Biochimica clinica - Appunti (Biotecnologie mediche)

Biochimica clinica

Diabete mellito

Diabete mellito è una malattia cronica da alterato metabolismo di glucosio e altri substrati energetici, caratterizzata da iperglicemia dovuta a deficit (relativo o assoluto) nella produzione di insulina.

Il glucosio è l'unica fonte di energia per le cellule del sistema nervoso e gli eritrociti, circola in forma libera a una concentrazione di [70/100 mg/dL] mantenuta in equilibrio dall'azione di diversi ormoni, in particolare insulina e glucagone. Entra per diffusione facilitata nelle cellule tramite trasportatori GLUT, importanti sono:

• GLUT-2: sensore della glicemia nelle cellule β del pancreas
• GLUT-4: espresso nei tessuti insulino-dipendenti (tessuto adiposo e muscolare)

In seguito all'entrata nella cellula, il glucosio diventa Glucosio-6-P per impedirne l'uscita, e l'enzima coinvolto è l'esochinasi (esochinasi IV epatica non subisce inibizione da prodotto, infatti questo è il principale organo di accumulo).

Il glucosio in circolo:

• Dopo il periodo post assorbitivo (6/12h dopo pasto) aumenta la glicogenolisi epatica e la gluconeogenesi.
• Durante il digiuno prolungato (>15 giorni) deriva da fegato e rene, esaurite le riserve di glicogeno si utilizzano acidi grassi del tessuto adiposo per fegato e muscoli, mentre per sistema nervoso e tessuti anaerobici si utilizza gluconeogenesi e corpi chetonici come energia alternativa.

Importante nella regolazione del glucosio è il pancreas, che secerne:

• Insulina tramite le cellule β: L'insulina matura e il peptide C sono conservati nei granuli secretori delle cellule β per essere rilasciati su stimolo (es. iperglicemia). La secrezione di insulina è bifasica, con un picco precoce di insulina preformata e un picco tardivo con insulina sintetizzata ex novo. Questo ormone ha un'emivita di 6 minuti.
• Glucagone tramite cellule α: sintetizzato come pre-ormone, accumulato in vescicole secretorie, interviene quando c'è carenza di substrato (es. ipoglicemia), stimola glicogenolisi e gluconeogenesi nel fegato.

Classificazione del diabete

Il diabete è classificato come:

• Diabete mellito primario (tipo I e tipo II)
• Diabete secondario, complicanza di altre patologie, legato a malattie pancreatiche, endocrinopatie, farmaci (corticosteroidi), sindromi genetiche (rare), anomalie dell'insulina e dei suoi recettori.
• Forme intermedie: LADA, NIRAD e MODY
• Ridotta tolleranza al glucosio
• Diabete gestazionale

Diabete tipo I

Il diabete tipo I è causato da distruzione di cellule β su base autoimmune idiopatica (malattia che non si accompagna ad altri processi morbosi e di cui non si conosce la causa), con assoluta carenza di insulina. Ha predisposizione genetica e l'esposizione a diversi fattori ambientali innesca una risposta autoimmune che causa la progressiva distruzione delle cellule β e determina insulite (infiammazione isole di Langerhans, sede delle cellule β). Questo processo è caratterizzato da aumento cronico della glicemia, fino all'iperglicemia.

Si ipotizza che la risposta autoimmune iniziale danneggi solo parzialmente le cellule poiché i linfociti hanno solo un antigene target, ma diventi più aggressiva nel momento in cui le cellule danneggiate rilasciano all'esterno prodotti di degradazione a causa della lisi della parete. Questa risposta autoimmune può essere dovuta alla perdita del meccanismo di tolleranza per le molecole self oppure da un difetto della selezione linfocitaria a livello del timo.

La velocità di distruzione delle cellule β varia: nei bambini è veloce, negli adulti ha progressione lenta (LADA). La differenza tra LADA e diabete di tipo II è che la condizione della prima sfocia definitiva a una mancanza assoluta di insulina.

Fattori genetici e ambientali del diabete tipo I

Fattori genetici:

• Alleli dei geni DR e DQ presenti nei locus genici del HLA-II (complesso di immunoistocompatibilità di classe II) contribuiscono fino al 50% all'insorgere della malattia.
• Gene PTPN22 (coinvolto nella risposta immunitaria innata) e il gene dell'insulina (IDDM2).

Fattori ambientali:

• Virus: Enterovirus (Poliovirus, Coxsackievirus A e B ed Echovirus)
• Batteri: micobatteri
• Alimentazione: latte vaccino, sostanze diabetogene nella soia e nel frumento

Diagnosi differenziale tra diabete tipo I e II

Per differenziare il diabete tipo I dal diabete tipo II si considerano:

• Misurazione marcatori di autoimmunità ICA (vs cellule β), anti-GADA (carbossilasi dell'acido glutammico, marcatore precoce e non specifico perché questo enzima è presente in altri siti e cervello), anti-IA2 (proteina coinvolta nella secrezione di insulina) e anti IAAs (vs insulina)
• Tendenza alla chetosi

Diabete tipo II

Il diabete tipo II è caratterizzato da deficit parziale (mai totale) di secrezione insulinica che in genere progredisce nel tempo, caratterizzata da una condizione precedente di insulino-resistenza. È una malattia multifattoriale, nelle prime fasi determina iperplasia compensatoria (aumento del volume dell'organo per aumento del numero di cellule che lo compongono) delle cellule β, questo porta a un'iniziale ipersecrezione di insulina che da euglicemia (livelli normali di glucosio). Con il progredire della malattia si avrà iperglicemia per distruzione delle cellule secretorie.

La terapia iniziale è con metformina, successivamente si può passare all'utilizzo dell'insulina.

Insulino-resistenza

L'insulino-resistenza si misura con l'indice HOMA = ([glucosio] x [insulina] nel plasma)/22,5. I valori normali sono 0,23-2.5.

L'insulino-resistenza può essere dovuta a alterazioni del recettore, alterazioni di eventi post-recettoriali oppure obesità, quest'ultima ha un ruolo chiave nell'insorgenza, ecco alcuni possibili meccanismi che spiegano l'associazione obesità/insulino-resistenza:

• Eccesso acidi grassi liberi (FFA): l'obesità determina un iperaflusso di FFA, se le vie di metabolizzazione sono piene e non riescono a smaltirli, questi si accumulano nei tessuti bloccando il segnale insulinico.
• Infiammazione: nell'obesità il tessuto adiposo è sede di infiammazione cronica, quest'infiammazione libera citochine proinfiammatorie che aggravano la resistenza all'insulina.

Nota bene: sedi di accumulo grassi: obesità addominale sottocutanea, obesità addominale viscerale e obesità sottocutanea gluteo-femorale (quest'ultima è la meno pericolosa, perché ha meno tendenza all'insulino-resistenza, le donne sviluppano questa prima della meno pausa, dopo tendono ad assomigliare all'uomo e ad accumulare a livello addominale).

Diabete gestazionale

Il diabete gestazionale è un diabete diagnosticato in gravidanza, diverso dal diabete manifesto. Causato da difetti funzionali analoghi a quelli del diabete di tipo II, in genere regredisce dopo il parto per poi ripresentarsi.

L'insulino-resistenza che si instaura durante la gravidanza è fisiologica e finalizzata alla crescita fetale, ma un eccesso di nutrienti in circolo attraversa la placenta e determina secrezione maggiore di insulina da parte del feto (iperinsulinismo) che porta a un aumento del tessuto adiposo fetale.

L'iperinsulinismo può generare nel neonato la sindrome da stress respiratorio dovuta da parte dell'insulina all'inibizione di fosfatidilcolina, principale componente del surfattante polmonare.

MODY

MODY è una forma di diabete tipo II con esordio giovanile, forma monogenica a trasmissione autosomica dominante, dovuto a mutazioni nei geni importanti per lo sviluppo delle cellule β. Se ne conoscono 14 tipi, le forme più comuni sono la 2 e la 3.

• MODY2: dovuto a mutazione della glucochinasi (esochinasi che fosforila il glucosio all'interno della cellula in glucosio-6-P)
• MODY3: (70% dei casi) mutazione di HNF-1α, attivatore della secrezione di insulina e regolatore della secrezione del glucagone.

Diagnosi del diabete

I test per la diagnosi del diabete devono essere ripetuti almeno 2 volte:

1. Glicemia a digiuno (FPG) ≥126 (cioè a distanza di 8h dall'ultima ingestione di cibo o bevande). Il valore normale è 100, quello a rischio 100-125. Si utilizza per l'analisi il sangue venoso, non quello intero perché [glucosio] è 10-15% minore. Se il plasma non può essere immediatamente centrifugato dopo il prelievo, bisogna aggiungere al campione fluoruro di sodio, perché inibisce la glicolisi che altrimenti continuerebbe nel campione.
2. Sintomi legati al diabete (poliuria, polidipsia ed inspiegabile perdita di peso) e rilievo casuale (indipendentemente da ultimo pasto) di glicemia ≥200.
3. Glicemia ≥200 2h dopo OGTT (carico orale di glucosio: 75g glucosio + 300ml acqua). Il valore normale è <140, valore a rischio 140-199. Il test OGTT si svolge con un prelievo a digiuno e uno a 2h del carico orale. Nota bene: nelle donne in gravidanza questo test è importantissimo e si svolge con un prelievo a digiuno, uno dopo 1h dal carico orale e un altro dopo 2h dal carico orale, in tutto i prelievi sono 3.
4. HbA1c (emoglobina glicata) ≥48 mmol/mol (6,5%). Valore a rischio 5,7-6,4%. L'emoglobina glicata è indice di stato iperglicemico, è parametro che indica lo stato glicemico medio delle 8-12 settimane precedenti al prelievo. Il glucosio si lega a subunità degli eritrociti. Questo parametro è gold-standard per valutazione del complesso glicemico, efficacia della terapia (metformina) e il rischio di complicanze croniche.

Complicanze del diabete

Complicanze acute:

• DM1 → coma cheto-acidosico: innalzamento di [corpi chetonici] che porta a un pH acido del sangue (pH normale plasma 7.35-7.45). I corpi chetonici aumentano perché il sistema utilizza i grassi per la produzione di energia e non vi è più l'inibizione della lipasi che libera questi acidi nel sangue; inoltre, la continua gluconeogenesi porta a liberazione di lattato, un altro acido.
• DM2 → coma iperosmolare: grazie all'alta [glucosio] il glomerulo renale elimina parte di questo nelle urine, sottraendo acqua al sistema. Questo può portare a disidratazione e coma iperosmolare.

Complicanze croniche:

• Implicati grossi vasi → arteriosclerosi
• Implicati piccoli vasi → ulcere e cancrena (es. piede diabetico) favorite da neuropatia che porta alla perdita di sensibilità

Monitoraggio del diabete

• [Glucosio] nelle urine e in caso anche a livello plasmatico a digiuno. Il glucosio viene eliminato con le urine quando la [ ] plasmatica è >180, questo test può servire per monitorare un soggetto diabetico ma non per fare diagnosi.
• Chetoacidi → si misurano gli acidi più presenti acetoacetato e acido idrossibutirrico
• Emoglobina glicata
• Lipoproteine plasmatiche → DM1 e DM2 si associano anche a dislipidemie, nel DM1 trigliceridi alti, LDL↑ HDL↓. Nel DM2 trigliceridi alti, LDL non molto alterate e HDL↓.
• Albuminuria = presenza di albumina nelle urine. Normale <30mg nelle 24h. Microalbuminuria: 30-300 mg nelle 24h. Albuminuria clinica >300/24h → indice di danno renale, dove il glomerulo non filtra proteine plasmatiche anche di grandi dimensioni. Il glomerulo filtra le proteine, il filtro in questione a livello di grandezza potrebbe permettere il passaggio in grande quantità di albumina (e quindi riversarla nelle urine) ma questa proteina ha carica netta negativa, così come lo strato basale del filtro nello spazio di Bowman, questo porta a una repulsione ed impedisce l'eccessivo passaggio nelle urine della proteina.
• Dosaggio di insulina (12-150 pmol/L) non è prescritto per pazienti diabetici ma per valutare ipoglicemie a digiuno (per correggere terapia ed escludere insulinoma)
• Dosaggio peptide C consigliato per il controllo della terapia insulinica (0.24-0.6 nmol/L)

Sindrome metabolica

Sindrome metabolica = condizione in cui l'interazione di fattori biochimici e metabolici determina aumentato rischio di malattie cardiovascolari, diabete di tipo II e mortalità da tutte le cause. Caratterizzata da obesità viscerale, ipertensione, alterazioni del metabolismo lipidico e glucidico. Alla base vi è insulino-resistenza, stato di proinfiammazione e protrombosi. Ha eziologia multifattoriale.

Diagnosi: alterazione di almeno tre parametri in tabella.

• PA = ipertensione
• WC = obesità addominale
• TG = profilo lipidico di concentrazione di trigliceridi
• HDL = profilo lipidico di concentrazione di colesterolo

Ipoglicemia

Ipoglicemia si ha con [glucosio] 40-50 mg/dL, condizione frequente nei pazienti con DM1 che sviluppano in media due episodi di ipoglicemia sintomatica alla settimana e almeno un episodio annuale grave (questo è debilitante, spesso associato a epilessia e coma; complicanza grave è la morte improvvisa a seguito di aritmia cardiaca). L'ipoglicemia deve sempre essere confermata con i tre criteri di Whipple:

1. Segni, sintomi, o entrambi, compatibili con ipoglicemia
2. Bassa [glucosio]
3. Risoluzione dei segni e/o sintomi dopo ripristino normale [glucosio]

Nei pazienti con diabete II, la terapia si basa su metformina o tiazolidinedione che non portano all'aumento dei livelli insulinici o riducono la [glucosio]; con il tempo questi pazienti arrivano ad avere grave carenza di insulina che li porterà ad essere trattati con l'uso della stessa, paragonandoli ai pazienti con diabete I per l'insorgenza di episodi di ipoglicemia. Questa è una condizione rara per pazienti senza diabete.

Colesterolo, lipidi e dislipidemie

Lipidi

I lipidi sono insolubili in acqua, costituiti da acidi grassi, possono essere saturi o insaturi. Gli acidi grassi insaturi sono CIS (si trovano più frequentemente in natura, es olio) o TRANS (si formano da rettificazione o idrogenazione di oli vegetali industriali per formare prodotti solidi, es margarina).

Forma dei lipidi

• Libera
• Deposito: molecola viene esterificata con acido grasso (trigliceridi ed esteri del colesterolo)

Gli acidi grassi essenziali non sono sintetizzati dall'organismo ma sono introducibili con la dieta (inolenico e linoleico). L'uomo non riesce a sintetizzare acidi grassi insaturi dopo la posizione del C9, per questo devono essere introdotti con la dieta. Due famiglie importanti con due precursori:

• OMEGA 6: acido linoleico → oli derivati
• OMEGA 3: acido alfalinoleico → pesce

Da omega 3 e 6 si formano precursori coinvolti nella risposta infiammatoria.

Colesterolo

Colesterolo: steroide anfipatico con 27C, il nome deriva da chole (bile) e stereos (solido). È un grasso puramente animale (le piante contengono altri lipidi, fitosterine), componente delle membrane, precursore di acidi biliari, vitamina D ed ormoni steroidei.

Ogni giorno viene prodotto internamente circa 1g a fronte di soli 0,4 g/die presi dalla dieta (0,05 g nei vegetariani) → si trovano per il 5% nel sangue e 95% nelle cellule. Tutte le cellule sintetizzano colesterolo, soprattutto intestino e fegato.

Attenzione: l'Idrossimetilglutaril-CoA reduttasi è l'enzima che catalizza la tappa limitante (più lenta) della via biosintetica del colesterolo, bersaglio delle statine che in questo modo riescono a inibire la produzione. Al termine della via di biosintesi si ottiene colesterolo libero, che forma le membrane perché ha una polarità. Per ottenere colesterolo apolare si passa attraverso il processo di esterificazione, che consiste nell'attacco di un acido grasso che trasformerà il colesterolo in fonte di riserva. Ciò avviene mediante l'intervento di ACAT (colesterolo acil transferasi).

Digestione e assorbimento dei lipidi

I lipidi sono insolubili in H₂O e questo condiziona la loro digestione, i trigliceridi vengono scissi dalle lipasi in acidi grassi (non è possibile l'assorbimento di trigliceridi). C'è una lipasi gastrica (che scinde poco) e una pancreatica (molto più efficace).

Il duodeno secerne secretina in risposta al chimo, questa stimola la produzione di colecistochina che serve per il rilascio della lipasi pancreatica, per stimolare la motilità intestinale e per stimolare il rilascio della bile, essenziale per dissolvere i grassi. La lipasi stimola la produzione di colesterolo esterasi (prodotta dal pancreas), essenziale per l'assorbimento del colesterolo; infatti il colesterolo esterificato non può essere assorbito, deve essere in forma libera.

Il colesterolo assorbito dalla dieta è circa il 20/50% di quello che ingeriamo poiché vi è competizione a livello intestinale tra colesterolo ingerito (origine animale o fitosteroli) e colesterolo endogeno (proveniente da bile o desquamazione intestinale). Colesterolo esogeno ed endogeno competono per gli stessi canali (NPC1L1) di assorbimento (no diffusione semplice) e quindi ne viene assorbito solo in piccola parte. Se nell'enterocita [colesterolo] è troppo alta si attivano dei canali che espellono colesterolo a livello intestinale, scartandolo (ABCG8/5).

Colesterolo ingerito alla fine non è che un quinto del colesterolo circolante:

• Poco assorbito: minore quantità nel lume intestinale rispetto al colesterolo endogeno e l'assorbimento si regola già nell'intestino.
• Colesterolo esogeno va nel fegato dove può essere escreto come acido biliare o come colesterolo.
• Colesterolo esogeno va nel fegato dove può inibire la sintesi endogena.

Cosa succede ai lipidi quando arrivano nell'intestino?

1. Acidi grassi → energia o trigliceridi
2. Lisofosfolipidi → fosfolipidi
3. Colesterolo → esteri del colesterolo

Fabbisogno cellule chilomicroni intestinali: quando i lipidi entrano negli enterociti, vengono anche assemblati in macromolecole, le lipoproteine. Lipoproteine = formate da apoliproteine + lipidi sono divise in base alle dimensioni e al contenuto lipidico/proteico in 7 classi:

Via esogena del colesterolo

Chilomicroni (grandi dimensioni) sono composti da:

• Trigliceridi esogeni (90% dei lipidi)
• Vitamine liposolubili
• Esteri di colesterolo esogeni
• Fosfolipidi esogeni
• Apoliproteine B48 e A I, II e IV

Sintetizzati a livello intestinale, trasportano a fegato e tessuti periferici grassi di origine esogena assorbiti a livello degli enterociti.

ApoB-48 isoforma più importante ha ruolo strutturale e media l'esocitosi dall'enterocita, un difetto di questa limita il rilascio di chilomicroni portando a tesaurismosi degli enterociti. Appena sintetizzati sono detti chilomicroni nascenti ed entrano nel...