Biologia molecolare

Biologia molecolare

Biologia molecolare studia la natura dei fenomeni biologici a livello molecolare. Nasce nel 1953 con Watson e Crick.

Progetto genoma umano

• Sequenziare il DNA umano.
• Solo il 2% sono geni e le regioni codificanti sono ancora meno.
• L’espressione dei geni dipende anche dall’ambiente.

Medicina molecolare

Cerca cause genetiche/molecolari di varie patologie per sviluppare terapie mirate e personalizzate.

Genoma

Insieme delle informazioni genetiche che caratterizzano un organismo.

Trascrittoma

Insieme dei trascritti codificanti e non prodotti da una determinata popolazione cellulare.

Proteoma

Insieme delle proteine prodotte da una determinata popolazione cellulare.

Fenomeni epigenetici

Non cambiano la sequenza di DNA ma la sua capacità di esprimersi.

Clonaggio DNA

Clonare significa ottenere una popolazione di molecole identiche alla molecola di partenza.

DNA ricombinante

DNA da clonare + vettore (taglia con lo stesso enzima + DNA ligasi).

Vettori

• Plasmidi
• Virus
• Repliconi
• Cromosomi artificiali

Plasmidi

• Molecola circolare superavvolta.
• Usano l'apparato di duplicazione del DNA dell’ospite.
• Non entrano nel cromosoma batterico.
• Hanno origine di replicazione batterica (replicazione indipendente dalla cellula).
• Hanno marcatore di resistenza (per resistenza all’antibiotico).
• Sito multiplo di clonaggio (poli-linker): regione ingegnerizzata per inserire DNA da clonare.
• Ha siti di riconoscimento per molti enzimi di restrizione.
• Inseriscono a 12/15kb: a volte sono più grandi del vettore stesso.
• Limiti: può contenere poco DNA, la trasformazione non avviene in modo efficiente, le colonie possono crescere a bassa densità (inibizione da contatto).

Fago lambda

• Inietta il suo genoma all'interno del batterio.
• Lineare: braccio destro e braccio sinistro sono coesivi tra loro.
• DNA filler = necessario affinché il DNA sia abbastanza lungo per essere inglobato nel capside.
• Risolve il problema della trasformazione e dell'inibizione da contatto.

Cromosomi artificiali

Riproduce la struttura di un cromosoma batterico che può contenere fino a milioni di basi ma con le caratteristiche di un plasmide (BAC-YAC). Verrà duplicato ogni volta che la cellula dovrà dividersi (fase S).

Enzimi di restrizione (endonucleasi di tipo II)

• Tagliano sequenze palindromiche di 4-6-8 nucleotidi.
• Genera estremità complementari/coesive.
• Può fare taglio netto (blunt) o sfalsato.
• Le estremità possono unirsi a estremità di altri enzimi, non possono essere separate da nessuno dei due enzimi.
• La ligasi è più debole (manca legame tra basi complementari).
• Meccanismo di difesa da DNA estraneo: il cromosoma batterico non viene attaccato perché il suo DNA è stato metilato.

Tecnica: vettore plasmidico

• Isolare plasmide: dissolvo membrana batterica con detergente SDS.
• Sali fanno precipitare proteine (+ DNA genomico), poi RNAasi per eliminare RNA.
• Tagliare con lo stesso enzima di restrizione: DNA e vettore si appaiano per formare DNA ricombinante.
• Inserire DNA ricombinante in un sistema cellulare appropriato (batterio).
• Trasformazione: soluzione di cloruro di calcio crea micropori per far entrare plasmide nel batterio.
• Il batterio si replica e forma colonie.
• La resistenza all’antibiotico ci permetterà di selezionare i batteri che hanno preso il plasmide.

Tecnica: vettore fagico

• L'inserto si sostituisce al DNA filler nel genoma virale per creare DNA ricombinante (impacchettato dentro virus).
• I batteri in coltura liquida vengono infettati dai fagi.
• Il batterio trascrive il DNA virale e sintetizza proteine per la replicazione e per il capside.
• I batteri infetti verranno messi su piastra semi solida.
• L'infezione causerà la lisi dei batteri che rilasceranno i nuovi virus nell’ambiente.
• I virus rilasciati andranno a infettare i batteri adiacenti (placche di lisi).

Elettroforesi

• DNA tagliato con enzimi di restrizione creando frammenti (lo stacco dal vettore).
• DNA scorre attraverso lastra di gel sottoposta a campo elettrico.
• Spesso c’è soluzione tampone ricca di elettroliti che conducono corrente elettrica.
• I frammenti si divideranno in base al loro peso molecolare, lunghezza, forma.
• Una molecola superavvolta è più veloce di una lineare.
• Le bande saranno visibili grazie al marcatore che è illuminato con luce UV fluorescente (es: bromuro di etidio si intercala tra le molecole degli acidi nucleici).
• Dall’elettroforesi di un DNA ricombinante dovrei ottenere 2 bande (plasmide+inserto), altrimenti significa che il plasmide era vuoto.

Identificare un inserto sconosciuto: mappatura con enzimi di restrizione

• Taglio il plasmide con diversi enzimi per determinare la presenza/posizione di siti di restrizione.
• Ladder: marcatore di peso molecolare è un campione di DNA pre-preparato contenente frammenti di grandezza conosciuta usato come riferimento per determinare il peso molecolare dei frammenti che voglio analizzare.

Librerie genomiche

Collezione completa di frammenti di DNA che coprono l’intero genoma (esoni e introni) di una specie, ciascuno inserito singolarmente in un vettore di clonaggio.

• Processo con vettore plasmidico: purifico DNA + digerisco con enzima di restrizione + inserisco nel vettore + piastro.
• Dato che la formazione di cloni è casuale verrà piastrato circa il triplo del genoma.
• Ogni molecola è tagliata in modo casuale dagli enzimi.
• Per ricostruire la sequenza bisogna sovrapporre frammenti in modo da individuarne l’ordine.

• Processo con fago λ: taglio DNA con Sau3A poiché crea estremità complementari all’enzima BamH1 (taglia virus).
• Packaging in vitro del DNA ricombinante.
• Infezione di batteri piastrati.
• Per il DNA umano uso Sau3A (riconosce 4 basi) perché crea frammenti lunghi.
• Per il fago uso BamH1 perché taglia solo 1 volta e genera i due bracci (Sau3A lo farebbe a pezzi).

Librerie di cDNA

Collezione di cloni di tutte le specie di mRNA (copiate in cDNA), anche quelle più rare, espresse in un dato tessuto in una data condizione. Dai cloni possiamo derivare direttamente la proteina.

Possiamo capire quali geni sono espressi e studiare le sequenze amminoacidiche (mutazioni).

Processo

• Si scelgono cellule di un determinato tipo cellulare.
• Lisi cellule con un potente denaturante che rompa la membrana e denaturi le proteine (altrimenti le ribonucleasi degraderebbero l’RNA).
• Faccio precipitare RNA con soluzioni specifiche per poterlo estrarre.
• Separo mRNA dagli altri RNA: sottopongo RNA a sequenze ricche di Oligo-dT (timidina) così solo le code di poli-A degli mRNA si legheranno.
• In vitro retrotrascriviamo mRNA in cDNA tramite trascrittasi inversa purificata da retrovirus (Oligo-dT funge da primer per la trascrittasi inversa).
• Inizialmente ottengo molecola eteroduplex (RNA+DNA), RNAasi o NaOH degradano RNA.
• cDNA a singolo filamento si ripiega formando ansa al 3’ che fa da primer per sintesi del 2° filamento.
• Nucleasi elimina l’ansa si forma cDNA a doppio filamento.
• Creo DNA ricombinante: uso linkers che contengono siti per enzimi di restrizione (il cDNA non li ha).
• Inserisco DNA ricombinante in coltura batterica per clonarlo.
• Problema: la trascrittasi inversa dopo un tot. smette di funzionare abbiamo tanti 3’ e pochi 5’ (posso usare sequenze casuali di oligonucleotidi che se si appaiano fanno da primer).

Per uno stesso organismo posso avere molte librerie di cDNA ma solo una genomica.

Ibridazione acidi nucleici

Appaiamento di frammenti a singolo filamento provenienti da due fonti diverse (sonda e bersaglio), per determinare la presenza o la quantità di acidi nucleici con una sequenza specifica.

Complementari = se si appaiano in modo antiparallelo secondo la regola di Watson e Crick.

• Denaturazione: separazione dei due filamenti tramite la rottura dei legami H tramite soluzione alcalina (pH>13): stimola dissociazione P (diventano più neg.), temp. > 94-95°C, bassa forza ionica (viceversa gli ioni + neutralizzano le cariche - di P), sostanze denaturanti (urea - formamide).
• Reversibile: abbasso gradualmente temp. (per evitare strutture 2° intramolecolari) - 1° appaiamento = nucleazione dell’elica poi rapid zippering.
• Degradazione: rottura legami fosfodiestere (endonucleasi - soluzione acida HCl).
• Rinaturazione: riappaiamento tra 2 filamenti della stessa molecola.
• Ibridazione: appaiamento tra due filamenti appartenenti a molecole ≠.

DNA denaturato: aumenta l’assorbanza della luce UV, diminuisce la viscosità.

Melting Temperature (Tm) = temp. alla quale 50% DNA a doppio filamento e 50% è denaturato. Dipende dalla lunghezza e dalla sequenza (legami C-G o A-T). Ibridazione inizia a pochi gradi sotto la Tm si riferisce alla sonda.

Tm = (N° G+C) x 4 + (N° A+T) x 2

Stringenza:

• Condizioni di ibridazioni stringenti = richiedono più omologia tra sonda e bersaglio.
• Condizioni di ibridazione meno stringenti = richiedono una minore percentuale di omologia sonda-bersaglio.

Condizioni alta stringenza: alta temperatura, bassa concentrazione salina, denaturanti chimici.

Condizioni bassa stringenza: minore temperatura, maggiore concentrazione salina, no denaturanti chimici.

Identificare una sequenza all’interno di una libreria genomica (cDNA)

Sonda: popolazione omogenea di molecole omologhe alla sequenza che voglio trovare.

Bersaglio: tutti i cloni della libreria su piastra.

Scopo: identificare all’interno del bersaglio quel clone, o quei pochi cloni, che contengono sequenze complementari alla mia sonda.

• Per rendere visibile l’appaiamento sonda-bersaglio: sonda marcata.
• Marcare acidi nucleici: denaturo la sonda e, visto che conosco la sequenza, realizzo un primer sintetico che legherà il 3’. DNA polimerasi batterica purificata sintetizzerà in vitro il nuovo filamento. Se utilizzo oligonucleotidi radioattivi/fluorescenti per la sintesi il nuovo filamento sarà marcato.
• Marcature radioattive: sostituisco il P in posizione α con P32 o S35, sostituisco l’H legato al C2 dello zucchero con trizio.
• Marcature fluorescenti: fluorocromi (emettono fluorescenza se illuminati con raggi laser), emettono in lunghezze d’onda ≠ e quindi vedremo colori ≠.
• Digossigenina (evidenziata tramite legame con anticorpi marcati).
• FISH: ibridazione su cromosomi metafasici con sonde specifiche per 1 allele, sia la sonda che il bersaglio saranno denaturati.
• Il DNA bersaglio a singolo filamento è messo su superficie solida (filtro di nitrocellulosa) e si lega covalentemente con esso in un punto specifico.
• Incubazione: inserisco la sonda marcata → ibridazione. Immergo filtro in soluzione di lavaggio per togliere le sonde non ibridate o ibridate sonda-sonda. Visualizzo le sonde ibridate (marcatura radioattiva = autoradiografia su pellicola fotografica).

Screening genoteca

• Trasferire cloni dalla piastra al filtro di nitrocellulosa: appoggio il filtro sulla piastra, esso si imbeverà di liquido che trasporterà anche proteine/DNA. Vengono fatti fori sul filtro e sulla piastra per poterli riorientare correttamente.

Southern blot

• Si fa elettroforesi di DNA tagliato in frammenti con enzimi di restrizione. Trasferire il DNA su filtro in nitrocellulosa: trasferimento per capillarità.
• Sopra il gel si mette: filtri di carta assorbente + filtro in nitrocellulosa + carta assorbente. La carta sotto assorbe il liquido tampone dal gel. Per capillarità il liquido è richiamato a salire dal primo al secondo strato di carta. Il liquido trascina con sé l’acido nucleico che resta sul filtro di nitrocellulosa. Il filtro di nitrocellulosa riporta DNA in uguale posizione e quantità (in proporzione) che aveva sul gel.
• Il filtro in nitrocellulosa è ibridato per trovare DNA bersaglio.
• Esempio: Southern Blot di plasmide con all’interno un frammento di DNA (bersaglio). Faccio varie elettroforesi con enzimi ≠:
• Pozzetto M: marcatore di peso molecolare (bande di taglia nota per avere riferimento).
• Pozzetto P: plasmide non tagliato + bande perché i plasmidi superavvolti sono più veloci.
• Pozzetto P+B: plasmide tagliato con BamH1 è linearizzato e forma 1 sola banda.
• Pozzetto P+E: plasmide tagliato con EcoRI separa plasmide e inserto: 2 bande.
• Pozzetto G+E: tutto il DNA genomico tagliato con EcoRI forma tantissimi frammenti ≠, non ci sono bande ma un’unica strisciata. Banda discesa = DNA satellite con sequenze ripetute molte volte. EcoRI forma tanti frammenti della stessa lunghezza. Trasferisco sul foglio di nitrocellulosa e ibrido:
• Pozzetto P: tutte le bande marcate (tutti i plasmidi hanno il frammento).
• Pozzetto P+B: 1 banda evidenziata (tutti i plasmidi hanno il frammento).
• Pozzetto P+E: 1 banda marcata (si evidenzia solo l’inserto non la banda del plasmide).
• Pozzetto G+E: 1 banda uguale a quella del pozzetto E. La sonda lega solo la sequenza a essa complementare (= all’inserto di P). Da tutta la strisciata solo le molecole di questa grandezza (generate con EcoRI) che contengono questa sequenza verranno ibridizzate.

Scopi

• Evidenziare mutazioni di RFLP: si ottengono bande ≠ dagli stessi alleli (delezioni o creazioni di siti di restrizione: mutazioni con riscontri patologici).
• Esempio: mutazione su sito di restrizione che scompare.
• Omozigote sano = 2 bande (entrambi gli alleli sono tagliati da ER).
• Omozigote malato = 1 banda (nessuno dei due alleli è tagliato da ER).
• Eterozigote = 3 bande (1 allele è tagliato da ER, l’altro no).

Northern blot

Simile al Southern Blot ma utilizza RNA (NO enzimi di restrizione). Serve a quantificare il prodotto dei geni attraverso l’RNA che trascrivono e capire come e dove sono espressi i geni.

Tecniche per quantificare il prodotto dei geni

• Ibridazioni: slot blot, Northern blot, ibridazione in situ (FISH), micro e macro arrays.
• Amplificazioni: PCR.

Di solito l’abbondanza di RNA è proporzionale al grado di attività del gene.

Processo

• Lisi cellule con un potente denaturante che rompa la membrana e denaturi le proteine (altrimenti le ribonucleasi degraderebbero l’RNA).
• RNA è fatto precipitare con soluzione di sali e alcol assoluto per purificarlo ed estrarlo.
• Tutto l’RNA è separato con elettroforesi su gel denaturante (formaldeide) per evitare che formi strutture secondarie (scorrerebbero più velocemente di quelle lineari).
• Si ottiene strisciata perché ci sono tanti RNA di tante taglie diverse:
• Bande discrete = abbondanza di RNA della stessa taglia (rRNA 28S e 18S).
• L’abbondanza di RNA dipende dal tipo cellulare da cui è stato estratto.
• Poi trasferisco RNA su filtro di nitrocellulosa e lo lego covalentemente ad esso (cross-linking).
• Ibridazione con un frammento dell’RNA sonda di cui sono interessato a studiare l’espressione in questi tre campioni.
• Visualizzazione del segnale (autoradiografia o clorimetria) per analizzare:
• Qualità del segnale: se vedo 2 bande (che avranno stessa sequenza perché ibridizzate con la stessa sonda) significa che è splicing alternativo o promotore alternativo o ≠ sito di poli-A. Questo spiega perché le sequenze sebbene uguali hanno PM ≠.
• Quantità del segnale: dipende da quanto RNA era stato caricato nel gel, bisogna effettuare un’altra ibridazione.
• Seconda ibridazione controllo: pongo il filtro in condizioni denaturanti.
• Stripping: RNA resta legato ma la sonda si stacca.
• Nuova sonda: gene housekeeping RNA che codifica per proteina essenziale in tutte le cellule (la sua espressione non varia in condizioni/cellule ≠).
• La quantità di RNA marcato sarà proporzionale alla quantità di RNA caricato nel gel.
• Confronto ibridazione con target e ibridazione di controllo (conto numero pixel delle bande): per ciascun campione divido numero della banda target col numero della banda di controllo (normalizzazione).

Ibridazione in situ

Avviene direttamente su tessuti (sezioni istologiche/tessuto non sezionato: whole mount) per localizzare l’espressione di un dato mRNA o gene a livello delle cellule.

• Estraggo porzione di tessuto e lo immobilizzo su vetrino.
• Elimino proteine e uso soluzione denaturante.
• Infine faccio ibridazione e visualizzo i segnali colorimetrici o radioattivi.
• Ibridazione whole mount: su embrioni o tumori (il tessuto non è sezionato).
• Tratto tessuto con detergente per fare piccoli buchi sulle membrane.
• Utilizzo sonda fluorescente che ibridizza col suo mRNA/DNA complementare.
• Lavo via sonde non legate: la quantità di sonda è proporzionale a quella di mRNA.
• Posso utilizzarlo per localizzare un gene su un cromosoma (per vedere trisomie).

PCR

Amplificare sequenza di DNA in vitro senza clonaggio/batteri (può essere quantitativa o no).

Serve:

• DNA stampo da amplificare.
• Deossinucleotidi trifosfato (per formare le nuove molecole).
• Taq polimerasi.
• Primer: 2 oligonucleotidi di innesco complementari a due sequenze situate alle estremità del filamento opposto (segnano inizio della sequenza da amplificare).

Taq polimerasi: dai batteri termofili, resiste e funziona fino a 95°C.

Ogni PCR è composta da circa 30 cicli (per 2 miliardi di copie) ogni ciclo: 95°C, 55°C, 72°C.