Biologia molecolare e cellulare delle piante - primo semestre

27/09/2017

Piante e strutture cellulari

Piante: non hanno un sistema nervoso, non hanno un sistema motorio; se c’è qualche motivo di distress la pianta non può muoversi.

Tutte le condizioni climatiche (dei promotori si attivano quando c’è caldo per la fioritura e per fare il frutto) influenzano le piante che sono fatte di cellule e al cui interno sono presenti strutture come: plasmalemma, DNA organizzato in cromosomi, uno o più nucleoli, organelli citoplasmatici come mitocondri, apparato del Golgi, RE, ribosomi.

Come caratteristiche distintive si ha: parete, plastidi, vacuolo e plasmodesmi. Ovviamente poi avrà tutte le strutture tipiche delle cellule.

Struttura del lipide tipico delle membrane: colina, fosfato e poi il glicerolo; il glicerolo è quello che, se utilizzo un biodiesel, impasta il motore; infatti per il biodiesel si fa transesterificazione per staccare il glicerolo.

Struttura della pianta

Pianta (cormo) fatta da fusto, radici e foglie: apparato traspirante (foglie), le foglie hanno gli stomi per far entrare CO2 ma contemporaneamente ho perdita di acqua quindi deve fare attenzione alla perdita di acqua; apparato assorbente (radici) e apparato di connessione (fusto). Qualsiasi cosa della pianta deriva da questi tre.

Se noi vogliamo indurre una morfogenesi, quindi prendere un pezzo di foglia e da questa rigenerare un altro individuo devo sapere quale tessuto devo prendere: se prendo il legno che è tessuto morto non genero niente, tessuto cribroso è privo di nucleo, il tessuto meccanico ha il nucleo ma ha una parete molto spessa.

Nella foglia si ha tessuto parenchimatico con funzione fotosintetica in mezzo a due strati di epidermide quindi prenderò questo parenchima: parenchima lacunoso, parenchima a palizzata.

Quindi se voglio isolare cellule prenderò cellule dal lacunoso perché le cellule sono più staccate tra loro e vengono prese in maniera migliore. Ma la cellula per questo fenomeno si stressa quindi devo stressare la pianta il meno possibile sennò le cellule che recupero sono poco vitali.

La radice ha un’epidermide tutta sua, il rizoderma che aumenta l’assorbimento. Dalla radice e dal fusto prenderò le cellule parenchimatiche del midollo (radice) o della corteccia (fusto).

Ma le meno differenziate sono le meristematiche, perché non si prendono quelle? Si può fare ma le cellule meristematiche sono molto piccole, dell’ordine del 200 micron; quindi serve una strumentazione particolare.

Quali cellule si prendono per formare i protoplasti? Tessuti meno differenziati e più facilmente recuperabili.

(Immagini ottenute per freezing-fracture al microscopio a scansione)

Io isolo le cellule ma poi posso farle diventare ciò che voglio; questo avviene spontaneamente in un organismo che cresce o indotto in vitro.

Differenziamento cellulare

Cosa determina il differenziamento di una cellula?

• Il corredo genetico e il suo epigenoma (ciò che è espresso).
• Da fattori esogeni, fattori esterni, quindi l’ambiente influenza l’epigenetica, quindi consente a determinati geni di attivarsi o meno (luce, temperatura, parassiti che attivano meccanismi di difesa, competizione con gli organismi vicini).
• Fattori endogeni (ormoni vegetali determineranno in maniera molto precisa il destino di una cellula, alcuni determinano il differenziamento verso la radice o verso il fusto ecc.; nutrienti che servono alla pianta per non finire in carenza o stress, quindi serve un dosaggio particolare).

Quello che vale per una singola cellula vale anche per tutte le cellule dello stesso tessuto. La regolazione è estremamente fine anche all’interno di uno stesso tessuto anche se non si conosce esattamente come funziona la regolazione dell’espressione all’interno di un tessuto.

Se si prende un organo e si vanno a studiare i geni (1791) avrò geni che avranno andamento simile (espressione o repressione).

Gli ormoni

Sono fattori che intervengono nella regolazione di un organo, nel suo differenziamento, allungamento, formazione di un pathway, determinazione del sesso, organogenesi, risposte allo stress biotico e abiotico ecc.

Vengono indicati come fitoormoni nelle piante.

I vecchi ormoni sono auxina, citochinine, gibberelline, acido abscissico ed etilene.

I nuovi ormoni sono brassinosteroidi, acido salicilico, strigolattoni e altro.

Questi regolano ogni step del differenziamento, della crescita, del micromovimento della pianta.

Il seme non deve germinare quando vuole lui ma deve avvenire nella stagione più favorevole; un seme che sarà prodotto in tarda estate avrà dei sistemi di blocco della germinazione per non formare la pianta in inverno in cui c’è poca luce e di conseguenza poca fotosintesi e quindi poca energia. Quindi regolano la dormienza.

Gli ormoni intervengono nella germinazione ad esempio nella produzione della birra.

La germinazione dei semi si ha un fusticino in alto con una fogliolina e sotto una radichetta e questo avviene in presenza di determinati ormoni.

La crescita e la ramificazione (branching): abete ha i rami in alto corti e rami in basso lunghi: dominanza apicale: in alto si avrà un ormone che inibisce la crescita dei rami, mano a mano che si scende si avranno meno concentrazione di ormoni e di conseguenza la crescita dei rami.

Intervengono anche per la fioritura: l’attivazione di geni e fattori di trascrizione vengono attivati da determinati ormoni.

Intervengono nella fecondazione e nella formazione di frutti: pomodori senza semi all’interno non sono stati fecondati quindi ad esempio sono stati cresciuti in serra perché non c’è stata fecondazione grazie alle api.

L’insetto che fa fecondazione attiva un pathway ormonale: gli agricoltori utilizzano questa strategia quindi forniscono solo ormoni e si creano frutti senza semi, gli ibridi come le clementine.

La maturazione del frutto è regolata da ormoni: il pomodoro appena raccolto dopo poco marcisce. Quindi bisogna intervenire per impedire che marciscano: sono state fatte modificazioni di silenziamento geni per evitarlo.

Funzionamento degli ormoni

Come funzionano gli ormoni? Vengono sintetizzati, per essere trasportati devono essere coniugati a qualcosa (in maniera che vengano inattivati e non si leghino al suo recettore in posti dove non deve agire), poi arrivato nel sito in cui deve funzionare deve essere deconiugato e successivamente ci sono dei recettori, il recettore attiva una cascata chinasica, si hanno fosforilazioni che attivano fattori di trascrizione che si legano al promotore di geni che devono essere attivati. Oppure può agire andando a regolare canali ionici o acquaporine in maniera che ci siano segnali di diversa natura.

La deconiugazione prevede la degradazione di qualcosa che si è attaccato all’ormone in maniera che si attivi l’ormone; questo viene fatto grazie all’ubiquitina (prodotta in ogni organo); un target che viene ubiquitinato viene attaccato dal proteasoma 26S che degrada l’ubiquitina.

Seme e germinazione

Il seme è un organo di durata, come si fa a creare un blocco metabolico e far sì che gli enzimi già presenti non degradino sostanze di riserva, che l’RNA venga tradotto? Disidratazione; un seme è quasi completamente disidratato, respira ma ha metabolismo molto molto rallentato.

Con l’idratazione del seme si attiva poi il pattern ormonale che porta prima allo sviluppo della radice perché il seme è la prima fase di crescita della pianta ma è una fase eterotrofa, è l’unica fase in cui la pianta non fa fotosintesi infatti germina al buio quindi utilizza le sostanze nel terreno. Più è grande il seme più sostanze di riserva ha. Quindi se si hanno semi piccoli non vanno messi troppo sotto il suolo perché se nel terreno non ci sono abbastanza sostanze di riserva muore.

Una volta che è germinato la radice si è allungata e assorbe acqua e sali minerali (N, P e K sono gli elementi più necessari per la pianta); ce n’è un po’ nel seme di queste sostanze ma se la radice diventa funzionale è meglio.

Perché si abbia l’allungamento della radice e nel fusticino bisogna che entri acqua e che questa riempia il vacuolo. L’ipocotile (il fusticino) ha due cotiledoni che non sono verdi, non fanno fotosintesi. Nei due cotiledoni si ha una gemma ed è da questa che si genera la pianta.

La crescita della pianta avviene sì per divisione ma anche per distensione. Il numero di cellule fra piante sono più o meno le stesse ma alcune sono più lunghe.

Tre knock out:

• Knock out delle GA.
• Knock out dell’auxina.
• Knock out dei brassinosteroidi.

In tutti i casi in mancanza di ormoni la pianta cresce poco.

Una pianta più piccola mi fa risparmiare perché le energie che derivano dai concimi vanno tutti per far produrre frutti non per far crescere la pianta in lunghezza. Si fa meno fatica anche per la raccolta e anche meno costi. Tutto questo se la taglia non va ad influire sulla capacità di formazione dei frutti quindi i mutanti possono essere utili.

Auxine

Sono diverse anche se la più studiata è l’acido indol-3-acetico.

Le auxine determinano l’allungamento del germoglio, stimolano la crescita delle radici, inibiscono la caduta delle foglie, promuovono la crescita dei frutti, determinano la dominanza apicale (abete).

La divisione e la crescita delle piante: le piante non solo crescono per divisione cellulare ma possono anche allungarsi per distensione e la forma e l’allungamento della cellula dipende dalla deposizione delle microfibrille di cellulosa; questo è un modo per raggiungere dimensioni maggiori senza aumentare il numero di cellule ovviamente se fornisco acqua alle cellule.

Come hanno studiato che l’auxina fa crescere le piante? Immagine con due piastre: coleoptili di sx messi in acqua, coleoptili di dx messi in acqua con auxina: questi sono più lunghi perché l’auxina determina l’aumento per distensione.

L’auxina in presenza di buio fa crescere le piante per mandarle a cercare la luce.

Biosintesi dell’auxina

Le auxine derivano dal triptofano che è un amminoacido aromatico. Nelle piante gli amminoacidi aromatici vengono sintetizzati nel cloroplasto (differenza tra cellule animali e vegetali) perché è l’organulo dove avviene la fotosintesi quindi c’è energia per la sintesi.

Avviene con due modalità:

• Via triptofano dipendente.
• Via semi indipendente dal triptofano.

Queste vie portano alla formazione di IAA.

Gli amminoacidi aromatici vengono sintetizzati a partire dallo shikimato ed è su questa via di sintesi che agisce uno degli erbicidi più potenti.

L’IAA può entrare nel nucleo e andare ad attivare fattori di trascrizione. Ci sono diverse auxine più usate.

In laboratorio si usa l’acido α-fenilacetico (α-NAA).

Tutte queste vengono sintetizzate negli apici. Con la colorazione GUS si usa il promotore di un gene che regola però non il gene stesso ma un gene reporter che è questo GUS che in presenza di opportuni substrati dà questa colorazione blu; con questo sistema si può capire dove viene attivato un gene. Quindi all’apice, nella zona blu, si ha maggior attività e maggior sintesi dell’ormone stesso e da qui diffonde tramite i vasi conduttori.

Ho gene endogeno che lo modifico aggiungendo gene reporter GUS che dà colorazione blu dove viene espresso quindi vedo dove viene espresso il gene per produrre IAA.

Queste quattro auxina hanno carica positiva su anello aromatico e carica negativa su carbossile e la distanza tra le due cariche è sempre di 0.5 nanometri e questa distanza è indispensabile per il corretto appaiamento dei recettori.

L’auxina promuove la formazione di organi laterali, controlla la formazione del pathway di crescita, controlla il destino dell’apice della radice, risposta alla luce, risponde all’azione di un simbionte.

Gibberelline

Importantissime per le piante, vengono sintetizzate nell’embrione del seme durante la germinazione (utilizzate dai birrai per stimolare la germinazione del seme), negli apici del fusto e della radice, nei fiori, in particolare negli organi riproduttori e nei frutti in crescita.

Stimolano la crescita delle piante e l’espansione fogliare influendo sia sulla divisione che sulla distensione cellulare (mentre l’auxina stimola la distensione, queste stimolano anche la divisione cellulare).

Aumentano le dimensioni dei frutti (ad esempio quando non si ha fecondazione nelle serre).

Interrompono la dormienza dei semi inducendo la germinazione.

Sono state scoperte per caso, nel riso esisteva la malattia dovuta al fungo Gibberella. Questo fungo causa un’enorme allungamento degli internodi (parte di fusto divisa tra due foglie, la zona dove la foglia si inserisce sul fusto o un rametto laterale si chiama nodo) quindi l’allungamento dei fusti così tanto che le piante vengono chiamate piante stupide perché in cima c’è il riso quindi cresce tanto e poi si spezzano perché incapaci di sostenere sé stesse. Inoltre i maschi erano sterili.

L’allungamento è dovuto alla presenza di regolatori di crescita endogeni che sono le gibberelline.

Quindi se si riduce la quantità di gibberelline le piante sono più basse. Alcune piante trattate con un inibitore della sintesi delle gibberelline evitano di spezzarsi e piegarsi.

Le piante più piccole prodotte da Norman sono oltre che essere più basse anche più produttive quindi producono più frutti.

Ha creato mutanti difettivi della biosintesi delle gibberelline.

Biosintesi delle gibberelline

Nomi degli enzimi e dei geni va saputo, gli organuli coinvolti.

Interessa tre compartimenti cellulari: si parte dal proplastidio (forma embrionale del plastidio non ancora verde), poi si passa alle endomembrane e poi citoplasma.

Stadio 1 proplastidio (si hanno due enzimi lineari che servono entrambi): geranil-geranil difosfato → copalil difosfato sintasi → copalil difosfato → kaurene sintasi → ent-kaurene che entra nelle endomembrane (stadio 2, anche qui enzimi lineari) e subisce due ossidazioni → KO (kaurene ossidasi) → produce l’acido ent-kaurenoico a partire dall’entkaurene → acido kaurenoico ossidasi e poi si ha la formazione della prima gibberellina GA12 che diffonde nel citoplasma (stadio 3) dove si hanno enzimi diversi come idrolasi e ossidasi e si producono le altre gibberelline; le più attive sono la GA4 e la GA1. L’azione di questi enzimi in questo caso non è lineare.

Se si fa knock out su uno dei primi due enzimi si blocca la via biosintetica e non si produce nulla. Stessa cosa se si va ad agire sui geni delle endomembrane. Al contrario se si va a inibire l’idrolasi 12 o l’idrolasi 21 non avrò la GA12 o GA21 ma avrò le altre. I primi enzimi sono codificati da pochissimi geni, non da famiglie multigeniche quindi andare a bloccare e silenziare questi geni vuol dire arrivare alla perdita totale di quell’enzima.

Se si eliminano tutte le gibberelline che succede? Ne basta eliminarne una, quella che determina l’allungamento del fusto, oppure tutte?

Se agisco nel proplastidio o endomembrane si producono piante “severamente” nane e poi sono sterili. All’agricoltore a cosa servono? Nulla.

Mentre se si silenzia ad esempio la GA20 si hanno piante di poco più basse; il trucco sta nel capire qual è la gibberellina che ha quel compito lì, senza indurre sterilità. Però la GA20 può essere importante nel riso ma in Arabidopsis no e viceversa quindi bisogna vedere quali sono importanti per le piante. Burno ha fatto incroci e ha selezionato un mais che aveva una mutazione sul gene che portava alla sintesi di una gibberellina citoplasmatica, e queste piante erano identiche al w-t, semplicemente di taglia più bassa.

L’amido è contenuto nei vari cereali. All’interno l’α-amilasi è già presente ma ha bisogno della sintesi della gibberellina dall’embrione stesso che avviene grazie alla germinazione.

3-10-17

Citochinine: ormone

Gli ormoni sono i motori per la differenziazione cellule.

Vengono sintetizzati nelle radici, nei tessuti meristematici.

Hanno diverse funzioni: stimolano l’espansione fogliare (favoriscono la divisione cellulare), ritardano la senescenza della foglia, sono indispensabili per la germinazione dei semi, determinano lo sviluppo delle gemme.

Sono state scoperte grazie ad un incidente di laboratorio: un gruppo cercava molecole per aumentare la divisione cellulare (che ci permette di avere più colture cellulare e quindi più individui). Una molecola cascò in una coltura cellulare, la chinetina (citochinina sintetica) e le cellule proliferarono molto rispetto al controllo.

L’esperimento successivo fu prendere una foglia di tabacco e prenderne dei dischetti e li misero in mezzi crescenti di citochinine e auxine. Osservarono che mettendo solo auxine si sviluppavano radici, mettendo solo citochinine si sviluppavano germogli e mettendo entrambe si sviluppava il callo (ammasso informe di cellule indifferenziate che crescono in maniera indefinita).

Le auxine e le citochinine agiscono in maniera antagonista e il rapporto che c’è tra le due è importante per determinare il fato delle cellule e delle colture cellulari che le contengono.

Se si prende una foglia e si mette in vitro bisogna prima fare un processo di sterilizzazione perché sennò si avranno contaminazioni.

Le citochinine ritardano la senescenza fogliare che è un processo tipico della pianta; c’è tutto un processo di enzimi, geni, fattori di trascrizione che si attivano e si ha processo di senescenza e si nota perché la foglia da verde diventa gialla/rossa perché viene degradata la clorofilla e la colorazione è data dai pigmenti che rimangono (carotenoidi); se si spruzzano citochinine su queste foglie bloccano la senescenza fogliare. Questa cosa può essere fatta appunto come trattamento esogeno.

Le citochinine sono composti adenina-like, le più abbondanti sono la trans-zeatina e l’isopente