Biologia, prof. Salvetti

Biologia molecolare

Prof.ssa Alessandra Salvetti

Corso di laurea in Medicina e chirurgia

Canale L-Z

A.a. 2014-2015 A.B1

Membrana cellulare

Fatta da tre macromolecole:

Lipidi

Lipidi: hanno testa idrofila e coda idrofobica, nelle membrane esistono diversi tipi di fosfolipidi con caratteristiche diverse (…..). Dal confronto della composizione lipidica delle membrane plasmatiche di diversi tipi di cellule appare che c’è una differenza qualitativa e quantitativa nella composizione delle membrane.

La cardiolipina, un lipide tipico della membrana plasmatica batterica, si ritrova nella membrana del mitocondrio, che infatti probabilmente ha origine batterica.

L’unico modo in cui i lipidi si possono posizionare per formare membrana è il doppio strato fosfolipidico: essendoci acqua nell’ambiente extracellulare e nell’ambiente del citosol si tratta dell’unico modo per non fare entrare in contatto le code idrofobiche con l’acqua.

Questo però non è sufficiente, perché sul bordo avrei ancora code idrofobiche a contatto con l’acqua, così avviene la chiusura del foglietto planare, questa struttura chiusa è favorita energicamente.

Il doppio strato è un fluido bidimensionale, quindi i lipidi possono muoversi all’interno di ogni monostrato compiendo una diffusione laterale oppure ruotando su se stessi.

È più difficile che il lipide passi da un monostrato all’altro, questo passaggio si chiama diffusione trasversale, passaggio del lipide da un monostrato all’altro, o movimento a flip-flop: evento che richiede flippasi, categoria di enzimi che servono per far avvenire la diffusione trasversale dei lipidi.

È possibile marcare i lipidi di superficie con una molecola in grado di emettere fluorescenza. Prendiamo delle cellule e utilizziamo questa molecola che si lega ai lipidi di membrana, così al microscopio a fluorescenza, usando una determinata lunghezza d’onda, sono in grado di eccitare questa molecola e vedo una cellula punteggiata.

Se con un laser distruggo la molecola fluorescente in una zona precisa della superficie della cellula (PLICCING?) vedrei un buco nero, ma se la riguardo dopo un po’ mi accorgo che il buco nero non ha più le stesse dimensioni, perché i lipidi si sono spostati.

La fluidità delle membrane dipende dalla composizione lipidica. Un ruolo importante lo svolgono le code idrocarburiche idrofobiche, perché i lipidi sono tutti vicini con le code che interagiscono.

Più queste code sono lunghe e minore è la fluidità, perché maggiori sono le interazioni. Le code lunghe determinano un aumento della temperatura di transizione, alla quale avviene il passaggio da fluido cristallino a gel.

Se vengono inseriti dei doppi legami si ha una distorsione della coda idrocarburica, quindi se io ho una distorsione le interazioni fra code vicine sono minori rispetto alle interazioni fra code sature, cioè code senza doppi legami, quindi l’introduzione di doppi legami determina un aumento di fluidità.

Per avere fluidità creo insaturazione e scorcio le code. Se la temperatura esterna è più alta di quella di transizione avrei una membrana troppo fluida e questo non va bene perché per essere efficienti le membrane devono mantenere la giusta fluidità, allora allungo le code e riduco la presenza di doppi legami.

Il colesterolo, solo nelle cellule eucariotiche, ha un ruolo fondamentale nella fluidità della membrana. Testa idrofilica e regione fatta dagli anelli steroidei che è idrofobica.

Ha una duplice funzione sul controllo della fluidità che dipende dalla temperatura: ad alte temperature le membrane tenderebbero a diventare troppo fluide e i lipidi a distanziarsi, ma il colesterolo, essendo una struttura rigida, interagisce con le code vicine e mantiene uniti i lipidi, diminuendo la fluidità.

Invece, se la temperatura si abbassa, le membrane tenderebbero a gelificare e in questo caso, dove è presente il colesterolo, le code si possono impacchettare con difficoltà perché il colesterolo fa da ingombro e quindi si mantiene una maggiore fluidità.

Il colesterolo ha il compito di mantenere la fluidità e si trova concentrato in microdomini o zolle lipidiche.

Adattamento omeoviscoso: è la capacità della cellula di adattare la fluidità della propria membrana in risposta alle condizioni ambientali, allungando o accorciando le code idrocarburiche oppure regolando l’insaturazione.

La fluidità della membrana è importante perché permette la diffusione delle proteine di membrana e la loro interazione ed è importante come barriera di selettività, inoltre permette la fusione tra cellule e vescicole.

La distribuzione lipidica non è uniforme: c’è differenza tra composizione lipidica di membrane diverse, ma anche nella stessa membrana non c’è omogeneità, in particolare si formano zolle lipidiche o microdomini sia sul monostrato esterno che interno, ricche di colesterolo e fosfolipidi con code lunghe e sature.

Quindi sono zone di bassa fluidità e spesse, svolgono ruolo importante nei processi di trasduzione del segnale, risposta della cellula a stimolo esterno attraverso recettori che instaurano una cascata di segnale, quindi è un modo per mantenere in punti determinati della cellula proteine che servono in determinati momenti.

I lipidi non sono distribuiti in maniera uniforme tra i due monostrati. Questa asimmetria si instaura al momento della biogenesi delle membrane a livello del reticolo e viene mantenuta perché per passare da un foglietto all’altro occorrono le flippasi.

Proteine

Proteine: in un mare di lipidi sono immerse un mosaico di proteine diverse che svolgono funzioni diverse. La presenza delle proteine può essere vista con la tecnica della criofrattura: a determinate temperature le membrane si dividono in due strati e posso vedere cosa c’è tra i due monostrati.

Le proteine possono essere classificate in base alla loro distribuzione in due classi:

• Integrali: sono immerse nei lipidi, possono essere immerse solo in un monostrato, monotopiche, oppure possono essere proteine integrali transmembrana, perché attraversano entrambi i monostrati e possono attraversarla solo una volta, monopasso, oppure più volte, quindi avere diversi domini transmembrana. Oppure esistono proteine multimeriche che per poter funzionare devono associarsi ad altre proteine.
• Periferiche: non sono immerse nel doppio strato; possono interagire con altre proteine integrali senza prendere rapporto con i lipidi, oppure possono essere ancorate a una componente lipidica e l’aggancio con un lipide permette alla proteina di rimanere sulla superficie.

Le proteine integrali transmembrana, quando sono immerse nel doppio strato idrofobico, per quel tratto devono assumere una conformazione tale in cui gli amminoacidi che hanno carica laterale idrofobica siano disposti verso le code idrofobiche dei lipidi, mentre gli amminoacidi rivolti verso la parte interna possono essere anche amminoacidi carichi a seconda di quello con cui dovranno interagire.

Si parla di asimmetria nella distribuzione delle proteine: le proteine hanno una regione iniziale amminoterminale e terminano con una regione carbossiterminale.

Le proteine possono essere disposte in maniera diversa rispetto all’ambiente citosolico o all’ambiente extracellulare: una proteina può avere una distribuzione diversa tra l’esterno e l’interno di gruppi funzionali.

Un’ulteriore asimmetria è determinata da proteine presenti solo in uno dei due monostrati. Non c’è distribuzione omogenea di proteina tra i due monostrati, ma anche le proteine integrali che attraversano la membrana espongono gruppi diversi nei due strati, determinando un’asimmetria.

Posso usare un anticorpo che riconosce proteine di superficie della cellula del topo, rosso, e uno che riconosce proteine presenti sulla superficie della cellula dell’uomo, verde.

Produco una cellula ibrida tra cellula di topo e uomo e inizialmente ho una metà rossa e una verde, ma dopo una quarantina di minuti la distinzione netta è sparita e le due proteine rosse e verdi si sono mescolate, perché il doppio strato è fluido e consente alle proteine di muoversi.

Non tutte le proteine si devono muovere, alcune per poter funzionare devono rimanere in precisi punti della membrana.

Posso ancorare le proteine di membrana a delle strutture citoscheletriche, citoscheletro sono proteine filamentose presenti nel citoplasma delle cellule eucariotiche, oppure ancoro le proteine a delle proteine della matrice extracellulare, oppure le ancoro a proteine di superficie di cellule adiacenti, oppure utilizzo giunzioni, cioè dei paletti, che creano una polarizzazione della cellula perché la parte apicale è diversa dalla parte basale dal punto di vista funzionale, perché ci sono proteine diverse che svolgono funzioni diverse.

Carboidrati

Carboidrati: gli zuccheri si trovano all’esterno della cellula associati alle proteine o ai lipidi.

L’insieme di tutti gli zuccheri che ricoprono la membrana plasmatica prende il nome di glicocalice, insieme dei carboidrati che rivestono le membrane cellulari e iniziano ad essere associati o alle proteine o ai lipidi nel reticolo e questo processo di aggiunta degli zuccheri si completa con la glicosilazione.

Esistono diversi tipi di zuccheri: galattosio, mannosio e glucosio, che formano il core glucidico.

La funzione del glicocalice è di permettere le interazioni cellula-cellula e cellula-substrato, è una protezione meccanica, è una barriera, serve per la comunicazione e il riconoscimento cellulare.

Al di sotto del doppio strato è presente un’impalcatura che si chiama cortex, fatta da proteine di spettina, che formano dei filamenti e sono ancorate al monostrato citosolico attraverso proteine transmembrana, questo cortex si vede bene a livello delle membrane interne degli eritrociti.

Funzione della membrana cellulare

• Barriera di impermeabilità, non tutti i soluti possono attraversare la membrana perché la composizione all’esterno della cellula non è uguale a quella interna al citoplasma, tuttavia è necessario un continuo scambio con l’esterno e in più nella cellula eucariotica questa necessità si presenta anche all’interno della cellula a livello delle membrane degli organuli.
• Organizzazione e compartimentalizzazione delle funzioni citoplasmatiche perché crea i compartimenti chiusi, organuli.
• Processo di trasporto.
• Rilevamento del segnale, recettori che determinano l’insorgenza di processi di trasduzione del segnale.
• Comunicazione cellula-cellula attraverso ponti di proteine.

Trasporto di membrana

A seconda della molecola che deve essere trasportata esistono diversi tipi di trasporto. Il trasporto si divide in:

• Trasporto passivo: non richiede energia, perché è spontaneo e le molecole si spostano seguendo un gradiente di concentrazione, passando da regioni in cui il soluto è più concentrato verso regioni dove il soluto è più concentrato. Poiché la direzione è data dal gradiente di concentrazione si tratta di un trasporto non direzionale.
• Trasporto attivo: richiede energia ed è direzionale, perché non avviene secondo gradiente di concentrazione, dunque è coinvolta una proteina che funziona in una sola direzione.

I tipi di trasporto sono stati studiati a partire dalla membrana degli eritrociti, perché a livello di questa membrana avvengono tutti i tipi di trasporto.

Trasporto passivo

• Diffusione semplice: riguarda il passaggio di piccole molecole apolari come CO2 e O2, che possono passare attraverso gli spazi presenti tra i fosfolipidi delle membrane. È richiesto solo un gradiente di concentrazione, perciò avviene fino a quando si raggiunge l’equilibrio.
• Osmosi: rientra nella diffusione semplice ed è il movimento passivo di acqua attraverso le membrane cellulari. L’acqua è una molecola apolare che riesce a passare liberamente all’interno del doppio strato fosfolipidico. Si verifica quando la membrana è impermeabile al soluto, perciò non può verificarsi una diffusione semplice del soluto, dunque è necessario che sia l’acqua a spostarsi. L’acqua va dove il soluto è più concentrato. Le condizioni fisiologiche si hanno quando la cellula si trova in una soluzione isotonica e in queste condizioni la quantità di acqua che entra è uguale a quella che esce.
• Diffusione facilitata: movimento di molecole secondo gradiente di concentrazione, non richiede energia, ma le molecole sono troppo grosse per passare attraverso i lipidi per cui il loro trasporto è facilitato da alcune proteine transmembrana. Esistono due tipi diversi di diffusione facilitata: mediata da proteine carrier o mediata da proteine canale. La differenza è che nelle proteine carrier è il soluto, molecola che deve essere trasportata, a indurre il cambiamento conformazionale, mentre nel caso delle proteine canale sono fattori esterni. Le proteine carrier sono proteine transmembrana che oscillano tra una conformazione aperta verso il citosol e una aperta verso l’esterno. Le proteine canale oscillano tra una conformazione aperta e una chiusa.

Esempio di diffusione facilitata mediante proteine carrier

Trasportatore del glucosio.

Il trasportatore del glucosio oscilla tra due conformazioni T1 e T2. Quando arriva il glucosio questo si lega interagendo con catene laterali che sono esposte nel lume del canale e induce un cambiamento di conformazione, per cui si viene a trovare il sito del legame per il glucosio esposto verso il citosol e il glucosio viene rilasciato.

A questo punto la proteina torna nella sua conformazione originale. Questi trasportatori sono specifici per una molecola o per classi di molecole.

I trasportatori del glucosio prendono il nome di GLUT. Esistono GLUT diversi a seconda del tessuto che si prende in considerazione, però tutti appartengono alla solita famiglia, cioè hanno una alta omologia di sequenza amminoacidica: non sono identici da un punto di vista amminoacidico, quindi la sequenza di amminoacidi non è identica, ma l’omologia di sequenza, cioè il numero di amminoacidi identici, è tale da poterli classificare all’interno della stessa famiglia proteica.

Normalmente il gradiente di concentrazione del glucosio spinge il glucosio a entrare nelle cellule dove è presente un enzima, chinasi, che aggiunge un fosfato al glucosio trasformandolo in glucosio 6 fosfato, che la cellula non riconosce come glucosio, per cui c’è sempre un gradiente di concentrazione che porta all’interno della cellula il glucosio.

L’unico caso in cui non ho questa chinasi è all’interno dell’intestino, dove il glucosio entra con un trasporto attivo di sodio.

Un caso particolare è quello che avviene nelle cellule muscolari e adipose, perché in condizioni normali in questo caso la GLUT non è esposta sulla superficie della cellula, ma all’interno del citoplasma sulla superficie di vescicole.

Quando ho un glucosio da internare l’insulina viene rilasciata nel sangue e si lega a dei recettori presenti sulla membrana della cellula muscolare determinando una trasduzione del segnale alla quale la cellula risponde con una esocitosi regolata.

Le vescicole si avvicinano alla membrana e si fondono con questa grazie alla sua fluidità, per cui il recettore viene esposto sulla superficie della cellula e funziona come un GLUT normale. Quando l’insulina non è più prodotta perché la glicemia è calata il recettore viene portato nuovamente dentro le vescicole.

Proteine canale

Porine: si trovano nella membrana esterna dei Gram meno e negli eucarioti a livello della membrana esterna nucleare. Sono delle proteine transmembrana che non hanno grossa selettività. Solo le molecole troppo grosse non riescono ad attraversarle.

Acquaporine: proteine transmembrana che si trovano nei tubuli prossimali a livello del rene e servono per far passare grosse quantità di acqua sempre nella direzione dell’osmosi ma molto più rapidamente.

Questi canali non fanno passare gli ioni per un problema di repulsione elettrostatica, mentre altre molecole vengono escluse sulla base delle dimensioni, dunque sono altamente selettive. Questi canali oscillano tra una conformazione aperta e una chiusa e l’apertura dipende da fattori esterni.

Canali ionici: uno ione si sposta attraverso le membrane seguendo il potenziale elettrochimico che è dato dal gradiente di concentrazione e dalla carica dello ione. Nella diffusione facilitata che vede coinvolte proteine canale specifiche per lo ione il movimento è determinato dal potenziale elettrochimico.

L’apertura del canale può essere dovuta al gradiente, a ligandi esterni, a legami intracellulari o a stimoli meccanici mediante interazione con il citoscheletro. I canali ionici sono selettivi per i vari ioni.

Sono proteine transmembrana che assumono una conformazione tale per cui all’interno del canale sporgono delle catene laterali in grado di interagire con un determinato ione e questi gruppi che prendono contatto con gli ioni sono in grado di stabilizzare lo ione nella sua forma adrica, non idratato dalle molecole di acqua.

Trasporto attivo

L’energia è data dall’idrolisi di una molecola di ATP che si scinde in ADP e fosfato, per cui accade la fosforilazione delle proteine coinvolte nel trasporto attivo, che prendono il nome di pompe, ed è l’idrolisi di ATP che induce un cambiamento di conformazione.

Esistono tanti tipi di pompe che prendono il nome di ATPasi di trasporto perché scindono ATP per poter funzionare.

ATPasi di tipo P: pompa sodio-potassio, pompe protoniche, pompa calcio.

Pompa NA+/K+

È formata da subunità alfa e beta, a cui è associata una componente glucidica. Alla subunità alfa è legato il sito di legame di ATP. Oscilla tra una conformazione