non sono pure, di volta in volta devono essere controllate; deve essere valutata la purezza: per ogni stock di ingrediente che si compra deve essere valutata l’eventuale presenza di sostanze che potrebbero inibire la crescita del particolare microrganismo che si sta coltivando e, qualora fossero presenti tali sostanze, o le si rimuovono oppure si scarta il lotto di terreno.

Fra gli ingredienti dei terreni di coltura, viste le peculiari caratteristiche dei bioreattori, devono essere utilizzati degli agenti antischiuma, soprattutto degli oli minerali che impediscono la formazione delle schiume.

Questo perché durante la crescita, i microrganismi, crescendo in agitazione, potrebbero produrre schiuma, in particolare quando i microrganismi producono esoenzimi e secernono tante proteine (sono infatti le proteine che, se agitate, generano schiuma).

Le fonti di carbonio possono essere rappresentate da:

• Saccaromelasso: il substrato è solitamente il glucosio invertito (invertasi, enzima che scinde il saccarosio in fruttosio e glucosio => il substrato che hanno a disposizione le cellule non è tanto il saccarosio ma il glucosio).

Il glucosio può essere fornito anche:

• Dai cereali, quindi dall’amido che viene degradato.
• Dalla cellulosa dopo aver subito come pretrattamento macinazione, cottura, idrolisi.
• Dal siero di latte che contiene il lattosio, che viene idrolizzato.

Il substrato carbonioso può essere rappresentato anche da idrocarburi, come petrolio che viene distillato.

Le fonti di azoto possono essere rappresentate da proteine derivate dalla soia, proteine che vengono quindi macinate; dall’acqua di macerazione del mais (corn steep liquor); le fonti di azoto proteico possono derivare anche dal latte intero, scartato, da scarti di macerazione; l’azoto può essere anche in forma ammoniacale, quindi forma inorganica (forma ridotta), o in forma ossidata sotto forma di nitrati e nitriti.