Biologia cellulare

Biologia cellulare

Biologia cellulare: branca della biologia che studia la struttura, la funzione e il comportamento della cellula e dei meccanismi che regolano le attività cellulari a livello microscopico e molecolare.

Modelli sperimentali

Studiare la singola cellula non è sufficiente, è necessario studiare tutti i vari tipi cellulari che compongono un organismo complesso. I biologi cellulari e molecolari hanno concentrato le loro ricerche su limitati tipi di cellule di organismi utilizzate come modelli sperimentali perché più semplici da studiare: un modello per essere definito sperimentale deve presentare delle specifiche caratteristiche, come riproduzione veloce, corpo trasparente, si prestano facilmente a manipolazioni genetiche e molecolari…

Alcuni organismi modello sono i lieviti, che sono infatti gli eucarioti più semplici (unicellulari) e sono utilizzati per studiare la struttura interna della cellula e i principali aspetti funzionali delle cellule eucariotiche; il lievito più studiato in particolare è Saccharomyces cerevisiae, il lievito di birra. Le loro caratteristiche sono genoma piccolo e maneggevole, struttura tipica delle cellule eucariotiche, facilmente coltivabile in laboratorio, replicazione veloce, permette di ottenere facilmente colture clonali da una singola cellula.

Anche studi di genetica e biochimica sui lieviti hanno permesso di comprendere alcuni meccanismi molecolari eucariotici come replicazione del DNA, trascrizione, processamento dell’RNA, smistamento delle proteine e divisione cellulare.

Altri organismi modello semplici ma strutturalmente più complessi dei lieviti sono gli invertebrati, in particolare i nematodi, come Caenorhabditis elegans, e gli artropodi come Drosophila melanogaster; sono modelli semplici per lo studio dei meccanismi cellulari che regolano sviluppo embrionale e differenziamento cellulare degli organismi pluricellulari. Hanno permesso di scoprire la presenza delle mutazioni responsabili di anomalie dello sviluppo e di geni omologhi che funzionano con le stesse modalità in organismi più complessi.

Caenorhabditis ad esempio è un ottimo modello perché è un organismo pluricellulare semplice, è trasparente, ha ciclo vitale breve ed è facilmente allevato e manipolato dal punto di vista genetico in laboratorio, inoltre è eutelico. Drosophila è il modello fondamentale per la biologia cellulare dello sviluppo e della genetica molecolare. Per quanto riguarda invece i vertebrati, i maggiori modelli sperimentali sono Danio rerio (zebrafish), Xenopus laevis (rana unghiata sudafricana) e il topo, che è il migliore per comprendere i meccanismi che avvengono nell’uomo.

Un altro approccio utile per lo studio delle cellule di mammifero o umane è quello di coltivare delle cellule isolate in vitro: colture cellulari.

Strumenti e metodologie: microscopia

Strumenti necessari per lo studio delle cellule dal punto di vista strutturale e funzionale:

• Microscopia ottica: consente lo studio della cellula all’interno del suo tessuto, studiandone la struttura ed i costituenti chimici. Sono spesso utilizzate tecniche citochimiche ed istochimiche, ovvero l’impiego di reattivi chimici per mettere in evidenza particolari caratteristiche. Possono essere utilizzate anche tecniche immunocitochimiche, ovvero molecole cellulari identificate mediante anticorpi (formazione di un complesso antigene-anticorpo che viene colorato);
• Microscopia a contrasto di fase e microscopia a contrasto di interferenza differenziale: consentono di avere delle informazioni senza colorazione bensì con contrasto, quindi senza colorare i campioni, utile per lo studio delle strutture cellulari. Si tratta di sistemi ottici che convertono le variazioni di densità o di spessore tra le diverse parti della cellula in differenze di contrasto.
• Microscopia a fluorescenza: avviene mediante la localizzazione in cellule e tessuti di molecole fluorescenti (che emettono luce quando eccitate da radiazioni di determinata lunghezza d’onda) o molecole marcate con fluorocromi. I fluorocromi sono molecole fluorescenti che se colpiti da una radiazione in parte la assorbono e in parte la restituiscono; la radiazione emessa ha caratteristiche diverse, ha una lunghezza d’onda maggiore (energia minore) della radiazione eccitatrice (incidente).

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Si tratta di una microscopia in campo scuro, in modo da vedere bene la luce emessa dal preparato; il campo scuro si crea andando al di fuori dello spettro della luce visibile, quindi la sorgente di illuminazione sarà ricca di radiazioni non visibili, con basse lunghezze d’onda, il fluorocromo assorbirà parte di questa energia e ne emetterà una lunghezza d’onda maggiore, che cadrà nel visibile. Si utilizzano delle lampade speciali anche speciali filtri, come il filtro di eccitazione posto davanti alla sorgente luminosa che filtra la luce prima che essa attraversi il campione, trasmettendo le radiazioni che eccitano il colorante fluorescente (assorbe le altre); c’è anche il filtro di sbarramento, posto tra il filtro e l’oculare, che ha invece funzione di trattenere tutte le radiazioni che non vengono assorbite, trasmettendo solo la luce fluorescente emessa dal preparato (visibile).

• Microscopia ad epifluorescenza: l’illuminazione è ottenuta con la luce incidente (l’illuminazione avviene dall’alto, e non dal basso come nei microscopi ottici); si utilizza uno specchio dicroico posto sopra all’obiettivo ed inclinato di 45° che divide il raggio, riflette le lunghezze d’onda di eccitazione e lascia passare lunghezze d’onda di emissione (filtri e specchi scelti in base alle caratteristiche del fluorocromo utilizzato).
• Microscopia elettronica: microscopio elettronico a trasmissione, consente di studiare l’ultrastruttura delle cellule (maggiore risoluzione) mettendo quindi in evidenza gli organuli cellulari, e microscopio elettronico a scansione (immagine tridimensionale del campione, per analizzare le superfici esterne).
• Microscopia confocale: evoluzione del microscopio a fluorescenza, riesce a bypassare i limiti dei microscopi a fluorescenza tradizionali, ovvero permette di usare anche campioni spessi (per la microscopia a fluorescenza tradizionale invece occorrono campioni sottili e occorre fare delle sezioni) permettendo di vedere gli oggetti nella loro tridimensionalità. Il microscopio a scansione confocale consente quindi la messa a fuoco di un solo piano selezionato in un campione spesso (sezioni ottiche), rigettando la luce proveniente da regioni fuori fuoco (sopra e sotto a quel piano).

Nel microscopio a scansione confocale a fluorescenza non viene illuminato tutto il campione, bensì un fascio di luce è focalizzato su un solo punto ad una profondità specifica del campione (sorgente d’illuminazione estremamente sottile, fornita da un laser che passa attraverso un foro); la luce fluorescente emessa dal punto a fuoco del preparato passa attraverso un forellino confocale col primo e raggiunge il rivelatore, tutto ciò che è fuori fuoco non lo raggiunge.

Il rivelatore dopo fa una ricostruzione 3D di tutte le immagini, ricostruendo il campione nella sua tridimensionalità. I vantaggi sono di poter ottenere immagini mediante sezioni ottiche a diversa profondità del campione che vengono registrate in un computer e che considerano la tridimensionalità del campione; si ha un aumento del contrasto dell’immagine e anche della sua nitidezza, inoltre permette di fare osservazioni su cellule vive e fissate e analizzare in simultanea fluorocromi multipli (tecniche di immunofluorescenza).

8/03 Colture cellulari

La maggior parte delle cellule, sia animali che vegetali, se poste in un mezzo nutriente appropriato possono sopravvivere, moltiplicarsi, esprimere proprietà differenziate in una piastra di coltura; i metodi in vitro sono i sistemi modello per studiare il funzionamento delle cellule in colture cellulari. L’informazione ottenuta in vitro deve poi essere trasferita in vivo.

Verso la fine dell’800 Ringer mette a punto la composizione di una soluzione salina efficace nel mantenere il battito di un cuore isolato dal corpo; nel 1907 Harrison mantiene in coltura del tessuto neurale (espianto di tubo neurale) di anfibio in un coagulo di linfa di rana (in un vetrino ed in ambiente sterile): in questo modo osserva in vitro che da questo espianto si sviluppavano delle fibre nervose.

All’inizio del ‘900 vengono effettuate delle colture per la crescita di frammenti tissutali utilizzando coaguli di plasma, e successivamente si sviluppano delle tecniche di colture cellulari in supporto alla ricerca in ambito virologico-sviluppo vaccini (coltivazione in vitro del virus polio e scoperta del metodo per la produzione del vaccino anti-polio).

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Nel 1951 viene messa in coltura la prima linea cellulare stabilizzata umana di origine tumorale, la linea di cellule HeLa (da cellule tumorali della cervice uterina di Henrietta Lacks); nel 1954 Rita Levi Montalcini coltiva gangli sensoriali di pollo scoprendo il fattore di crescita NGF (nerve growth factor), che ha un ruolo essenziale nella crescita e nel differenziamento delle cellule nervose, è il primo fattore di crescita scoperto.

Nel 1955 Eagle riuscì ad identificare gli elementi nutritivi essenziali necessari affinché una coltura cellulare possa essere mantenuta; fece esperimenti di crescita di due linee cellulari, cellule HeLa e fibroblasti di topo, in un mezzo costituito in concentrazioni note di sali, carboidrati, amminoacidi, vitamine ed una piccola proporzione di proteine del siero animale. Nel 1961 viene dimostrato che i fibroblasti umani muoiono dopo un certo numero di divisioni in coltura.

Altre conquiste nell’ambito delle colture cellulari sono l’uso di antibiotici che inibiscono la crescita dei batteri, l’uso della tripsina per staccare le cellule dalla piastra di coltura senza danneggiarle e l’uso di terreni di coltura sintetici.

Tipi di colture

• Coltura d’organo o tessuto: sviluppo temporaneo di frammenti di organo o tessuto in terreno di coltura, sono colture a breve termine e perdono quindi in breve tempo l’organizzazione che le rende interessanti dal punto di vista sperimentale;
• Colture di cellule disperse: sistemi più omogenei rispetto alle colture d’organo o tessuto, le singole cellule non sono condizionate dalle posizioni che occupano nel tessuto.

Coltivare le cellule dà dei vantaggi, perché esse sono infatti sistemi semplificati altamente riproducibili: si ha quindi una riduzione della complessità tissutale per studiare la biologia cellulare (metabolismo, differenziamento…) rispetto allo studio di queste caratteristiche all’interno di un tessuto. Inoltre l’ambiente di crescita delle cellule può essere controllato (pH, pressione…) e manipolato (aggiunta di sostanze per studiare l’effetto di composti chimici in tipi cellulari differenti).

Inoltre, i campioni sono molto omogenei e i risultati ottenuti sono altamente riproducibili, grazie al fatto che l’ambiente può essere controllato; si ha poi anche la possibilità di modificare geneticamente le cellule poste in coltura e di produrre tessuti artificiali in vitro (medicina rigenerativa). Un altro vantaggio è che le colture cellulari permettono di avere tecniche più veloci rispetto alla sperimentazione in vivo, e spesso permette anche di contenere i costi e si ottengono risposte più rapide ed uniformi rispetto alla sperimentazione in vivo; inoltre si riduce l’utilizzo degli animali da esperimento.

Si possono poi osservare in modo diretto fenomeni biologici nel loro svolgersi, inoltre sono disponibili in commercio delle linee cellulari di tipi cellulari diversi, caratterizzati dal punto di vista delle loro caratteristiche di crescita ecc, e anche terreni diversi.

Campi di applicazione delle colture cellulari

• Studio del funzionamento delle cellule (biologia cellulare), dei processi intracellulari come sintesi proteica, meccanismi di traduzione dei segnali, interazioni cellula-cellula…;
• Studi di citotossicità;
• Studi di anomalie genetiche;
• Studi sul meccanismo di azione dei farmaci;
• Studio dei processi infettivi virali;
• Caratterizzazione dei tumori;

Le colture cellulari hanno però, nonostante i numerosi vantaggi, anche dei limiti: sono sistemi talvolta troppo semplici rispetto a quello che succede nell’organismo, quindi spesso ci sono differenze con la situazione in vivo, viene infatti persa la struttura tridimensionale, le interazioni specifiche cellula-cellula e le caratteristiche istologiche del tessuto d’origine.

Vengono quindi a mancare tutte le componenti regolative che consentono la regolazione omeostatica dei tessuti in vivo: le cellule in vitro sono esposte a sostanze e stimoli diversi rispetto al vivo. Spesso in vitro inoltre le cellule perdono le proprietà differenziate che avevano nei tessuti di origine, per forte selezione a favore delle cellule più attivamente proliferanti.

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Le sostanze da testare in coltura possono interagire con i componenti del terreno di coltura; si ha inoltre una difficoltà nel correlare e concentrazioni attive in vitro con quelle in vivo.

Tipi di colture cellulari

• Colture a breve termine: il numero di cicli cellulari è ridotto, sono colture a vita finita (dopo un certo numero di cicli di divisione le cellule muoiono e la coltura si interrompe.
• Colture a lungo termine: cellule che si dividono molte volte o addirittura illimitatamente, e formano linee cellulari stabilizzate.
• Colture in monostrato: le cellule aderiscono al substrato (superficie del recipiente di coltura), per potersi dividere devono aderire al substrato, e questo avviene per la maggior parte delle cellule normali. Queste colture devono aderire ad un substrato, crescono e confluiscono a formare monostrati, ovvero le cellule aderiscono, si dividono e riempiono tutta la superficie disponibile del recipiente di coltura: nel monostrato le cellule saranno poi a contatto tra di loro (confluenti), dopodiché la crescita si arresta. Queste cellule andranno quindi staccate, diluite e ripiantate in un nuovo substrato, altrimenti la coltura si esaurisce. L’inibizione della crescita in un monostrato già confluente avviene per via dell’esaurimento dei fattori di crescita e il terreno si arricchisce di prodotti metabolici di scarto, e per l’inibizione da contatto: quando le cellule arrivano a contatto la crescita si arresta.
• Colture in sospensione: alcune cellule normali, come cellule ematopoietiche o cellule trasformate non devono crescere in monostrato ma in sospensione.
• Colture primarie: prima coltura che si fa, cellule che derivano direttamente dall’organo/tessuto/campione da cui le si preleva.
• Linee cellulari a breve termine: a vita finita.
• Linee cellulari continue: possono essere tumorali (trattamento con cancerogeni) oppure non tumorali, per mutazioni spontanee o indotte con agenti chimici o biologici.
• Linee ingegnerizzate: trasfettate con un gene particolare di interesse.
• Linee cellulari clonali: una sola cellula in coltura viene fatta proliferare, si formano cloni, cellule tutte uguali.

Colture primarie

Colture primarie → Si effettua un prelievo, nel caso si parta da un organo o da un tessuto le cellule devono essere disgregate con metodi meccanici o enzimatici (sospensioni cellulari miste possono essere separate per centrifugazione, proprietà peculiari delle cellule, separatori cellulari, uso di terreni selettivi…), dopodiché le cellule vengono raccolte e seminate in un terreno di coltura (in piastra o in sospensione).

I tessuti embrionali sono più facili da disgregare e proliferano maggiormente. Le cellule delle colture primarie conservano le caratteristiche del tessuto da cui originano; il successo della coltura primaria dipende dall’età, dalle specie e dal tessuto di provenienza.

Dopo la prima confluenza della coltura primaria per continuare a mantenere le cellule si effettua una sub-coltura, con cui si originano colture secondarie, terziarie… Le cellule vengono staccate dal substrato con enzimi proteolitici e poi riseminate in minore densità in un nuovo terreno. Man mano che le colture si susseguono diventano più omogenee, quella primaria è la più eterogenea (cellule meno forti di altre, che non si dividono). La frequenza delle sub-colture dipende da quanto in fretta replicano le cellule e da quanto rapidamente esauriscono i nutrienti del terreno: dipende dal tipo di linea cellulare.

13/03 Curva di crescita delle cellule in vitro

La curva di crescita di una popolazione cellulare in vitro (dal momento dell’inoculo in un nuovo recipiente di coltura) divisa in 4 fasi di diversa durata in cellule diverse:

1. Fase di latenza (lag) → fase di crescita lenta che intercorre tra la semina e la ripresa della crescita;
2. Fase di crescita esponenziale;
3. Fase stazionaria → la coltura diventa confluente e rallenta la proliferazione, il numero di cellule rimane pressoché invariato;
4. Fase di senescenza, decadimento e morte → la coltura tende più o meno velocemente ad esaurirsi, quindi occorre fare sub-colture.

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Linee cellulari

Si ottengono per sub-coltura da colture primarie oppure da cellule immortalizzate attraverso mutazioni spontanee o indotte; si possono inoltre distinguere tre tipi di linee cellulare:

• A breve termine (a vita finita) → tutte le cellule normali che dopo un tot di sub-colture si esauriscono; resistono in coltura un numero limitato di cicli cellulari, crescono in monostrato, risentono dell’inibizione da contatto e hanno una forte dipendenza da siero e fattori di crescita. La loro vita finita è in relazione al numero di passaggi e non al tempo di coltura, varia a seconda del tipo cellulare e dell’età dell’organismo da cui derivano (da 20 passaggi per l’adulto a 50 per l’embrione).
• Continue → ottenute da cellule immortalizzate, a vita infinita. Originano da mutazioni spontanee o indotte a partire da colture primarie o linee cellulari a vita finita, possono anche essere ottenute a partire da tessuti tumorali (es. HeLa). In questi tipi di cellule trasformate a cr