Biologia sintetica

Martina Lazzari: Biologia sintetica LMaa 2020-2021

DNA-fulled molecular machine made of DNA

Con il DNA si possono avere strutture dinamiche. Le pinzette hanno la transizione dallo stato aperto a quello chiuso. In questo caso la transizione è determinata dall’interazione tra le sequenze di DNA. La struttura della pinzetta è una sequenza di pochi nucleotidi (18), progettata in maniera arbitraria, del tipo: A questa vengono assortite due altre regioni B e C si ibridano alla sequenza A con un criterio di anti-parallelismo.

Si ha un punto cardine del sistema nel quale la sequenza non ibrida e resta a singolo filamento avendo una flessibilità adeguata per permettere al sistema di avere il passaggio dallo strato aperto a quello chiuso perché, essendo a monofilamento, ne permette l’apertura e la chiusura. Le due estremità devono creare le condizioni per la transizione di stato da aperto a chiuso. Assunto che il sistema è costruito in maniera appropriata non si può verificare il cambiamento di stato se non ci fossero degli emettitori di segnale, ovvero una coppia di molecole che hanno un determinato comportamento quando vengono irradiate con radiazione luminosa.

In questo caso l’applicazione è la FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), ovvero un trasferimento di energia tra due elementi che entrano in risonanza tra di loro e appartengono alla categoria dei fluorocromi che hanno un comportamento tipico del fatto che una volta irradiati con una certa lunghezza d’onda di eccitazione assorbono la luce del sistema emettendo a loro volta una radiazione che ha energia più bassa e lunghezza d’onda più elevata.

Interazione tra fluorocromi

Si ha la possibilità che l’emissione di un primo fluorocromo rappresenti un valore di picco che è ampiamente sovrapposto al valore di picco dello spettro di eccitazione di un secondo fluorocromo. Il quale riceverà l’energia che lo attiva dal primo e quindi in una situazione del genere con un assortimento appropriato di fluorocromi si ha che l’energia di emissione del primo è capace di eccitare il secondo e quindi nel momento nel quale ci sono le condizioni di distanza (<10 nm), quando si eccita il primo con la sorgente esterna, l’emissione del primo verrà totalmente catturata dal secondo che ne verrà eccitato e si acquisirà il segnale di fluorescenza del secondo avendo stimolato il primo.

Questo artificio permette di valutare quali sono i rapporti che esistono tra molecole che siano state funzionalizzate con due fluorocromi di una coppia FRET. Questa tecnica viene utilizzata per stabilire se due proteine in un certo contesto, tipicamente una cellula, sono associate oppure distanti.

Se si presume che all’interno della cellula uno svolgersi di una funzione si realizza per interazione progressiva tra una proteina e un’altra, si può monitorare nella cellula viva irradiando le cellule, dopo aver introdotto molecole di interesse funzionalizzate con marcatori fluorescenti, e verificando la radiazione prodotta in risposta allo stesso tipo di input; questa sarà differenziale in base a se le proteine reagiscono o no.

Funzionalizzazione delle estremità

Le estremità del filamento A sono state funzionalizzate in fase di realizzazione con due elementi che sono in grado di comportarsi come una coppia FRET, chiamate TET e TAMRA. TET è un fluorocromo della specie della fluoresceina ed emetterà nella regione del verde. Questa proteina viene eccitata con una radiazione avente lunghezza d’onda di 514,5 nm ed emette con una lunghezza d’onda di 536 nm. TAMRA rispetta il concetto del comportamento di risonanza energetica in fluorescenza ed è una variazione di TET. Infatti, è un quencher di TET, ovvero quando entra in risonanza con TET, invece di emettere una radiazione con lunghezza d’onda diversa, questa la assorbe in ingresso e la dissipa oscurando il segnale.

Ci si aspetta quindi che in queste condizioni di radiazione si produca radiazione verde che corrisponde allo stato aperto. Quando invece la configurazione è chiusa, determinando l’avvicinamento della coppia FRET, si ha un’uscita nulla. Esistono numerose coppie FRET.

Induzione del cambiamento di stato

Per indurre questo cambiamento di stato entrano in gioco le due sequenze parzialmente ibridate. Si usa una sequenza F complementare alle sequenze libere della pinzetta (24 + 8). Questa sequenza ha un’estremità ridondante che va oltre il segmento che viene ibridato e ha la funzione di permettere la riapertura della pinzetta perché la transizione può diventare ciclica quando le viene somministrata una sequenza che è complementare alla sequenza F, chiamata F segnato. La sottrazione del filamento F, che funzionava da carburante in ibridazione con il complesso che forma la pinzetta, determina la sua riapertura. Quindi, la sottrazione di F determina la riapertura della pinzetta.

F preferisce il complementare monofilamento rispetto alla pinzetta perché si ha maggiore energia di legame di quella che si sviluppa con la pinzetta. Questa differenza di energia chimica è sufficiente a garantire che F segnato sottragga F alla pinzetta, determinando la transizione. Questa operazione verificata nel tempo attraverso la somministrazione sequenziale di F e F segnato nella pinzetta mostra che il fenomeno è ripetibile.

In questo tipo di segnale è evidente la riduzione dell’intensità del segnale nel tempo. Questo è dovuto a un danneggiamento della coppia FRET, in particolare dell’elemento che emette fluorescenza (TET). Il deterioramento può essere attribuito al fatto che i fluorocromi hanno un periodo di vita e si deteriorano nel tempo.

ELBAZ - pH-stimulated concurrent mechanical activation of two DNA tweezers: un set-reset logic gate system

Ci si ritrova a sviluppare il concetto in un sistema nel quale l’elemento che determina la transizione è la condizione ambientale pH. Si ha una pinzetta che è una coppia di pinzette che hanno una transizione chiuso-aperto sulla base delle condizioni di pH. La regione in azzurro si lega alla zona marrone o a quella rossa a seconda delle condizioni di pH per chiudere le pinzette. Questo è legato alle energie di ibridazione.

I trattini mostrano i punti di ibridazione. Quando le due pinzette si trovano con le estremità libere e il frammento celeste ha la possibilità di scegliere la pinzetta A e quella B sceglie la pinzetta A perché crea più legami idrogeno rispetto che con la pinzetta B. Le condizioni di linearità dell’estremità alle quali l’elemento celeste può ibridarsi sono determinate dall’alcalinità dell’ambiente nel quale si trovano le pinzette.

Se si somministrano dei protoni in soluzione abbassando il pH, le condizioni di ionizzazione delle basi azotate delle estremità della pinzetta A formano una configurazione strutturale particolare che si ritrova nei telomeri dei cromosomi cellulari. Una struttura tridimensionale che ha un’organizzazione in G quadruplex che forma una scatola di ibridazione intracatena che non lascia spazio all’elemento azzurro di ibridare il tweezer A e potrebbe ibridarsi solo con B. Quindi si avrà specularmente A aperto e B chiuso. Anche in questo caso si ha l’acquisizione di segnale fluorescente FRET che usa due coppie FRET, una per pinzetta.

I filamenti che si ibridano sono quelli verdi mentre quelli marroni penzolano ai lati della pinzetta. Si ha una regione centrale che non ibrida né 2 né 3 e agisce da cardine per la chiusura della pinzetta. Analogamente per la sequenza 4 che è complementare a parte delle sequenze altrimenti penzolanti in marrone.

La somministrazione di protoni liberi (acidificazione) determina una configurazione particolare degli estremi della pinzetta ed è una struttura dove invece che formarsi una tipica struttura secondaria in duplex, il DNA forma una sorta di parallelepipedo attraverso una ibridazione di basi in sequenze che sono ricche in citosina. Il quadruplex ha energia stabilizzatrice maggiore di quella che le stesse sequenze sviluppano legando il frammento celeste che viene eliminato e si ha la transizione tra lo stato chiuso e aperto.

Il passaggio di stato non è apprezzabile se non usando il segnale di fluorescenza prodotto dalla funzionalizzazione degli estremi della sequenza 1. In questo caso si ha un fluorocromo ROX che ha coppia di eccitazione-emissione differente e il segnale acquisito è rosso. Viene acquisito se ROX non si trova a meno di 10 nm di distanza con il quencher chiamato Black hole.

Se si tiene la pinzetta sotto continua irradiazione si può apprezzare la presenza di fluorescenza in presenza di acidità. La configurazione definitiva del dispositivo è rappresentata dalla compresenza di due pinzette nello stesso sistema che si contendono l’ibridabilità della sequenza celeste tale che a seconda di quale pinzetta viene ibridata ne risulti la chiusura. La formazione del quadruplex sulla pinzetta A rende possibile l’ibridazione sulla pinzetta B del frammento celeste. La pinzetta B non è in grado di strappare alla pinzetta A il frammento celeste se non fosse per la formazione del quadruplex.

Valutando le fluorescenze delle pinzette il loro comportamento reciproco. Il sistema viene considerato come utilizzabile per certificare la transizione contemporanea di due elementi che mantengono due stati stabili, riconducibile al comportamento di una porta logica del tipo.

MODI - A DNA nanomachine that maps spatial and temporal pH changes inside living cells

Si usa una mappatura spaziale con una dinamica temporale delle condizioni di pH in determinati compartimenti di cellule viventi. Si suppone che le pinzette, che ricalcano la logica dell’articolo precedente, siano somministrabili a delle cellule e possano permeare in maniera diffusa le regioni del volume cellulare per emettere in maniera coerente con il loro stato di apertura o chiusura regolato dal pH, come nel caso precedente, e determinare l’acquisizione della fluorescenza non più come componenti omogeneamente in soluzione in una provetta ma come sensori emittenti un segnale fluorescente quando si trovano nelle regioni della cellula dove si concretizza il pH nel quale queste molecole sono nello stato non quenchato che produce fluorescenza.

La pinzetta è costituita da una staffa portante con un cardine che non ibrida permettendo la flessibilità dell’asse e due regioni che sono i terminatori delle due sequenze parzialmente complementari che sono libere di fluttuare nell’ambiente. È alle estremità di queste regioni che sono stati posizionati due tipi diversi di fluorocromo emittenti uno nel blu-verde e uno nel rosso.

Questi sono una vera coppia FRET, se si irradia con una singola fluorescenza nel blu che, a seconda che lo stato sia aperto o chiuso, con lo stesso input di eccitazione dà risposta o nel verde o nel rosso. Nel verde se il primo dei fluorocromi è distanziato dall’altro e nel rosso se è talmente vicino che si può creare il fenomeno di trasferimento di fluorescenza.

Si ha la possibilità che gli elementi liberi del dispositivo siano ibridati tra di loro in condizioni di acidità. Alcalinizzando la soluzione, l’energia di legame tra gli estremi si riduce e di conseguenza il sistema distanza i due fluorocromi e la lunghezza d’onda che si acquisisce è quella di emissione del primo dei due. Date queste caratteristiche del sensore, se si è in presenza di una molecola che può essere in grado di penetrare in una cellula.

Il passaggio tra il pH più acido e quello più alcalino in termini di transizione di fluorescenza ha lo stesso livello di efficienza sia in vitro che in vivo.

ADLEMAN - Molecular computation of solutions to combinatorial problems

Il percorso hamiltoniano corrisponde a definire se esiste o non esiste, in presenza di un grafo con n punti connessi da n archi, un percorso in grado di congiungere un definito punto di inizio a uno di destinazione toccando tutti i punti intermedi una volta sola.

Questo genere di problemi non ha algoritmi che riescono a ridurre il tempo di calcolo. Il vantaggio che viene garantito nel dare la risposta è semplicemente quello della rapidità con la quale un calcolatore verifica la validità dei percorsi. Ma non può fare altro che andare a tentativi verificando se la condizione attesa è effettivamente presente. Questo crea un utilizzo di tempo macchina molto lungo e invece la soluzione proposta da Adleman basata sulle proprietà di ibridazione spontanea del DNA è capace di dare una risposta pressoché istantanea.

Quello che accade in una provetta è un piano che si svolge a distanza dalla nostra capacità di verificarlo e quindi per far emergere qual è la risposta in seguito alla combinazione automatica delle sequenze in provetta occorre un tempo di laboratorio che non è insignificante. Questo si traduce nel fatto che questa soluzione proposta è rimasta sulla carta ma non è mai stata usata perché per riprodurre in laboratorio i seguenti passi:

• Generare un percorso casuale per il grafo
• Mantenere solo i percorsi che iniziano con il punto di partenza A e terminano con il punto di arrivo E
• Se il grafo ha n vertici si mantengono solo quei percorsi che entrano esattamente in n vertici
• Mantenere solo i percorsi che entrano in tutti i vertici del grafo almeno una volta
• Se rimangono dei percorsi di ‘Sì’, altrimenti ‘No’

In tempi estremamente brevi si ha la necessità di implementare delle tecniche richiedenti tempo e anche costi che non li rendono concorrenziali. Parte del problema che si pone è che la risposta che ci si aspetta è scarsa. Il problema hamiltoniano come risposta, infatti, prevede solo come risposta si o no. Il raffinamento successivo che permette di stabilire quale sia il percorso è un altro problema che viene affrontato di seguito anche con gli strumenti del biologo molecolare, che però non è una risposta ad una domanda della prima fase che si considera.

Si parte da un’idea di grafo complesso ma per ragioni di semplificazione si ipotizza l’uso di un grafo in cui il numero di nodi è limitato a 5. In questo grafo esistono una serie di archi che connettono i nodi che devono essere 5. La codifica degli archi risulta essere randomica (nel disegno a lato il percorso hamiltoniano è quello segnato in rosso).

Generazione del percorso casuale

Generare un percorso casuale per il grafo. I nodi e gli archi vengono codificati con del DNA. Si hanno delle sequenze monofilamento arbitrariamente definite e quindi sintetizzate in modo che ognuna di queste codifichi in modo univoco per i cinque nodi. Esistono delle specifiche per queste sequenze che sono sostanzialmente quelle considerate per i primer che si usano per una reazione a catena della polimerasi. Due cose che queste sequenze non devono fare sono che le sequenze non devono essere complementari e non devono ibridarsi tra di loro, inoltre non devono ibridarsi infracatena. La prima metà non deve essere, quindi, complementare alla seconda, altrimenti la sequenza si chiude su se stessa.

In quanto codici identificativi di ognuno dei nodi queste sequenze si possono considerare come il cognome e il nome di ciascuno dei nodi. Questo è di aiuto per l’identificazione degli archi del grafo. Per esempio, l’arco che congiunge B a D bisogna sintetizzare una sequenza antiparallela che sia complementare a quella del nodo di partenza e di quella del nodo di arrivo. Quindi si avrà una sequenza che ha la prima metà del nodo di arrivo e la seconda metà del nodo di partenza, come segue.

Per ottenere la soluzione del problema bisogna realizzare una saldatura dei 5 nodi che formano il percorso hamiltoniano con A in ingresso e E in uscita, determinata dall’ibridazione che producono per complementarietà intrinseca le quattro sequenze che rappresentano gli archi in questione per la realizzazione del percorso.

Quello che viene realizzato è la convergenza dei cinque nodi, realizzato con la sintesi di un numero equivalente di oligonucleotidi di lunghezza arbitraria che hanno una loro simmetria. L’aggregazione delle sequenze viene realizzata dalle sequenze che si codifica in una maniera che deve tenere conto di come sono strutturate le sequenze dei nodi. Gli archi non sono quindi sequenze arbitrarie ma che riproducono in maniera complementare e antiparallela che sono in grado di ordinare il nodo di partenza davanti al nodo di arrivo in un’unica sequenza risultante.

Bisogna immaginare che nella configurazione di partenza della soluzione in laboratorio del problema ci siano anche gli archi che determinano la formazione di percorsi alternativi che non sono quelli di interesse.

Se si versano in una provetta le sequenze generate, dei nodi e degli archi, la presenza di un percorso hamiltoniano viene determinata dal realizzarsi di una struttura che è uno pseudo duplex del tipo:

Un’operazione di questo tipo è instabile perché, a meno che non vengano bloccati nella posizione, rischia di rendere inutilizzabile il sistema. È quindi importante determinare la ligazione con la ligasi. La ligasi agisce spendendo energia fornita dall’ATP che deve essere somministrato al sistema insieme alla ligasi e forma un legame fosfodiesterico che conferisce stabilità alla struttura. Dopo l’uso della ligasi i filamenti diventano dei filamenti continui di duplex, non più un assemblaggio instabile di frammenti di cui si può predire la lunghezza, avendo 5 frammenti di 2.