Biotecnologie delle specie erbacee - Appunti

Metodologie

Predomina l'uso della PCR.

RFLP

Oggi poco usata perché troppo laboriosa, si basa su 2 principi: uno sull'uso dell'ibridazione in Southern DNA-DNA e l'altro sul rilevamento di polimorfismi attraverso il taglio con enzimi di restrizione; prima dobbiamo digerire, restringere il DNA genomico con enzimi di restrizione che vanno a trovare i polimorfismi, cioè le differenze tra i genotipi.

Metodo DNA-DNA: facciamo ibridare una sonda marcata radioattivamente, va ad ibridarsi, separiamo i frammenti ristretti come singoli filamenti denaturati poi li trasferiamo su supporto solido, facciamo avvenire l'ibridazione con la sonda marcata a singolo filamento, quella porta il tracciante radioattivo, è omologa al pezzettino tra i 2 siti di restrizione e va a ibridare solo lì, andrà a ibridare un po' tutto il supporto solido, ma in maniera stringente solo nel pezzettino dove c'è il suo omologo frammento ristretto legato al supporto solido.

È un procedimento molto lungo, serve poi una grande quantità di DNA per poterlo trasferire su supporto solido, il DNA ristretto con enzimi.

RADP

(Sinonimo AP-PCR): viene dal 1990, già l'acronimo vuole significare che era un metodo rapido per evidenziare variazione nei genotipi, si basa su un solo primer e perché questo solo primer possa trovare due siti di appaiamento per innescare una reazione di PCR sia sul filamento forward che sul filamento reverse non può essere troppo lungo, altrimenti non avrebbe la probabilità statistica di incontrare 2 stretch di 20 paia di basi a distanze amplificabili, es. una chilobase.

Se invece il primer è più corto, es. 10 paia di basi, e se le condizioni di PCR non sono troppo stringenti possiamo con una semplice aggiunta di un primer amplificare più loci in ciascun genotipo, quindi andare a trovare differenze di sequenza.

Difetti: se cambiamo marca di Taq il pattern cambia, se variamo le condizioni di PCR il pattern cambia, alla fine nel pattern complesso non riusciamo a distinguere omozigoti da eterozigoti perché non riusciamo a seguire nel pattern quale è uno dei 2 alleli perché abbiamo la confusione dovuta all'amplificazione di altri loci.

Non solo, quando si prova a sequenzare bande che derivano da amplificazione RAPD molto spesso queste bande sono popolazioni di bande dello stesso peso.

Microsatelliti e ISSR

ISSR assomigliano al sistema RAPD, si basano su una diversa fonte di variazione fra genotipi, la fonte di variazione che viene identificata da questi marcatori è il numero di short tandem repeat, cioè si è visto che in natura all'interno del DNA genomico sono presenti questi short tandem repeat che sono delle sequenze ripetute corte in tandem, 2-4 paia di basi ripetute una dopo l'altra un numero x di volte.

Una volta scoperta l'abbondanza relativa di questo tipo di sequenze nel genoma dei vegetali si è scoperto anche che esistevano differenze nelle lunghezze di questi repeat tra genotipi e queste lunghezze possono essere al limite di un singolo repeat, quindi se il repeat è di 2 basi la differenza tra il genotipo 1 e il genotipo 2 sarà di soltanto 2 paia di basi.

Queste differenze sono corte però facilmente riscontrabili, cioè l'abbondanza di polimorfismi è grande; le sequenze fiancheggianti questi short tandem repeat sono usualmente conservate all'interno di una specie quindi le possiamo andare a sequenzare e produrre dei primer che ci consentano in buona parte di amplificare i repeat più qualcosina che sta a destra e a sinistra; e quindi evidenziare le differenze.

Possiamo amplificare 2 alleli parentali omozigoti, allo stadio eterozigote o omozigote per altri parentali, quindi il dato è molto informativo; l'unico problema consiste nel fatto che questi short tandem repeat non li riconosciamo a priori, per cui è impossibile andare ad amplificare direttamente.

Serve una libreria genomica generalmente arricchita in sequenze microsatellite, vengono sostanzialmente selezionate quelle che contengono microsatellite e solo questi vengono sequenziati per vedere se contengono o no gli short tandem repeat; quando si verifica che li contengono si producono i primer, si prova a vedere e dopo si vede se amplifica e dopo se è polimorfico.

Anche questo processo è lungo anche se hanno una affidabilità molto buona oltre al fatto che ci danno una bella fotografia della variabilità genetica all'interno di una specie perché generalmente sono multiallelici, cioè è facile che ci saranno individui che portano 17 di questi repeat, individui che ne portano 16 e individui che ne portano 30 e così via, per cui avremo una bella fotografia della variabilità.

Un altro limite è che questo tipo di marcatori è specie-specifico o esportabile all'interno di un genere, di specie molto simile.

Qualcuno ha pensato bene di abbinare la facilità d'uso dei marcatori RADP con il rilevamento di microsatelliti, amplificando le regioni che stanno tra i microsatelliti e allora si produce un marcatore su un microsatellite.

Un altro nome per gli ISSR è SSLP, diciamo che i short tandem repeat stanno all'interno di una categoria di marcatori molecolari chiamati VNTR, perché esiste anche il modo di identificare le variazioni di lunghezza di sequenze minisatelliti con motivi più lunghi ripetuti in tandem sopra le 8-10 paia di basi, quindi le variazioni sono più grandi, l'abbondanza è relativamente minore e chi l'ha scoperta aveva iniziato a identificare questa differenza semplicemente con una metodica di tipo RFLP, oggi sono abbondantemente abbandonati e superati dagli short tandem repeat.

Negli ISSR le differenze sono piccole tra questi repeat, per cui la separazione deve avvenire o in gel di acrilamide colorato con nitrato d'argento o tracciante radioattivo che riesca a separare differenze piccole; se voglio essere assolutamente sicuri della dimensione di un microsatellite devo riamplificare, facendo una PCR sull'amplificato e vedo quali sono i frammenti più rappresentati.

Con questo tipo di analisi c'è la possibilità sia di fare più PCR e mettere insieme i prodotti di amplificazione, fare una separazione unica soprattutto se abbiamo la possibilità di usare coloranti diversi applicati ai primer e co-separarli, correranno comunque tutti e due vicini.

Possiamo anche, ottimizzando una reazione di PCR, multiplexare qualche microsatellite in PCR mettendo più primer non omologhi che non annealano tra loro, facendo coamplificazioni per produrre più dati in un'unità di tempo.

AFLP

Se vogliamo marcatori che ci consentono di avere un numero di dati molto elevato per singolo esperimento dobbiamo usare questa metodologia, gli AFLP sono nati come metodologia che unisce i vantaggi dell'utilizzo degli enzimi di restrizione a quelli della PCR più o meno casuale, nel senso che abbiamo un procedimento abbastanza complicato e non immediato, i passaggi sono diversi.

Innanzitutto bisogna separare, dividere il DNA genomico con gli enzimi di restrizione, chi ha inventato la tecnica ha visto che la metodologia nei vegetali il numero ottimale di frammenti ristretti si ottiene usando 2 enzimi di restrizione: un enzima di restrizione six cutter che riconosce 6 paia di basi con EcoRI e un sito di restrizione cosiddetto 4 cutter che riconosce 4 paia di basi.

Questo perché la numerosità dei siti di restrizione delle 4 paia di basi per una semplice legge statistica è molto maggiore della numerosità dei siti di restrizione di 6 paia di basi.

Se digerissimo solo con un enzima di restrizione avremo un certo numero di frammenti ristretti che per la metodologia non va bene, digeriamo con i due e peschiamo soltanto quelli che hanno a sinistra un enzima o a destra un altro enzima con un primer disegnato specificamente sul sito di restrizione.

Come si fanno a ripescare? Bisogna fare inizialmente una reazione di ligazione, aggiungendo un adattatore, un oligo che viene aggiunto al sito di restrizione con una T4 DNA ligasi, poi a questo punto abbiamo dei primer cosiddetti preselettivi che possono essere lunghi una ventina di paia di basi includendo il sito di restrizione.

Quindi aggiungiamo da una parte il primer preselettivo EcoRI, dall'altro il primer preselettivo MseI e facciamo avvenire la reazione di PCR, uno sul forward e l'altro sul reverse, quindi alla fine amplificheremo soltanto quelli che avranno il forward, frammenti che hanno un sito Eco, e dal primer reverse quelli che hanno un sito MseI, facendo una preselezione.

Poi si vanno a considerare i cosiddetti polimorfismi facendo l'amplificazione selettiva: su questa amplificazione abbiamo una grande famiglia di tanti frammenti, tutti quelli che contengono i 2 siti e sarebbero davvero tanti, inseparabili.

Si aggiungono dei primer disegnati a tavolino che includono il primer marcatore e che poi hanno da una a 4 basi aggiuntive disegnate a tavolino e hanno dei nomi alfanumerici; entro certi limiti se il genoma è grande aggiungiamo più basi casuali selettive, se è piccolo aggiungiamo meno basi, comunque sia facciamo una selezione e amplifichiamo solo quei frammenti specifici che hanno l'adattatore, il sito Eco e quelle 2 basi che ho aggiunto io, dall'altro sul reverse hanno l'adattatore, il sito MseI e quelle 2 basi che ho aggiunto io.

Il polimorfismo che andiamo a identificare sono perdita di uno dei 2 siti di restrizione o allungamenti tra i 2 siti di restrizione Eco-MseI, il pattern è complesso difficile da discriminare però di fatto avremo piccole delezioni ed inserzioni, perdite di questi siti; anche in questo caso è molto difficile andare ad identificare quali sono le bande eterozigoti, difficile anche andare a rilevare differenze di intensità: omozigote ed etero nel caso che uno dei 2 cromosomi abbia perso uno dei due amplificati.

Il vantaggio di questa tecnica è che una volta creato il pool di frammenti della preamplificazione, abbiamo un sacco di questi amplificati che possiamo amplificare con diverse combinazioni di primer preselettivi e da poco DNA di partenza trovare un numero impressionante di polimorfismi; la potenza vera di questa tecnica è il numero di dati ottenuti relativamente con poco sforzo con una buona affidabilità.

Mancano due corollari agli AFLP che sono venuti dopo: amplificando non usando i primer sugli adattatori, ma solo un primer sull'adattatore e un altro primer su una sequenza microsatellite, di fatto quindi avremo i marcatori di tipo SAMPL che vanno ad amplificare solamente frammenti AFLP che hanno dentro microsatelliti, sono serviti solo a chi li ha inventati.

I retrotrasposoni sono dispersi nel genoma, sono una grande parte del genoma dei vegetali, sono sequenze non trascritte, non tradotte che fanno lo scheletro del genoma dei vegetali e alla fine di questi retrotrasposoni ci sono delle sequenze conservate dette LTR.

Se noi disegniamo un primer a tavolino su un LTR amplificheremo soltanto frammenti AFLP che contengono all'interno un retrotrasposone, anche questi lasciano il tempo che trovano.

Marcatori SCAR e CAPS

• Marcatori SCAR: derivano da marcatori precedenti.
• Marcatori CAPS: quando il polimorfismo si trova soltanto restringendo l'amplificato.

Reazione metodologica sugli SNP

Un SNP è un acronimo che significa un cambio di una singola base tra 2 genotipi, siamo in un altro campo biologico di polimorfismi che è quello delle mutazioni puntiformi, siccome le variazioni tra genotipi avvengono per mutazioni che possono essere grossolane o puntuali, in questo caso puntiforme.

Se differenze tra genotipi sono dovute soltanto al cambio di una base il peso e la dimensione di questi frammenti amplificati non cambia, non si vedono quindi e perdiamo un sacco d'informazione che invece nel genoma c'è; il marcatore SNP non sono altro che tutta una serie di metodologie che consentono di rilevare queste variazioni.

La frequenza di queste mutazioni puntiformi è elevata, nel genoma umano la frequenza è di un marcatore SNP per ogni chilobase o anche meno, 500-1000 paia di basi, una mutazione puntiforme tra 2 genotipi; nelle piante ce ne sono ancora di più, nel mais addirittura ne sono state trovate una ogni 100 paia di basi, in genere sono più frequenti nelle piante rispetto all'uomo.

Sono frequenti anche se sono un pochino meno informativi rispetto ai microsatelliti perché sono biallelici generalmente, cioè troviamo 2 alleli, un genotipo ad es. porta una A, e un genotipo porta una C e la differenziazione della popolazione è tutta in A-C perché è difficile che 2 mutazioni puntiformi avvengano in uno stesso posto.

Ci sono 2 diverse scuole di pensiero, c'è chi definisce come polimorfismo la presenza di un allele diverso nell'1% di una popolazione e c'è chi lo definisce solo quando lo troviamo al 5%, anche se all'1% può bastare, cioè se sequenziamo 100 genotipi e 99 hanno una A e uno ha una C, in questo caso non è una casualità, ma un vero polimorfismo, è un vero marcatore.

È molto più frequente delle inserzioni, delezioni; quindi sono tante; le inserzioni, delezioni erano corte da 2 a 38 chilobasi, molte di queste riguardavano geni interi, deleti.

Questi SNP sono più del 52% transizioni, cioè mutazioni purina-purina o pirimidina-pirimidina, cioè significa che su un filamento una A è stata mutata in una G per cui sull'altro invece di esserci una T c'è una C, quindi cambiamenti da A-T a G-C se vediamo un diploide.

Transizioni significa mutazioni da adenina a guanina o da timina a citosina, più del 52% sono di questo tipo le mutazioni perché sono le più semplici e le molecole sono molto simili, quindi tra una guanina e una citosina manca un sostituente, manca un gruppo sostituito; meno rappresentate sono le trasversioni per motivi chimico-fisici, cioè motivi di natura chimica delle basi del DNA, quanto più o meno facilmente sono mutabili.

Dove si trovano gli SNP

Gli SNP dove si trovano? All'interno dei geni, nelle regioni intergeniche, in diverse parti dei geni, sono più frequenti nelle regioni geniche che nelle regioni intergeniche particolarmente nelle regioni 5' UTR e 3' UTR più che negli introni.

Dove possono essere gli SNP e che significato possono avere? Potrebbero essere in regioni non codificanti, oppure potrebbero essere all'interno di geni e se sono all'interno di geni possono essere in regioni non codificanti, es. introni, in 5' UTR o in 3' UTR.

Averle in 5' UTR potrebbe modificare la regolazione di questi geni, se sono invece nell'open reading frame, cioè nel tratto codificante del gene, potrebbero anche essere mutazioni sinonime, cioè mutazioni che non portano sostituzioni di aminoacidi, cambia la base, ma ci sono diverse triplette che codificano per un aminoacido quindi non cambia e si chiamano mutazioni sinonime.

Oppure potrebbero essere mutazioni in regioni codificanti non sinonime, quindi cambiano l'amminoacido, ma lo cambiano con un altro amminoacido che ha lo stesso chimismo, si dicono mutazioni conservative: la proteina ha la stessa funzione.

Se invece cambiano gli amminoacidi si suppone che queste siano mutazioni puntiformi in regioni codificanti, non sinonime e non conservative; gli SNP più importanti sono quelli che sono in regioni codificanti non sinonime e non conservative che danno, si dice, un polimorfismo funzionale, una differenza nella sequenza genica che ha una relazione con la funzione.

Un altro tipo importante di mutazioni SNP potrebbe essere quello di essere presenti in regioni regolative, non tutti gli SNP hanno lo stesso valore se li andiamo a vedere all'interno di una sequenza genica, se li andiamo a vedere all'interno di un genoma anche lì non avranno tutti lo stesso valore, ne avremmo una ridondanza di dati che hanno un valore limitato e dopo uno studio di associazione di un carattere importante sapremo quali sono quelli utili, grande obiettivo per l'industria farmaceutica.

Vantaggi dei marcatori SNP

Se andiamo a riassumere i vantaggi di questi marcatori sono diversi: gli SNP peculiari sono quelli delle analisi QTL con effetti minori, studi di genetica evoluzionistica, la farmacogenomica: applicazione degli SNP ai test genetici.

I vantaggi dal punto di vista metodologico sono: sono i più frequenti, sono ben spaziati anche perché queste mutazioni avvengono casualmente, consentono di ottenere tantissimi dati nell'unità di tempo quindi consentono studi su larga scala, cosa che tanti marcatori non fanno, e inoltre sono codominanti quindi possono essere rilevate le 2 forme alleliche, sono collegate alle informazioni di sequenza anzi non sarebbero potuti nascere se prima non fossero nati i sequenziatori relativi agli organismi viventi; sono usati per trovare associazioni con caratteri senza dover passare attraverso popolazioni genetiche costruite ad hoc.

Fasi metodologiche del marcatore SNP

Le fasi metodologiche di ottenimento del marcatore SNP sono 2: una si chiama discovery e l'altra detection; nella fase discovery scopriamo che tra quei 2 genotipi c'è un SNP, cioè un cambio di una base, sappiamo se c'è o non c'è in questa fase.

Questa fase è molto importante in specie con poca variabilità genetica per non fare troppo lavoro inutile, con la detection lo andiamo a isolare e a identificare poi dobbiamo andarlo a renderlo visibile, detectarlo e questa è la fase più applicativa.

A fare discovery andiamo a sequenziare utilizzando strategie alternative, nel senso che essendo il cambio di una base, il modo migliore per vedere se c'è polimorfismo è andare a sequenziare quel frammento di genoma in un individuo e nell'altro, poi mettiamo a confronto le 2 sequenze e vediamo ad es. che una ha una A e uno ha una C.

Il semplice sequenziamento di sequenze note possono essere direttamente passati a sequenziamento e si può vedere se tra 2 genotipi ci siano polimorfismi. Amplificoni significa frammenti amplificati passando attraverso la PCR, oppure si possono cercare SNP in silico, cioè essendo a disposizione in banche dati un numero impressionante di sequenze soprattutto di EST.