Biologia parte 2

Unità di replicazione o repliconi

Repliconi: le origini di replicazione tendono ad essere attivate a gruppi, chiamate. Ogni replicone contiene circa 20-80 origini di replicazione. In ogni replicone, le forcelle di replicazione procedono in senso opposto l'una all'altra, così non si incontrano.

Le regioni di un cromosoma si duplicano in diversi momenti del ciclo cellulare (fase S): l'eucromatina si replica per prima, mentre l'eterocromatina si replica tardi, perché più condensata e inaccessibile.

Nucleosomi

Mentre il DNA viene duplicato, come si staccano gli istoni? Dove vanno?

L'ottamero istonico non si disfa, resta compatto e una parte sta attaccata al filamento stampo e un'altra parte si ancora al filamento di nuova sintesi. Si ricompongono subito dopo il passaggio della forcella di replicazione.

Inoltre la replicazione del DNA necessita di nuovi istoni: è necessaria una grande quantità per produrre dei nuovi nucleosomi e vengono sintetizzati soprattutto durante la fase S del ciclo cellulare, coordinati con la replicazione cellulare. L'assemblaggio dei nuovi nucleosomi avviene subito dopo il passaggio della forcella perché il DNA non può stare tanto a lungo srotolato, occupa spazio e non ci sta nel nucleo.

1. DNA elicasi srotola la doppia elica, preceduta dalle proteine SSB.
2. Formazione della forcella di duplicazione e bolla.
3. Sequenze di RNA primer fanno da innesco per dare inizio all'azione della DNA polimerasi.
4. DNA polimerasi sintetizza un nuovo filamento da 5' a 3', partendo da un'estremità 3'.
5. Sintetizza anche un nuovo filamento a scatti (filamento in ritardo), formato dai frammenti di Okazaki.
6. Vengono tolti i primer ai frammenti, rimangono dei gap (buchi), riempiti da una DNA polimerasi I.
7. I pezzi “nick” sono poi saldati assieme da una DNA ligasi.

Meccanismi di riparazione del DNA

Una mutazione genetica può essere dovuta a:

• Errori che si verificano durante la replicazione.
• Agenti chimici / fisici.

→ Provocano alterazioni dell'informazione genetica, modificazione dei nucleotidi o rotture del DNA, nonché cambiamenti permanenti che alterano la struttura del DNA.

Le mutazioni genetiche sono la fonte di variabilità del DNA, sono un elemento fondamentale per l'evoluzione.

Possono essere spontanee oppure causate da agenti fisici, chimici e biologici (mutazioni indotte). Alcune mutazioni possono essere patogene: possono essere la causa diretta di un'anomalia fenotipica o possono aumentare la probabilità di insorgenza di certe malattie. Qualunque elemento presente nell'ambiente che aumenti in maniera significativa il tasso di mutazione al di sopra di quello spontaneo viene detto mutageno, possono essere di tipo fisico (radiazioni ionizzanti, raggi UV) e chimico (analoghi di basi, agenti idrossilanti/alchilanti/intercalanti).

I raggi X provocano rotture al doppio filamento di DNA (perdita di frammenti di DNA), i raggi UV determinano il legame covalente tra due pirimidine adiacenti dello stesso filamento, al posto del legame a idrogeno con l'altra base complementare.

Espressione fenotipica alterata da

• Prodotto che non funziona.
• Prodotto che funziona parzialmente.
• Assenza del prodotto (viene impedita la trascrizione di un gene o l'RNA viene degradato prima della trascrizione).

La maggior parte dei danni al DNA sono temporanei, perché vengono corretti da meccanismi di riparazione.

La fonte maggiore di danni spontanei è la duplicazione del DNA, in quanto può capitare che venga inserito un nucleotide sbagliato, causando un errore di accoppiamento tra le basi detto “mismatch”, che se non viene riparato prima della duplicazione del DNA viene trasformato in mutazione, le basi sbagliate possono essere eliminate o sostituite con altri nucleotidi.

→ DNA polimerasi: esistono vari tipi di polimerasi che hanno due attività catalitiche: attività polimerasica (aggiunta di nucleotidi da 5' → 3') e attività esonucleasica (rimozione dei nucleotidi per la loro correzione, va da 3' → 5').

Proofreading: la DNA polimerasi corregge il mismatch. Nonostante questa attività, la DNA polimerasi può non correggere correttamente alcuni errori.

Meccanismi di riparazione

I diversi tipi di danni devono essere rimossi in modo molto efficiente dai sistemi enzimatici di riparazione. Alcuni sistemi riconoscono le distorsioni dell'elica, altri localizzano il singolo nucleotide errato. Le vie di riparazione sono numerose e ridondanti: la stessa alterazione può essere riparata da sistemi diversi che agiscono in modo coordinato.

Metodi principali

1. Revisione diretta della modificazione chimica responsabile del danno al DNA, riparazione diretta all'errore.
2. Rimozione del DNA danneggiato seguita dalla sostituzione con DNA di nuova sintesi (rimozione di un tratto di DNA dove è presente l'errore).

→ Fotoriattivazione: la riparazione dei danni provocati dai raggi UV è effettuata dall'enzima fotoliasi, che assorbe fotoni dalla luce e li usa come energia per rompere i legami covalenti tra due dimeri di timina, così si legheranno all'adenina con legami a idrogeno. Azione diretta sull'errore.

→ Riparazione dei danni da alchilazione: gli agenti alchilanti possono interagire con il DNA e aggiungere gruppi alchilici a livello delle basi azotate. Le metiltransferasi sono degli enzimi in grado di rimuovere questi danni.

Passaggi comuni per la riparazione di alterazioni chimiche del DNA

1. Escissione: l'alterazione viene riconosciuta da un complesso enzimatico. Le endonucleasi rimuovono la porzione alterata del filamento, resta un gap.
2. Risintesi: la DNA polimerasi riempie il gap utilizzando come stampo la copia corretta del filamento complementare.
3. Legatura: la DNA ligasi sigilla il nuovo filamento e salda l'interruzione.

Escissioni

Le alterazioni ai nucleotidi sono riparate da diversi meccanismi di escissione e riparo, in base al tipo di danno.

Riparazione per escissione di basi (BER): meccanismo per la rimozione di basi modificate (es. deaminazione).

Intervengono una serie di enzimi DNA glicosilasi, in grado di riconoscere un tipo di base alterata e la rimuove rompendo il legame con lo zucchero pentoso. Lo zucchero senza base viene riconosciuto e rimosso da particolari enzimi, le apendonucleasi e fosfodiesterasi. Il gap viene ripristinato mediante una nuova sintesi e legatura da parte di DNA polimerasi e ligasi.

Riparazione per escissione di nucleotidi (NER): è un meccanismo molto versatile e importante: rimuove danni che determinano grossi cambiamenti nella doppia elica (es. dimeri di timina, legami covalenti tra le due basi).

Un complesso multi-enzimatico scannerizza il DNA e cerca anomalie e distorsioni nella doppia elica. Dove trova delle distorsioni effettua un taglio a monte e a valle del filamento danneggiato, ad opera di specifiche nucleasi. Il frammento è svolto dalla doppia elica mediante DNA elicasi, il gap viene ripristinato mediante la nuova sintesi del filamento, con successiva saldatura.

Riparazione dell'appaiamento errato (mismatch repair MMR)

Meccanismo di riparazione del DNA che corregge basi appaiate erroneamente e poi sfuggite alla correzione.

Il sistema mismatch repair riconosce la distorsione presente all’esterno dell’elica quando ci sono due nucleotidi non correttamente appaiati (riparazione per escissione). Ma come fa questo sistema a riconoscere il nucleotide “sbagliato” nel filamento?

• Dam metilasi metila i residui di adenina nella sequenza GATC.
• La metilazione avviene dopo la replicazione del DNA, quindi solo il filamento stampo è metilato.
• La metilasi aiuta a riconoscere la sequenza metilata.

Riparazione delle rotture a doppio filamento (DSB)

Le rotture DSB sono provocate da radiazioni ionizzanti, agenti ossidanti, errori di replicazione e altri prodotti metabolici della cellula. Le rotture a doppio filamento sono riparate mediante due diversi meccanismi.

1. Riparazione mediante ricombinazione omologa: dopo la replicazione si rompe un filamento, le due estremità della rottura vengono accorciate e utilizzo il cromatidio fratello per sintetizzare la sequenza omologa, il danno viene riparato accuratamente.
2. Riparazione mediante unione delle estremità non omologhe: rottura del doppio filamento riconosciuta dalle nucleasi, vengono degradate le estremità non appaiate e vengono uniti i filamenti, ma con la perdita di un tratto di DNA. La perdita può essere innocua (se vengono eliminate basi di poca importanza) ma potrebbe anche provocare dei danni. La cellula sceglie di riparare un grosso danno commettendone uno piccolo e meno grave rispetto alla mancata riparazione del danno.

Mutazioni somatiche: non vengono trasmesse alla progenie.

Mutazioni germinali: vengono trasmesse alla progenie attraverso i gameti.

Nella specie umana il tasso medio di mutazione per nucleotide per generazione è circa 18/miliardo, con ampia variazione tra geni. Tale variazione è dovuta al fatto che la probabilità di mutazione spontanea dipende dalla composizione nucleotidica del segmento di sequenza considerata. Esistono segmenti più mutabili di altri (“hot spots”).

Mutazioni puntiformi

Mutazioni puntiformi: variazione di una singola unità nucleotidica all'interno del genoma (codificante e non).

Tipi di mutazioni

• Sostituzione di basi.
• Inserzione.
• Delezione.

Le mutazioni geniche sono variazioni della sequenza nucleotidica e si dividono in mutazioni per sostituzione di base o per inserzione/duplicazione/delezione dette anche mutazioni frameshift. Tali mutazioni provocano un'errata lettura del messaggio durante la traduzione, a partire dal punto della mutazione in poi. Il cambiamento può riguardare una o poche basi; nel primo caso si parla, più propriamente, di mutazioni puntiformi.

Le mutazioni possono colpire varie zone del DNA, se colpiscono zone non codificanti allora non ci sono conseguenze, ma possono insorgere dei problemi se avvengono:

• Nel promotore.
• Nelle regioni 5' UTR e 3' UTR, che regolano l'espressione genica.
• Sequenze di consenso o ramificazione dello splicing.
• Sequenze introniche con attivo di un sito criptico di splicing.

Inserzione: il filamento di nuova sintesi presenta una protrusione/forcina e viene aggiunta una base in più.

Delezione: il filamento stampo presenta una protrusione/forcina, la base non viene letta quindi non viene aggiunta la base complementare.

Mutazioni puntiformi

• 59% missense, nonsense.
• 9,9% mutazione siti di splicing.
• 17% piccole delezioni.
• 6% piccole inserzioni.

In TOT sono il 93% delle mutazioni.

Mutazione puntiforme

Una mutazione puntiforme è una variazione di sequenza del DNA che interessa uno o pochi nucleotidi.

Molte mutazioni puntiformi sono probabilmente senza effetto, in tal caso si dice che sono neutre, infatti gran parte del DNA in un genoma eucariotico non codifica prodotti proteici.

Sostituzione di basi

Le mutazioni per sostituzione di basi determinano lo scambio di un nucleotide con un altro. Sono definite transizioni qualora vi sia uno scambio di una purina con altra purina (A > G) o di una pirimidina con un'altra pirimidina (C > T); si dicono invece transversioni quando lo scambio è di una purina con una pirimidina o viceversa (C/T > A/G). In genere le transizioni sono più frequenti delle transversioni.

Le mutazioni puntiformi possono essere di sei tipologie: silenti, missenso, delezioni o inserzioni in frame, inserzioni nonsenso, mutazioni frame-shift o mutazioni di splicing.

• Le mutazioni silenti o sinonime si verificano quando la sostituzione di una base azotata in una sequenza di DNA non determina variazione della sequenza amminoacidica della proteina interessata, a causa della ridondanza del nostro codice genetico che è degenerato (gli stessi aminoacidi possono essere codificati da più triplette). Le mutazioni silenti sono in prevalenza neutre poiché l'amminoacido non cambia e di conseguenza non cambia neppure la funzionalità della proteina codificata all'interno della quale si trova la tripletta mutata.
• Le mutazioni missenso si verificano quando all'interno di una sequenza di DNA viene sostituita una base azotata in modo tale che la sequenza amminoacidica sia modificata. Questo tipo di mutazioni può essere neutra e non determinare nessun fenotipo specifico rappresentando semplicemente un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP) o una variante privata, ma può anche dare origine a patologie gravi come l'anemia falciforme. Spesso anche una singola mutazione in una regione altamente conservata di una proteina le fa perdere funzionalità.
• Le mutazioni nonsenso si verificano quando una mutazione ad un nucleotide di una tripletta determina la trasformazione di un codone codificante un amminoacido in un codone di stop. La conseguenza è la proteina codificata non viene esportata oppure, se codificata, è tronca, poiché la traduzione si conclude al codone di stop ignorandone le triplette a valle. La conseguenza di questa mutazione è una proteina tronca non funzionale o nociva.
• Le delezioni in frame e le inserzioni in frame determinano rispettivamente l'eliminazione di una tripletta o di un numero di nucleotidi divisibili per 3 oppure l'inserzione di una tripletta o di un numero di nucleotidi divisibili per 3. Sono "in frame" poiché non spostano la cornice di lettura a livello ribosomiale. Questo tipo di mutazioni determinano l'eliminazione o l'aggiunta di amminoacidi nella proteina codificata a partire dall'mRNA maturo che le contiene. Le conseguenze di queste mutazioni sono molto varie.
• Le mutazioni frame-shift sono dovute a delezione o inserzioni di un numero di nucleotidi non divisibile per 3, questo comporta lo spostamento della cornice di lettura a valle della mutazione e quindi la codificazione di una sequenza amminoacidica non corrispondente a quella del trascritto originario. La conseguenza è la produzione di proteine anomale che hanno solo porzioni di sequenza corrispondenti all'originaria o la mancata esportazione o traduzione dell'mRNA mutato.

Mutazioni in regioni regolatrici della trascrizione

Le mutazioni non hanno un grande effetto nelle zone non codificanti, a meno che non colpiscano zone particolari come regioni splicing (rimozione di introni) o zone per la regolazione della trascrizione. Ciò può determinare conseguenze molto variabili che vanno da nessun effetto fenotipico a cambiamenti dell'espressione genica che danno origine a gravi patologie.

In conclusione, a causa dei processi di mutazione dovuti sia a cause intrinseche alle proprietà del DNA o dei cromosomi, sia a cause estrinseche (effetto mutageno di agenti fisici o chimici), le sequenze del DNA genomico vengono parzialmente modificate in ogni generazione. Dal punto di vista quantitativo, tali modificazioni sono quasi insignificanti rispetto al totale del DNA genomico (oltre 3.000 Mb), ma può bastare la modificazione di un singolo nucleotide per alterare significativamente la funzione di un gene.

I geni

I geni: regione di DNA trascritta in una sequenza complementare di RNA (mRNA, tRNA, rRNA ecc.).

Il numero di geni presenti negli organismi viventi non ha una diretta relazione con la complessità dell'organismo, e varia in ogni specie vivente.

→ Le cellule procariote non contengono sequenze non codificanti.

→ Le cellule eucariote contengono molte sequenze non codificanti (introni) e qualche breve zona codificante (esoni).

Il trascritto primario di RNA viene modificato per rimuovere le sequenze introniche con un processo di splicing: rimozione degli introni e unione degli esoni.

→ RNA primario → splicing → RNA maturo.

Ciascun gene è associato ad una regione regolatoria: portano l'informazione di quanto il gene deve essere tradotto e con quale velocità e in che momento (fase fetale, risposta ad un segnale..). L'efficienza della trascrizione è regolata da queste particolari sequenze che controllano che avvenga al momento giusto e nel giusto tipo di cellula.

Alcune zone del gene sono chiamate “promotore”, sono sequenze regolatrici che legano con specifiche proteine non istoniche (fattori di trascrizione), che favoriscono o bloccano la trascrizione del gene.

Quantità di DNA nel genoma

Gli organismi eucarioti possiedono più DNA dei procarioti.

Solo una piccola parte del DNA eucariota è codificante, il 20-50% è composto da sequenze ripetute (DNA ripetitivo), presenti ad esempio nei telomeri e centromeri.

→ Codificante: geni per proteine e ribosomi.

→ DNA ripetuto e DNA a sequenza singola.

• Geni 57 kb.
• Introni 6 kb.
• Esoni 280 pb.
• Numero medio di esoni 11.
• Dimensione media mRNA 3 kb.
• Dimensione media proteine 540 aa.

Codificano la maggior parte per: enzimi, trasduzione del segnale, legame con gli acidi nucleici, molecole di adesione e trasporto.

Alcuni geni sono presenti in coppie multiple, identiche o variabili, e possono essere raggruppati o dispersi nel genoma in:

• Gruppi ripetuti identici (istoni).
• Gruppi ripetuti variabili (famiglia genica).

I singoli geni di una famiglia genica codificano per proteine diverse, ma con funzione correlata tra loro.

1. DNA a sequenza unica: geni codificanti per mRNA, presenti in singola copia.
2. DNA mediamente ripetitivo: geni codificanti per rRNA e tRNA. È una classe molto eterogenea, può essere ripetuta 10 volte o anche 100.000 volte.

È distribuito lungo tutta la lunghezza dei cromosomi e in genere alternato con sequenze uniche. La maggior parte del DNA mediamente ripetuto viene trascritta, ma non tradotta: codifica per rRNA e tRNA.

Una piccola parte viene trascritta in mRNA e tradotta in proteine: geni codificanti per gli istoni. La funzione del DNA mediamente ripetuto: