Biologia cellulare e molecolare (parte 1 di 2)

Biologia cellulare e molecolare

Esame intero: biologia cellulare e molecolare

Parti dei proff. Raugei, Ramazzotti
A.A. 2021/2022

Biologia cellulare e molecolare - Giovanni Raugei A.A. 2021/2022

La trascrizione e la sua regolazione in eucarioti

Quindi la regolazione dell'espressione genica nella produzione di proteine, facciamo il caso di un gene che produce una proteina, negli eucarioti è un evento sicuramente piuttosto complesso, più rispetto che nei procarioti. E vediamo velocemente l'attività della RNA polimerasi soprattutto l'isoforma 2 e in tutto il mondo biologico esistono varie RNA polimerasi e ricordiamo una che è la RNA polimerasi fagica come la RNA polimerasi T7, una procariotica che la citiamo perché è una RNA polimerasi molto semplice, che ricorda biotecnologicamente e sono RNA polimerasi.

I vaccini a RNA si sono prodotti proprio in questa maniera, sono prodotti in vitro come sintesi in vitro su uno stampo di RNA, arricchito ovviamente a monte di una sequenza, di un promotore di 17 basi per uno di queste RNA polimerasi fagiche, T7 o anche T4 e quindi potremmo produrre enormi quantità di RNA che verrà usato come vaccino, per cui è una sintesi molto semplice. Giusto per concludere notiamo che questo mRNA prodotto da queste RNA polimerasi, non è un mRNA che si usa come vaccino perché deve essere reso un RNA messaggero che in più ha un cap che viene chimicamente aggiunto con l'enzima che fa questo lavoro e deve poi essere aggiunta una coda di poli A che viene inserita nella sequenza codificante per l'RNA e viene trascritta, e in più, altra cosa che viene fatta è che alcuni nt sono nt modificati che ovviamente da un punto di vista della codifica, come codone, sono perfettamente identici a quelli naturali ma sono meno attaccabili dalle endonucleasi. Infatti i vaccini quando iniettati velocemente sarebbero rimossi e quindi in questo modo si rallenta facendo produrre in modo più abbondante.

Allora, guardando tra le RNA polimerasi ci avviciniamo a quelle eucariotiche ma ancora non ci siamo, un'altra è presente in quella eucariotica ed è la RNA polimerasi mitocondriale, che sostiene la produzione di proteine che sono prodotte nel mitocondrio, e questa ha una forte omologia con queste RNA polimerasi di tipo fagico, come la T7 e c'è tutta una parte omologa più altre particolari zone come l'inizio della sequenza di indirizzamento al mitocondrio e poi una porzione che interagisce con fattori trascrizionali. Ed è un enzima monomerico anche questo, un po' più complesso.

Inoltre, giusto un richiamo alla RNApoli di E.Coli, è un enzima già più complesso con più subunità, come la sigma che riconosce il promotore e poi si ha anche un dominio terminale, una coda terminale che è quel dominio che interagisce con l'elemento UP dentro la sequenza di DNA. e quindi abbiamo le regioni -10 e -35 nel DNA e poi si ha una serie di promotori con un dominio di interazione che è mediata dalla proteina CAP. e in carenza di glucosio si ha aumento di cAMP e la proteina CAP che lega il cAMP lega l'elemento UP e stabilizza la coda C-terminale della subunità alfa della RNA polimerasi. E questo lo citiamo giusto per dire gli elementi nuovi che ora andiamo a vedere e gli elementi fondamentali sono due, uno il fatto che la RNA polimerasi ha dei meccanismi per cui risponde non solo a uno stimolo, come la presenza o meno di lattosio, ma ci sono anche secondi messaggeri come il cAMP e questi sono due elementi che complicano il sistema di regolazione che ricordano quello che vedremo succedere in qualsiasi gene eucariotico.

Per il meccanismo di trascrizione della RNA polimerasi non ci sono grandi differenze tra i vari tipi di polimerasi, infatti possiamo immaginarci la solita struttura a mano dove dentro la RNA polimerasi si apre la bolla trascrizionale in cui avviene la sintesi, è importante la partecipazione dello ione Mg, che essenzialmente facilita l'ingresso dei nucleosidi trifosfato in ingresso e partecipando alla catalisi con la loro carica positiva perché annullano la carica negativa del fosfato facilitando l'interazione tra i vari substrati.

Particolari della trascrizione eucariotica

Entrando nel particolare della trascrizione eucariotica, negli eucarioti si trova la RNA polimerasi 1, 2 e 3 che sono ben caratterizzate sotto l'aspetto dei prodotti e noi ora ci occupiamo della RNA polimerasi 2 perché le altre fanno un lavoro meno regolato, o regolato in modo più semplice e che dipende più dalle funzionalità cellulari visto che sono tutte funzioni che riguardano la sintesi proteica, mentre la 2 è interessante perché, a parte che sintetizzare i pre-mRNA, sintetizzano anche i miRNA o anche buona parte dei snRNA. In più, nelle piante ci sono anche la polimerasi 4 e 5 che codificano per RNA non codificante implicati nel silenziamento genico. E poi troviamo quella mitocondriale che è fatta da solo una subunità, mentre molto più complesse nelle altre polimerasi, fino a 16 per la polimerasi 3 addirittura. Storicamente queste polimerasi erano differenziate per l'affinità all'alfa-amanitina che è un veleno che blocca soprattutto la 2 e un po' anche la 3.

Strutturalmente, parlando della polimerasi 2, è quella caratterizzata dalla coda CTD presente solo nella polimerasi 2 per cui tutti gli importanti fenomeni che avvengono nella coda CTD, come fenomeni regolativi, sono tipici della RNA polimerasi 2 e portano ad avere degli RNA che hanno un cap e che sono poli-adenilati, perché tutto questo è regolato dalla coda CTD. Infatti ricordiamo che nell'uomo ha 52 ripetizioni di 7 aa in cui i più interessanti da un punto di vista della regolazione sono la serina 2 e serina 5 che sono fosforilati durante l'inizio e le fasi successive della trascrizione e costituiscono una sorta di segnale che prevede inizio della trascrizione con fosforilazione in Ser5 e poi più tardi durante l'elongazione si ha fosforilazione sia su Ser2 che Ser5, e poi alla fine la Ser5 viene defosforilata e rimane quella in Ser2. Tutto questo quindi fornisce una specie di timing per tutte e tre le fasi di iniziazione, elongazione e terminazione, un timing allora dato dalla fosforilazione e defosforilazione. Quando la Ser5 è allora fosforilata, allora quella coda CTD serve da docking site per una particolare proteina che è quella che opera il capping, ovvero il capping di un RNA prodotto dalla polimerasi 2, possiamo chiamarlo mRNA, anche se abbiamo detto abbiamo altri tipi di RNA prodotti, ma questo capping avviene proprio per il reclutamento nella coda CTD, posizione privilegiata perché nei paraggi della CTD c'è il foro di uscita dell'RNA di nuova sintesi che avrà un 5' trifosfato e allora si adopera il capping con l'aggiunta di un GTP.

Nelle altre fasi, durante elongazione, sulla coda CTD si richiede uno dei fattori che fanno parte dello spliceosoma, ed è il fattore che dà inizio all'assemblaggio dello spliceosoma nei siti in cui deve avvenire lo splicing. Invece alla terminazione nella coda invece si legano fattori che servono per la terminazione della trascrizione. Per cui questa coda CTD favorisce tutti questi fenomeni in modo tempo dipendente. Una visione un po' più precisa di queste ripetizioni peptidiche prevede che ci siano vari tipi di ripetizione quasi sempre c'è la Ser in posizione 2 e 5, a volte c'è anche una treonina. La posizione 1 in genere è sempre una Tyr che anche lei è fosforilabile, poi si ha la Ser (o Thr) in posizione 2, poi posizione 3 e 4 si ha solitamente Thr o Ser anche loro fosforilabili, e uguale in posizione 5 dove però c'è sempre una Ser, in posizione 6 invece una Pro.

La polimerasi 2 come detto media la trascrizione dei mRNA e altri RNA e intervengono tutta una serie di fattori, dapprima i fattori generali della trascrizione che si assemblano nel promotore, nella fase precoce iniziale, necessaria ma non sufficiente per far partire la trascrizione, tanto che si ha il coinvolgimento dei vari fattori trascrizionali che integrano poi vari segnali, e in più è importantissimo anche la modificazione degli istoni e nel rimodellamento della cromatina. Allora vedendo la struttura semplificata, essenzialmente la posizione +1 è quella di inizio della trascrizione dove poi a valle di questo nt avremo il trascritto primario e è la posizione in cui si monta i fattori basali di trascrizione, per cui abbiamo delle zone anche a monte e valle rispetto a +1. Per cui dalla posizione +1 abbiamo la trascrizione del gene strutturale, la parte realmente trascritta in RNA e poi inizia a valle del promotore terminando nel terminatore.

Promotore eucariotico

Ora, il promotore eucariotico è fatto da un iniziatore che è la zona del DNA dove si ha la posizione +1 che è un adenosina in generale, infatti è una timina nello stampo e quindi adenosina nell'mRNA, e troviamo questa adenosina con due pirimidine a valle e altre basi particolari nel contorno di questa adenosina. Ovviamente il panorama è un po' più complesso e diciamo è la zona in cui si legano i fattori generali della trascrizione, quindi è una zona che vede l'inizio di trascrizione nel +1 e poi una serie di altri punti di riconoscimento, poi a monte di ha il TATA box e BRE che appunto sono a monte di +1 e poi si ha altre posizioni anche a valle, nella prima parte, in genere entro i 40 nt a valle del +1. E tutti gli RNA ricordiamo che hanno un 5' non tradotto che negli eucarioti è molto estesa, infatti da 50 a 100-200 basi e che ha un significato per lo più regolativo dove abbiamo proprio queste sequenze di contorno all'iniziatore, insieme al TATA box e BRE che però sono a monte dell'iniziatore. E molti geni questa prima parte quindi contiene motivi molto simili tra loro che servono proprio per l'adesione dei fattori generali di trascrizione. E questi in particolare nella figura si trova il più complesso e importante che è TF-D che è un transcriptional factor multimerico che contatta sia iniziatore, che TATA box, ma anche i fattori regolativi a valle dell'iniziatore, mentre TF-B è quel fattore che contatta il BRE. Nel basso nella figura si ha anche il confronto con un promotore di lievito e si vede che è un promotore molto più semplice che essenzialmente rispetto a un promotore batterico ha delle zone di riconoscimento a monte, quelle UAS dette Upstream Sequencing che sono più complesse che nei batteri, ma in genere è una struttura più semplice degli eucarioti superiori.

Inizio della trascrizione

Quindi, all'inizio della trascrizione abbiamo una sequenza di eventi, in primis si definisce l'elemento TATAbox a cui si lega il fattore TFD seguita da TFB che riconosce BRE. Poi vedendolo in termini riassuntivi, intervengono altri fattori, come TFA, TFF e TFE e TFH dove quest'ultimo è importante perché fa due cose, da una parte è una elicasi e quindi dal complesso chiuso lo fa aprire da ds a due ss, ed è un evento fondamentale per la trascrizione, ma è anche una chinasi specifica per la Ser5. Quindi il TFH ha un ruolo direttamente riconoscibile perché apre il ds e poi crea questo segnale fosforilativo che fa sì che l'RNA polimerasi si stacchi dal promotore cominciando a procedere lungo il filamento di DNA aperto. E nel momento in cui la polimerasi si stacca lascia dietro quasi tutti i fattori del complesso di inizio che si erano legati.

TFD e complessi di inizio

Vediamo allora più preciso il TFD che è molto variegato, multisubunitario tra cui quella che spicca è il TBP, ovvero il TATA box binding protein che riconosce il TATA box. E ci sono 3 casi diversi perché i promotori quando sono molto complessi, non vuol dire che sono tutti uguali, ma è il fatto che certi elementi ci siano o meno o siano presenti in più o meno copie, diversifica il promotore, per cui potremmo dire che ogni promotore è unico per il gene per cui codifica. E lo vediamo proprio nel complesso di inizio perché indipendentemente dalle sequenze che possiamo trovare, esistono addirittura come vediamo nel primo caso dei geni in cui manca l'elemento del TATA box. E ci sono anche promotori che non avendo un TATAbox essenzialmente si basano per lo più sul contorno della posizione +1 e di altre sequenze come la DPE che è a valle e quindi si ha l'interazione di subunità dette TAF, che sono queste subunità tipiche del TFD, mentre nel caso più comune si ha il TATA box è la subunità TBP che interagisce con tale sequenza. Ci sono poi alcuni elementi a valle, quelli S1, S2 e S3, che interagiscono con TAF1 e quindi vediamo come i vari promotori, già a livello del promotore basale possono essere molto diversi.

Funzioni dei vari TF

Quindi possiamo vedere le varie funzioni dei vari TF, tra cui TFA stabilizza TFB e TFD, dove TFB interagisce con BRE, e poi importanti sono TFH e TFE dove il TFE regola proprio TFH nella sua attività chinasica-elicasica. Esiste poi un complesso detto mediatore che è fatto anche da più di 30 subunità che integra i segnali di vari fattori trascrizionali.

Trascrizione e fasi decisionali

Ora, la trascrizione essenzialmente abbiamo detto inizia, ma ci sono una serie di fasi decisionali precedenti che ancora non sono del tutto ben note, ma essenzialmente si vede che inizia la trascrizione per una cinquantina di basi e poi c'è una pausa dovuta dal fattore di allungamento P-TEFb che viene inibito dal fattore NELF. Nel caso di P-TEFb è anche una chinasi, che fosforila NELF inibendolo, per cui essenzialmente dopo una cinquantina di basi si ha questa pausa che tiene ferma un po' la polimerasi, e poi quando P-TEFb fosforila NELF allora l'azione di P-TEFb ha successo e fa ripartire l'evento trascrizionale. Non è ancora in realtà del tutto chiaro, ma non è neanche chiaro un altro fenomeno che è una trascrizione retrograda, per cui la RNA polimerasi è stato visto che può andare per brevi tratti addirittura indietro trascrivendo l'altro filamento e producendo corti filamenti di cui però ancora non è chiaro a cosa servano, però anche in questo caso inizia la trascrizione nel verso giusto e poi la trascrizione subisce queste modifiche. È come, potremmo dire, che una volta avviata la trascrizione poi ci sono dei controlli per cui possiamo pensarci un po' di più se far avvenire o meno questa trascrizione. In ogni caso studi di questo tipo sono difficili, soprattutto per la trascrizione retrograda perché sono prodotti molto labili e quindi difficili da valutare, anche perché sono prodotti in piccola quantità e quindi non sono neanche troppo facili da studiare.

Meccanismo di trascrizione

Rimanendo sul meccanismo di trascrizione in generale, altra cosa interessante è che la RNA polimerasi è associata a vari fattori di elongazione ma succede ogni tanto che si abbia qualche pausa di trascrizione, che come nel caso precedente, se sono troppo prolungate, la polimerasi potrebbe staccarsi portando a aborto della trascrizione e tutto deve nel caso riniziare dall'inizio dal promotore. Però quando c'è uno stallo, o una pausa, può esser dato anche dall'inserimento di nt errati. Ricordiamo infatti che la RNA polimerasi si dice che ha uno scarso proof-reading, che vuol dire che non ha un meccanismo efficiente per funzionare come nella DNA polimerasi, però in parte c'è un meccanismo di taglio dell'RNA appena prodotto, per cui se si ha questa pausa allora succede che la RNA polimerasi tende a tornare un po' indietro, nel caso per esempio di un inserimento sbagliato, cosa che allora viene riconosciuto il sito di errore e quindi questo modo si attiva un'attività endonucleasica (non esonucleasi) della RNA polimerasi che taglia alcuni nt e poi il meccanismo rinizia e questo avviene quando interviene in questo momento di pausa il fattore TFS che attiva proprio, legandosi alla RNA polimerasi, questa reazione di taglio. Allora i due meccanismi, uno è quello idrolitico che vede l'idrolisi in una posizione nel secondo e terzo nucleotide, oppure la piro-fosforolisi per cui si ha una fosfo-lisi dell'ultimo legame fosfodiesterico con l'intervento di un pirofosfato che è stato liberato durante una reazione di elongazione, e in questo modo quindi si adopera questo taglio, in questo caso perdiamo solo l'ultimo nt aggiunto. Questi meccanismo non migliorano però di molto la fedeltà di copia della RNA polimerasi.

Coda CTD e formazione del cap

Avevamo allora parlato della coda CTD e porta alla formazione del cap, con intervento di un GTP che si lega con una modalità strana con legame 5'-5' e la permanenza di un ponte trifosfato, in realtà il cap0 prevede anche la metilazione della guanosina per cui diventa una 7-metil-guanosina, e poi negli animali ci sono altri cap, come cap1 o cap2 dovuti essenzialmente alla metilazione della posizione 2' del primo e secondo nt. Questo cap comunque in ogni caso è legato dalla CBP, ovvero la cap binding protein che viene staccato dal fattore traduzionale detto eIF4E che permette di liberare l'estremità 5' e fa riconoscere il complesso del ribosoma il mRNA del 5'.

Evento della terminazione

Ricordiamo anche l'evento della terminazione, che mentre nei procarioti è qualcosa che dipende da una struttura che si forma nel trascritto, ovvero un loop che si forma nel trascritto che disturba l'andamento della trascrizione, negli eucarioti invece la terminazione non è il momento in cui davvero termina la trascrizione, ma è la generazione del 3' dell'RNA che poi viene incontro a un taglio, ovvero il sito di poliadenilazione, come sito presente sull'RNA che si riconosce dalla proteina CPSF che poi si lega al CstF che è la proteina che opera il taglio. Quindi una proteina riconosce il sito di poliA e poi interviene un altro fattore che taglia l'RNA una decina di basi a valle di questo elemento presente sull'RNA. Quindi il 3' dell'RNA deriva da un taglio che libera un 3'-OH a cui si aggiunge una coda di adenine mediante una RNA polimerasi detta poli-A polimerasi che senza uno stampo aggiunge solo adenine per ottenere una coda di poli-A di circa 200 basi.