Biochimica dei sistemi, terzo modulo Biochimica

Biochimica dei sistemi: sistemi di regolazione enzimatica

All’interno di una cellula la maggior parte degli enzimi seguono la cinetica di Michaelis-Menten e catalizzano reazioni reversibili, quindi reazioni in cui si ha una variazione di energia libera pari a 0. Queste reazioni non possono essere utilizzate per compiere lavoro chimico e non possono essere utilizzate per decidere la direzione di una via metabolica.

Almeno una, due o tre tappe di una certa via metabolica sono date da reazioni irreversibili catalizzate da un enzima di tipo regolatorio, anche detto segna-passo, che la cellula è in grado di controllare influenzando la sua attività catalitica. Durante la descrizione delle vie metaboliche abbiamo indicato alcuni degli enzimi segna-passo; tra questi ricordiamo l’esochinasi HK, la fosfofruttochinasi1 PKF1, la piruvato chinasi PK (enzimi della glicolisi) o il glucosio-6-fosfato deidrogenasi G6PH (enzima della via dei pentoso fosfati). Altri esempi sono l’aspartato transcarbamilasi e la glicogenofosforilasi e la glicogenosintasi (enzimi dimerici presenti nel metabolismo del glicogeno).

La cellula controlla l’attività di un enzima in vari modi:

Meccanismo di controllo ligando mediato o allosterico

La cellula può regolare l’attività di un enzima segna-passo attraverso dei ligandi, cioè delle molecole che sono in grado di interagire in maniera specifica con l’enzima. Queste molecole, dette effettori allosterici o modulatori allosterici, sono in grado di legarsi al sito regolatore dell’enzima inducendo un lieve cambiamento conformazionale dell’enzima stesso, tale da aumentarne o diminuirne l'attività catalitica. Gli effettori allosterici che aumentano l’attività catalitica di un enzima, vengono detti attivatori, mentre quelli che ne diminuiscono l’attività catalitica, vengono detti inibitori.

Per cui, la modulazione allosterica può essere positiva o negativa.

Tipi di inibitori

Gli inibitori possono essere:

• Competitivi: sono strutturalmente simili al substrato e competono con esso per il sito di legame dell’enzima. Questi enzimi non modificano la Vmax dell’enzima, ma ne aumentano la Km.
• Non competitivi.
• Misti.

Gli inibitori possono essere:

• Reversibili: si legano all’enzima attraverso legami deboli, per cui possono essere rimossi.
• Irreversibili: si legano all’enzima attraverso legami covalenti o forti, per cui non possono essere rimossi. Tra questi troviamo:
  • Aspirina, che trasferisce il suo gruppo acetilico al residuo di serina posto nel sito catalitico dell’enzima ciclossigenasi (COX).
  • Penicilline, che presentano un gruppo carbossilico che è in grado di formare un legame estere stabile con il gruppo alcolico della serina della transpeptidasi batterica.
  • Organofosfati, nello specifico insetticidi e gas nervini, che sono in grado di formare legami stabili con la serina presente nel sito catalitico dell’acetilcolinesterasi.

Enzimi allosterici e stati conformazionali

Gli enzimi allosterici sono sempre oligomerici, ovvero costituiti da più subunità (tra le 2 e le n unità), e possono esistere in due diversi stati conformazionali, T ed R, in equilibrio tra loro.

• La forma T (tesa) è quella a bassa affinità per il substrato, meno attiva e più stabile.
• La forma R (rilassata) è quella ad alta affinità per il substrato, più attiva e meno stabile.

L’equilibrio tra queste due forme viene modificato dal legame dell’effettore allosterico negativo o positivo al sito regolatore dell’enzima. L’effettore allosterico positivo stabilizza la forma R, mentre quello negativo stabilizza la forma T. Quindi, se l’enzima si trova nella forma R o nella forma T dipende dalla concentrazione dell’effettore allosterico negativo e di quello positivo.

In assenza di modulatori l’enzima non è particolarmente attivo, perché l’equilibrio conformazionale favorisce la forma T, che è molto più stabile della forma R.

La cellula può controllare la concentrazione degli effettori allosterici.

Vedremo un esempio importante del controllo della quantità di effettore allosterico per quanto concerne il controllo della via che utilizza il glucosio (glicolisi) e che lo produce (gluconeogenesi). Queste due vie metaboliche avvengono nella stessa cellula, ma non possono e non devono avvenire contemporaneamente, altrimenti si innescherebbe un ciclo metabolico futile, la cui funzione sarebbe deleteria e svantaggiosa per la cellula, in quanto porterebbe solo ad un inutile dispendio di energia metabolica sotto forma di idrolisi di ATP.

Via metabolica di sintesi delle pirimidine

Il prodotto finale di questa via, nonché inibitore allosterico della prima reazione, è la citidina trifosfato (CTP), un ribonucleotide trifosfato composto da tre gruppi fosfato, il ribosio (uno zucchero fosfato) e la citosina (una base azotata pirimidinica). La prima reazione della via è catalizzata dall’aspartato transcarbamilasi (ATCasi), un enzima allosterico che utilizza come substrati l’aspartato e il carbamilfosfato.

Se la quantità di citidina trifosfato nella cellula è già abbastanza alta, tale molecola si lega al sito regolatore dell’enzima andando ad impedire la prima reazione. In questo modo la cellula evita di spendere energia metabolica per produrre qualcosa che non le serve (la via è composta da 7 tappe, le tappe dalla 2 alla 7 consumano energia).

Essendo un enzima allosterico, l’aspartato transcarbamilasi è formato da più subunità ed esiste in 2 stati conformazionali in equilibrio tra loro. Si notino le frecce di diversa dimensione: quella più grande è quella che indica la forma T, a suggerire che questo equilibrio conformazionale normalmente privilegia la forma meno attiva.

Il grafico ci mostra la curva della velocità iniziale di reazione in funzione della concentrazione del substrato dell’enzima in presenza di un attivatore allosterico (ATP), in presenza di un inibitore allosterico (CTP) e in assenza di modulatori allosterici:

• Sulle ascisse troviamo la concentrazione di substrato [S] dell’enzima ATCasi.
• Sulle ordinate troviamo la velocità iniziale (Vo) della reazione.

Gli enzimi allosterici non seguono la cinetica di Michaelis-Menten: la curva della velocità iniziale di reazione in funzione della concentrazione del substrato per gli enzimi allosterici ha un andamento sigmoide e non iperbolico.

L’ATP è un nucleotide purinico, mentre la CTP è un nucleotide pirimidinico. Secondo Watson e Crick la cellula ha bisogno di quantità uguali di nucleotidi purinici e pirimidinici per poter replicare il DNA.

Quando la quantità di ATP nella cellula è più elevata di quella del CTP, l’ATP si lega preferibilmente alla forma R dell’enzima (forma più attiva) andando a modificare le sue caratteristiche cinetiche. La curva della velocità iniziale di reazione in funzione della concentrazione del substrato in presenza di ATP si sposta verso sinistra. Quando la curva si sposta verso sinistra la Km diminuisce e la Vmax aumenta. La quantità di citidina trifosfato che viene prodotta in presenza dell’effettore allosterico positivo è elevata.

Il prodotto finale della via viene utilizzato dalla cellula per inibire in modo allosterico l’enzima che lo produce. Questo è un meccanismo di retroazione di tipo negativo (feedback negativo), perché il prodotto della via retroagisce sull’enzima che permette di produrlo in modo negativo, in modo da opporsi alla sua stessa produzione. Questo meccanismo si innesca nel momento in cui si accumula nella cellula abbastanza citidina trifosfato.

Quando la quantità di CTP nella cellula è più elevata di quella dell’ATP, il CTP si lega preferibilmente allo stato T dell’enzima (forma meno attiva) andando a modificare le sue caratteristiche cinetiche. La curva della velocità iniziale di reazione in funzione della concentrazione del substrato in presenza di CTP si sposta verso destra. Quando la curva si sposta verso destra la Km aumenta e la Vmax diminuisce.

Quindi, a parità di concentrazione del substrato (aspartato), si ha un aumento della velocità iniziale di reazione in presenza di un modulatore allosterico positivo, mentre si ha una diminuzione della velocità iniziale di reazione in presenza di un modulatore allosterico negativo.

• Assenza di modulatori o effettori allosterici -> ATP = CTP = 0, Vo [s] = x.
• Presenza di ATP come modulatore o effettore allosterico -> ATP > CTP, Vo [s] >> x.
• Quantità di prodotto (CTP) maggiore di quella dell’enzima (ATP) e successivo innesco del meccanismo a feedback negativo -> CTP > ATP, Vo [s] << x.

Ecco come controllando due metaboliti importanti legati alla stessa via funzionale, la cellula è in grado di bilanciare esattamente la velocità con cui questa strada deve essere percorsa.

Questo è il meccanismo più rapido: avviene in frazioni di secondo, millisecondi o microsecondi. La tempistica varia a seconda della diffusività delle molecole all’interno della cellula, dalla possibilità dell’enzima di incontrare il modulatore allosterico e legarsi ad esso.

Modificazione covalente degli enzimi segna-passo

La cellula può regolare l’attività di un enzima segna-passo attraverso l’aggiunta o la rimozione di gruppi chimici. Modificando la struttura di un enzima è possibile aumentarne o diminuirne l’attività. La modificazione covalente degli enzimi segna-passo può avvenire in modo:

• Reversibile.

Ci sono diversi meccanismi di regolazione covalente reversibile, ma noi vedremo soltanto il ciclo di fosforilazione e defosforilazione dell’enzima target o bersaglio.

La fosforilazione e la defosforilazione di un enzima bersaglio è operata da due enzimi diversi:

Chinasi

Le chinasi sono enzimi appartenenti alla classe delle transferasi che trasferiscono il gruppo fosfato dall’ATP a uno specifico residuo dell’enzima bersaglio. Questi enzimi, in particolare, vanno a fosforilare residui amminoacidici che presentano un gruppo alcolico:

• Serina (Ser) e Treonina (Thr), che sono riconosciute dalla Serina/Treonina chinasi (I classe di chinasi modificanti).
• Tirosina (Tyr), che è riconosciuta dalla Tirosina-chinasi (II classe di chinasi modificanti).

La tirosina presenta un ossidrile alcolico di tipo fenolico.

Queste sono alcune delle chinasi che dobbiamo ricordare:

• PKA (protein chinasi A), attivata da cAMP.
• PKB (protein chinasi B).
• PKC (protein chinasi C), attivata dal calcio.
• Glicogenofosforilasi chinasi.
• PKSI (protein chinasi sensibile all’insulina).
• GSK3 (glicogenosintasi chinasi 3).

È importante ricordare che le diverse chinasi riconoscono specifiche sequenze consenso per la fosforilazione di specifiche proteine bersaglio. Questo fa in modo che le chinasi fosforilino la proteina solo nelle regioni opportune.

Nella tabella:

• X può essere un qualsiasi amminoacido.
• B può essere un qualsiasi amminoacido idrofobico.

Le diverse proteine chinasi che sono state indicate nella tabella (PKA, PKB, PKC) sono delle Serina/Treonina chinasi. Queste non hanno come bersaglio una singola proteina, ma ne hanno diverse. Una volta attivate, vanno ad agire su particolari Serine o Treonine, che fanno parte di una sequenza di amminoacidi (costituita da 1 a 6 amminoacidi, a seconda della chinasi) con caratteristiche ben precise.

La PKA, ad esempio, per poter agire ha bisogno di una sequenza formata dagli amminoacidi basici (Arginina R e Lisina K), una serina, una treonina e un amminoacido idrofobico. Se manca uno di questi amminoacidi, la sequenza non risulta completa e la proteina non viene fosforilata.

La PKSI (Insuline receptor kinase) è una tirosina chinasi. Infatti, il bersaglio di questo enzima non è una Serina o una Treonina, ma una Tirosina (Y). In questo caso, la capacità di riconoscimento della sequenza specifica è ancora più elevata ed è molto più stringente. Solo le proteine che presentano questa specifica sequenza di amminoacidi vengono fosforilate dall’enzima.

La complessità di questo meccanismo di regolazione la si può vedere osservando il modo in cui viene attivato un enzima importante nel metabolismo del glicogeno, ovvero il glicogeno sintasi. Quando parleremo del metabolismo del fegato e del muscolo vedremo una via specifica di questi due organi, ovvero la sintesi del glicogeno. Ebbene, nel controllo della sintesi del glicogeno, il glicogeno sintasi è l’enzima segna-passo.

Se si estende la sequenza primaria del glicogeno sintasi ci si accorge che su questa struttura primaria ci sono diversi punti di fosforilazione: abbiamo 8 diversi siti o punti di fosforilazione su cui possono agire le varie chinasi prima elencate.

Ad esempio:

• La PKA può fosforilare l’enzima sul sito 1A, 1B, 2, 4.
• La PKC può fosforilare l’enzima sul sito 1A.
• La fosforilasi chinasi b può fosforilare l’enzima sul sito 2.

A seconda delle chinasi che la cellula possiede e a seconda di quale chinasi la cellula attivi, si avrà un differente profilo di fosforilazione di questo enzima. L’enzima modificato covalentemente in queste varie regioni sarà più o meno attivo, a seconda del particolare meccanismo di controllo.

Fosfatasi

Le fosfatasi sono enzimi appartenenti alla classe delle idrolasi che catalizzano la rimozione di gruppi fosfato. In questo caso, le fosfatasi vanno a riconoscere in modo sequenza-specifico e a rimuovere dall’enzima target il gruppo fosfato aggiunto dalle chinasi, idrolizzando il legame fosfoestere che tiene unito il fosfato all’enzima.

In questo modo l’enzima viene ripristinato nella sua forma non modificata.

Queste sono alcune fosfatasi che dobbiamo ricordare:

• Proteina fosfatasi 1 (PP1).
• Fosfodiesterasi (PDE).

In questo caso la fosforilazione attiva l’enzima, mentre la defosforilazione inattiva l’enzima. Questo però non vale per tutti gli enzimi.

La fosforilazione, inoltre, su un sito può attivare l’enzima, mentre sull’altro può spegnere, perché uno stesso enzima target può avere più ossidrili fosforilabili.

• Irreversibile.

Regolazione irreversibile e zimogeni

Alcuni enzimi sono regolati per scissione proteolitica di uno zimogeno.

Si definisce zimogeno qualsiasi precursore cataliticamente inattivo di un enzima. Esso, per divenire un enzima attivo, richiede la rottura di uno o più legami peptidici specifici.

La necessità della presenza di zimogeni per l'organismo è legata al fatto che esistono numerose funzioni fisiologiche che devono verificarsi soltanto sotto particolari condizioni, come la digestione, la coagulazione del sangue o l'attivazione del sistema del complemento o dell'apoptosi.

Tra gli zimogeni abbiamo:

• Zimogeni ematici (si trovano nel sangue) →
  • Fattore IX è una serin proteasi;
  • Protransglutaminasi (fattore XIII) è un enzima che stabilizza la struttura della fibrina formando legami isopeptidici tra i residui di lisina e di glutammina;
  • Protrombina precursore inattivo della trombina.

Cascata della coagulazione del sangue

La coagulazione del sangue è un meccanismo autocatalitico a feedback positivo.

La cascata della coagulazione è un processo caratterizzato dall'attivazione sequenziale di una serie di fattori, chiamati fattori della coagulazione.

Si definisce "cascata" in quanto ciascun fattore coinvolto svolge la funzione di attivatore del fattore che viene dopo.

La cascata della coagulazione si conclude con la formazione della rete di fibrina che intrappola le cellule del sangue originando il coagulo.

Esistono, però, due differenti strade che possono portare a quest'ultima fase: la via estrinseca e la via intrinseca. Tali vie si differenziano per l'agente causale che le innesca e per il numero di fattori che vi sono implicati.

Via estrinseca

La via estrinseca viene attivata in presenza di un danno o trauma tissutale ed è la via più veloce in quanto prevede l'attivazione di un minor numero di fattori della coagulazione.

1. Dalle cellule danneggiate dal trauma tissutale si liberano fosfolipidi e un fattore noto come fattore tissutale della coagulazione (o tromboplastina tissutale o fattore III).
2. Il fattore VII (o proconvertina) si lega al fattore tissutale, attivandosi in fattore VIIa (o convertina).
3. Il fattore X (o fattore Stuart-Prower) viene attivato in fattore Xa dal complesso fattore tissutale/fattore VIIa o complesso estrinseco attivatore del fattore X.

Da questo momento in poi iniziano le fasi in comune con la via intrinseca:

4. Il fattore Xa, insieme al fattore Va, fosfolipidi e ioni calcio forma un complesso (l'attivatore della protrombina) che porta alla trasformazione della protrombina (o fattore II) in trombina (o fattore IIa).
5. La trombina porta alla conversione del fibrinogeno (o fattore I) in fibrina (fattore Ia) agendo come un enzima proteolitico. Al contempo, la trombina attiva il fattore V, il fattore VIII, il fattore XI e il fattore XIII.
6. Il fattore XIIIa (o fattore stabilizzante la fibrina o trans-glutaminasi plasmatica) catalizza la formazione di legami covalenti fra i monomeri di fibrina adiacenti precedentemente formatisi per rafforzare e stabilizzare i coaguli di fibrina (fibrina cross-linked).
7. La fibrina costituisce una sorta di rete nella quale vengono intrappolate le cellule del sangue e si forma il coagulo.

Via intrinseca

La via intrinseca prevede l'attivazione di più fattori rispetto a quella estrinseca e, per tale ragione, risulta essere più lenta. Essa si attiva quando il sangue entra in contatto con una superficie diversa da quella vasale.

A differenza della via estrinseca, la via intrinseca