Biochimica clinica e biologia molecolare

Patologia diagnostica clinica o biochimica clinica: sinonimi di medicina di laboratorio

Il prelievo venoso come pratica medica risale ai tempi di Ippocrate, praticato da personale non qualificato ma che svolgeva attività da saloni. Esistevano saloni di barbiere dove al di fuori venivano posti dei pali con strisce bianche e rosse, che indicavano un punto di prelievo venoso. Consisteva in una pratica rudimentale attraverso un’incisione, quantità enorme prelevata con lo scopo di ricerca di una causa per una sintomatologia del paziente e studio dei materiali biologici.

Alla fine della seconda guerra mondiale, con l’introduzione delle provette, il prelievo inizia ad essere una procedura medica sicura. Ai nostri tempi vi sono strutture a sé dove vengono svolte analisi su materiali biologici. Ad esempio, la provetta di sangue venoso imput: materiale biologico → processo di analisi richieste dal medico → output: referto che contiene tutte le informazioni relative ad una serie di esami. Sul referto vi sono tutte le informazioni relative al paziente e vengono riportati gli esiti con un range di valori di riferimento di normalità.

Valutazione e diagnosi

Il miglior modo di valutare

Esempio 1: signore con ittero cutaneo e sclerale da due giorni, vengono effettuati i valori ematochimici che evidenziano transaminasi e bilirubina elevati.

• Accertamenti eseguiti: esami ematochimici
• Diagnosi riscontrata: Il paziente viene ricoverato con diagnosi di epatite acuta A.
• Terapia effettuata: idratazione

Esempio 2: paziente di 46 anni accede in PS presentando dolore addominale, nausea e vomito. Vengono eseguiti esami emocromocitometrici ed elettroforesi proteine sieriche.

• Presenza antigeni epatite B elevati

Esempio 3: donna di 82 anni che da alcuni giorni presenta un rallentamento ideo-percettivo e motorio, viene eseguita una TAC al cranio e si evidenzia un piccolo angioma. Vengono eseguiti gli esami emocromocitometrici dai quali si evidenziano leucocitosi e neutrofilia. Valore più preoccupante glucosio nettamente superiore ai valori di riferimento.

• Emoglobina elevate + tampone salivare che evidenzia una infezione batterica.

Esempio 4: uomo di 71 anni che presenta dolore retrosternale e sudorazione algida. Viene eseguito elettrocardiogramma normale e un esame per la troponina T 170.

• Troponina T è un marcatore selettivo e specifico per il miocardio utilizzato per rilevare la sindrome coronarica acuta.

Esempio 5: dolore fianco sinistro e iperpiressia.

• Aspetto campione urine: torbido

Esempio 6: paziente ambulatoriale, viene eseguito un campione ematochimico. Si evidenzia un numero elevato di leucociti e numero elevato di batteri → sospetta infezione alle vie urinarie. Si prosegue con urinocoltura → isolato batterio Escherichia coli.

Iter che deve seguire un medico

• Storia clinica del paziente
• Esame obiettivo
• Esami strumentali (TC, RX, RM)
• Esami di laboratorio

Le informazioni servono a stabilire: lo stato di malattia del paziente, la gravità della condizione clinica, la velocità e le opportune modalità per intervenire.

Scopi della medicina di laboratorio

• Promozione della salute
• Valutazione dei fattori di rischio compresi quelli connessi con l’ambiente
• Prevenzione delle malattie
• Individuazione di una malattia in fase preclinica o ai primi stadi della malattia
• Diagnosi e/o conferma diagnostica delle malattie
• Valutazione di gravità o prognosi e stadiazione delle malattie

Segue

• Monitoraggio delle malattie
• Produzione dati per indagini epidemiologiche
• Valutazioni di tipo medico-legale
• Ricerca
• Insegnamento

Efficacia dello screening colorettale con ricerca del sangue occulto fecale (Sof)

Esistono sufficienti evidenze provenienti da studi randomizzati e da studi caso-controllo che documentano l’efficacia dello screening mediante ricerca del sangue occulto fecale nella riduzione della mortalità per questa patologia.

Parti che costituiscono il referto

Nome test, esito, unità di misura, range di valori (di normalità) e metodo.

Materiale biologico

• Plasma, siero, sangue intero
• Urine → campione estemporaneo o delle 24 ore
• Feci

Vengono ricercati problemi a livello renale o ricerca di infezioni renali o cellule di natura neoplastica. Richiesto per sospetto di infezione da parassiti.

• Liquidi:
  • Liquido amniotico
  • Liquido ascitico (peritoneale)
  • Liquido cefalo-rachidiano → per sospetto di meningite, meningococco
  • Liquido pericardico → sospetto di infezione o processo di natura neoplastica
  • Liquido pleurico
  • Liquido seminale → infertilità
  • Liquido sinoviale → per escludere un processo infiammatorio

Tamponi

Secreti: faringeo, nasale, auricolare, oculare, uretrale, vaginale, da ferita. Esami colturali per escludere infezioni da ceppo patogeno.

Altri materiali sottoposti ad indagini

• Calcolo renale: esame chimico per la composizione oppure esame cristallografico.
• Secreto bronchiale, aspirato/lavaggio tracheo-bronchiale e bronco-alveolare (BAL): esame colturale e citologico
• Sudore: si valuta la concentrazione del cloro
• Capelli, saliva → indagini di natura tossicologica, medico legale
• Tessuti solidi → esami istopatologici, immunoistochimici
• Midollo osseo → esami morfologici e istopatologici o analisi genetiche (cromosomiche, riarrangiamenti, mutazioni, ecc.)

Sistema internazionale di unità di misura

Il sistema internazionale di unità di misura è stato introdotto nel 1960 dalla XI Conferenza Generale dei Pesi e Misure e perfezionato dalle Conferenze successive. Il SI è oggetto di direttive della Comunità Europea fin dal 1971, ed è stato legalmente adottato in Italia nel 1982. Le unità e gli elementi del sistema SI vengono stabiliti dalla “Conference Generale de Poids et Mesures”.

Valori di riferimento possono essere individuali o di gruppo. A priori si selezionano i soggetti di riferimento. Popolazione di riferimento: popolazione da cui sono ottenuti i valori di riferimento.

Valori di riferimento

Serie di valori ottenuti da una popolazione di riferimento. Ad esempio, il valore della bilirubina in ognuno dei soggetti che costituiscono la popolazione di riferimento.

Intervallo di riferimento

Intervallo di valori ottenuto dal gruppo dei valori di riferimento. Di norma esso rappresenta l'intervallo centrale 95% di tutti i valori ottenuti. Di conseguenza, il limite di riferimento superiore sarà rappresentato dal 97.5 percentile, mentre quello inferiore dal 2.5 percentile.

I percentili sono quegli elementi che dividono una distribuzione ordinata in parti uguali, ciascuna delle quali contiene l’x per cento della distribuzione. Il percentile può anche essere definito come quel dato valore sotto il quale, in una distribuzione ordinata, cade una determinata percentuale di osservazioni: ad esempio, il 97.5 percentile è quel valore sotto il quale cade il 97.5% delle osservazioni.

La curva gaussiana permette il confronto tra i soggetti sani e malati. Zona grigia soggetti con valori che cadono al limite del range. Se un risultato è al di fuori dell’intervallo di riferimento, si può concludere che:

• Il paziente è ammalato
• Il paziente è sano ma:
  • Statisticamente a valori estremi
  • Con caratteristiche demografiche differenti rispetto alla popolazione di riferimento
  • Ha svolto precedentemente la raccolta del campione una qualche attività in grado di determinare un risultato non compreso nell'intervallo di riferimento

Valori critici o valori di panico

I risultati di laboratorio fuori dai limiti di riferimento, a livelli tali da indicare una condizione potenzialmente pericolosa per il paziente e che richiedono un’immediata considerazione da parte del clinico.

Caratteristiche dei metodi di laboratorio e gli errori

Compito fondamentale del laboratorio è quello di fornire risultati attendibili. Col termine di attendibilità si indica la qualità che caratterizza in modo globale un risultato analitico. È importante però ricordare che chiunque effettui o interpreti le misure commette errori. Col termine di errore si intende la differenza tra il valore ottenuto e il valore “vero”.

Errori di misura relativi alla diagnostica di laboratorio

Si distinguono in:

• Errori pre-analitici: fuori dal laboratorio
• Errori analitici: in laboratorio
• Errori post-analitici: in laboratorio e fuori da laboratorio

La maggior parte degli errori si verificano nella fase pre-analitica (68%), segue la post-analitica (18%) e l’analitica (14%). Gli errori preanalitici sono sostanzialmente legati a due fattori:

• La variabilità biologica è propria dell’individuo o degli individui di una popolazione e si distingue in:
  • Variabilità biologica intraindividuale: ampiezza delle oscillazioni intorno ad un proprio punto di equilibrio omeostatico
  • Variabilità biologica interindividuale: differenza tra i punti omeostatici in diversi individui appartenenti alla stessa popolazione

Cause di variabilità biologica

• Variazioni stagionali
• Età e sesso
• Razza
• Ciclo mestruale
• Gravidanza
• Tipo di dieta
• Assunzione di certe bevande (caffè, frutti o alcool)
• Massa corporea
• Postura/posizione
• Esercizio fisico e affaticamento
• Disturbi del sonno, stati di ansia
• Affaticamento fisico
• Immobilizzazione forzata
• Fumo di tabacco
• Localizzazione geografica e fattori ambientali
• Terapie farmacologiche
• Ingestione recente di cibo

Metodologia di preparazione del paziente all'esame

La raccolta, l'identificazione, la conservazione e il trasporto del campione.

Gli errori analitici che si verificano in laboratorio

Gli errori analitici che si verificano in laboratorio sono:

• Errori grossolani se avvengono durante:
  • Identificazione del campione
  • Calcolo e/o trascrizione del risultato
  • Unità di misura impropria
  • Calibrazione o reagente sbagliato
• Errori casuali se:
  • Responsabile dell’imprecisione analitica
  • Riducibile ma non eliminabile completamente
  • Sorvegliato col controllo di qualità interno
  • Rilevato con metodi statistici
• Errori sistematici:
  • Responsabili dell’inaccuratezza analitica
  • Responsabili di sovrastima o sottostima (costante o proporzionale) dei risultati
  • Sorvegliato col controllo qualità esterno
  • Rilevato con metodi statistici

Affidabilità

Il risultato sul referto deve essere il più attendibile possibile.

Variabilità preanalitica

Procedure per ridurre il rischio.

Variabilità analitica

Non si può eliminare del tutto ma si può ridurre.

Gli errori post-analitici

Gli errori post-analitici che si verificano in laboratorio riguardano l’errata attribuzione di un referto ad un paziente e ritardi nella consegna dei risultati, mentre quelli che si verificano al di fuori del laboratorio includono un'errata trascrizione dei risultati nella cartella clinica o interpretazioni errate dei risultati di laboratorio.

Il valore ottenuto con un dosaggio di laboratorio si avvicina tanto più al suo valore vero quanto più il metodo utilizzato è preciso e accurato.

Precisione di un metodo analitico

È la concordanza tra i risultati di una serie di repliche eseguite sullo stesso campione. Può essere espressa anche in termini di “imprecisione” (la dispersione delle misure dei replicati) che è rappresentata quantitativamente dalla deviazione standard (DS) e dal coefficiente di variazione (CV%) ossia dalla dispersione dei dati attorno al valore medio.

Accuratezza

È la concordanza tra i risultati ottenuti e il valore vero. Può essere espressa anche come inaccuratezza (in inglese bias) rappresentata qualitativamente dalla differenza numerica fra il valore ottenuto (o la media di una serie di repliche) ed il valore vero.

Specificità

È la proprietà di dosare esclusivamente la sostanza in esame. Un metodo poco specifico può dare dei falsi positivi.

Sensibilità

È la più piccola quantità di sostanza che il metodo riesce a dosare, cioè a distinguere sicuramente da zero. Un metodo poco sensibile può dare dei falsi negativi.

Valore predittivo

Il confronto del dato di laboratorio ottenuto con un valore soglia o un intervallo di riferimento consente di dividere la popolazione dei soggetti con o senza malattia nelle seguenti categorie: mediante i quattro gruppi di soggetti identificati si calcolano le prestazioni diagnostiche di un marcatore (test).

I precedenti concetti si possono esprimere in termini matematici. Ai fini medici, sono importanti il valore predittivo positivo e il valore predittivo negativo di un test che si possono calcolare conoscendo la prevalenza di una malattia.

Prevalenza di una malattia

Numero di soggetti affetti dalla malattia su 100, 1000, 10000 persone.

Incidenza

Numero di nuovi soggetti che in un certo periodo (ad esempio un anno) contraggono la malattia su 100, 1000, 10000 persone. Quindi: Prevalenza = incidenza x durata della malattia.

Variabili preanalitiche

Per variabili preanalitiche si intendono tutte quelle componenti che possono alterare il risultato (errore preanalitico) di un test intervenendo prima della determinazione dell’analisi. Sono sostanzialmente legate a due fattori:

• La variabilità biologica propria dell’individuo o degli individui di una popolazione (intraindividuale e interindividuale)
• La metodologia di preparazione del paziente all'esame, la raccolta, l’identificazione, la conservazione e il trasporto del campione

Raccolta dei campioni

Sangue

• Posizione del paziente
• Disinfettante
• Applicazione del laccio
• Sede e tipo di prelievo
• Anticoagulanti e preservanti

Urine

Fattori fisiologici che influenzano la composizione dei fluidi corporei

• Variabili biologiche controllabili
• Variabili biologiche non controllabili
• Interferenze

Prima del prelievo bisogna raccogliere informazioni attraverso alcune semplici domande sul digiuno, assunzione dei farmaci, sull’attività fisica e orario del prelievo.

Identificazione del paziente

Quando si richiedono informazioni al paziente il professionista deve sollecitare una risposta verbale ponendo domande aperte che richiedono informazioni specifiche a cui non è possibile rispondere con un semplice sì o no. (es. “Come si chiama?, Quando è nato?”).

Identificazione del campione

1. Applica sempre le etichette corrette con codice richiesta alle provette, prima del prelievo.
2. Verifica sempre la corrispondenza dei dati anagrafici sulle etichette applicate alle provette e sul braccialetto del paziente.

Disinfettante

• È importante lasciare asciugare la zona di cute a cui si è applicato il disinfettante.
• Il disinfettante consigliato è l’isopropanolo al 70%, anche se si usano correntemente disinfettanti contenenti Sali d’ammonio quaternario.
• Vanno evitati disinfettanti contenenti iodio che interferiscono con molte procedure chimiche.
• Non si deve usare alcol se il campione è prelevato per il dosaggio dell’etanolo.

Procedura

• Usare una garza imbevuta con una soluzione di alcol isopropilico al 70%.
• Disinfettare l’area circostante la vena strofinando.
• Non limitare la disinfezione alla sola area di prelievo. Si consiglia di iniziare a strofinare nel punto del prelievo e ampliare la zona con movimenti circolari (alcuni studi consigliano anche la disinfezione con movimenti verticali).
• Lasciare asciugare prima di inserire l’ago.

Indicazioni per il laccio

• Per il prelievo venoso il laccio va applicato 10-15 cm sopra il punto previsto di puntura per ostruire il ritorno venoso e distendere le vene.
• Il laccio dovrebbe essere applicato per non più di un minuto.
• Il paziente non dovrebbe aprire e chiudere il pugno durante l’applicazione del laccio.
• Campioni su cui si deve dosare il lattato (acido lattico) o eseguire l’emogasanalisi si dovrebbero ottenere senza applicazione del laccio.

Implicazioni di scorretta applicazione del laccio

• Emoconcentrazione
• Attivazione piastrinica dovuta a stati venosa
• Reflusso di sangue dalla provetta nella vena del paziente che può verificarsi se la pressione del laccio emostatico è troppo alta