Appunti nanomedicina

Nanomedicina

Biotecnologie mediche anno 2019-2020

Appunti delle lezioni della prof. Re

Esame 15 domande a scelta multipla (30 minuti), 1 o 2 domande sulla parte pratica. Nello stesso giorno  discussione orale.

13 gennaio h14 1° appello

Siccome il corpo umano è in pratica un complesso sistema di interazione tra molecole, la tecnologia per capire a fondo e riparare il corpo è la molecular machine technology, nanotecnology.  Una conseguenza naturale di questo livello di tecnologia sarà la capacità di analizzare e riparare il corpo umano con la stessa efficienza con cui ad oggi ripariamo ogni macchinario convenzionale.

Il concetto alla base della nanomedicina: riparare un danno di dimensioni nanometriche con prodotti delle dimensioni giuste. DNA e proteine 1-50 nm.  L’idea è di generare delle molecole di queste dimensioni per riparare un danno: devo generare delle nano strutture.

1959 Feynman, padre delle nanotecnologie.  Per la nanomedicina si parla di strutture nanometriche applicate alla medicina:

• Nanotecnologie
• Nanomedicina
• Nanomateriali
• Nanoparticelle

La nanomedicina è un derivato delle nanotecnologie che si riferisce ad un intervento medico altamente specifico in scala molecolare per curare malattie e riparare tessuti danneggiati.

Nano = < 100 nm

Lo sviluppo di nuovi farmaci e terapie basati su nanotecnologie è guidato dal bisogno di sviluppare terapie che hanno minori effetti indesiderati e che sono più cost-effective rispetto alle terapie tradizionali.

Le nanotecnologie permettono lo sviluppo di molecole basate sul paziente.

1. Delivery di farmaci esistenti per allungarne l’emivita, per ridurre gli effetti collaterali.  Veicolazione.
2. Drug targeting: utilizzare delle nanoparticelle per portare il farmaco dove è necessario, può essere un targeting di organo, cellulare o sub-cellulare.
3. Drug discovery: disegno di nuovi farmaci. 
4. Diagnosi: usare nano particelle per monitorare la variazione di biomarcatori. 
5. Medicina rigenerativa: design di strutture per promuovere la deposizione di nuovo tessuto per riparare il danno.

Tra le varie strutture quelle più utilizzate sono nanoparticelle che sono definite come SMART per la diagnosi e la terapia; grazie alla nanomedicina si può fare una combinazione tra terapia e diagnostica teranostica. 

Possiamo veicolare molecole che sono farmaci, agenti di contrasto, probe radiomarcate contemporaneamente nella stessa struttura. Posso veicolare diverse molecole differenti da un punto di vista chimico, posso decidere dove mettere il farmaco; in più questa particella può essere modificata  multi-funzionalizzazioni. Questa è utile per diversi aspetti: posso modificarla per aumentare l’emivita, traghettarla nel tessuto di interesse, evitare che venga fagocitata dai macrofagi e posso modificarla con tante molecole contemporaneamente.

Posso portare il farmaco solo dove serve e non disperderlo, quindi posso utilizzare un quantitativo di farmaco minore e ridurre gli effetti collaterali riducendo la tossicità sistemica.

Posso quindi controllare le proprietà terapeutiche di un farmaco già in uso.

Posso anche decidere quando deve essere rilasciato il farmaco.

Nanoparticella ideale

• Deve essere funzionalizzata in superficie, ad esempio con un anticorpo ovvero un ligando che mi indirizza la particella verso il sito di rilascio del farmaco.
• Posso modificare la superficie con molecole come il PEG per evitare che il sistema immunitario la elimini: sono dei polimeri per mascherare la particella e renderla invisibile.
• Posso aggiungere un ligando che compia un targeting nell’organello sub-cellulare di interesse.
• Posso modificare la particella in modo che eviti la via di degradazione dei lisosomi.
• Posso inserire una molecola che favorisca l’ingresso nella cellula.
• Posso inserire un probe magnetico per la diagnostica.

Non per forza una particella deve trasportare un farmaco, può essere disegnata in modo che essa stessa sia un farmaco.

Vi sono molte nanoparticelle che possono essere classificate come:

• A base lipidica
• A base polimerica: sono facili da preparare. 
• Inorganiche (silica, oro, titanio…): utili per la diagnostica e perché non sono biodegradabili. 
• Di origine virale

A base lipidica

• Liposomi
• Solido-lipidiche (SLM)

Liposomi

Sono stati preparati negli anni 50 ed erano usati come modello di membrane cellulari. Possono essere costituiti da diverse unità lipidiche, sono formati da un doppio strato e un core acquoso, posso incorporare sia farmaci idrofobici che idrofilici. Ve ne sono 15 approvati dall’FDA, sono usati per il cancro, per i vaccini… i lipidi inoltre sono facilmente modificabili. Possono essere formati da lipidi naturali, ma anche da lipidi sintetici.

Solido lipidiche (SLN)

Sono più piccole dei liposomi (50 nm), sono formate da un singolo strato lipidico e sono riempite di lipidi, hanno la stessa struttura delle lipoproteine. Il core è grande rispetto a quello dei liposomi, ma possono contenere solo farmaci idrofobici. Sono spesso usati per il trasporto di acidi nucleici e possono essere modificati sulla superficie. Hanno un’efficiente capacità di incorporare acidi nucleici, aumentano la penetrazione nei tessuti per il delivery dei farmaci e hanno una bassa citotossicità e immunogenicità.

Polimeriche

I polimeri utilizzati sono diversi e sono polimeri biocompatibili e biodegradabili, possono incapsulare sia strutture idrofiliche che idrofobiche, possono essere modificati sulla superficie. Il quantitativo di farmaco che possono trasportare è limitato, sono porose e nei pori sono collocati i farmaci.

La dimensione è importante così come la struttura e dipende dalle dimensioni.

Il PLGA è uno dei polimeri approvati dall’FDA così come la poliacrilamide, questi polimeri sono definiti come self-assembling poiché in ambiente acquoso si condensano. Nella preparazione si possono aggiungere anche delle altre soluzioni come stabilizzanti e farmaci in modo da ingegnerizzare le molecole. Posso usare dei polimeri lineari oppure dei polimeri ramificati che consentono di aumentare la quantità di farmaco.

Vi sono dei polimeri che possono essere usati per creare degli idro-gel, sono delle strutture fatte da polimeri idrofilici, possono essere usati perché essendo strutture porose possono alloggiare farmaci, ma anche altre nanoparticelle più piccole e controllarne il rilascio, possono essere usati anche come scaffold. Si può controllare le dimensioni dei pori per decidere la dimensione delle molecole da incapsulare.

Particelle inorganiche

Si possono usare nanoparticelle d’oro. Più una particella è piccola maggiore è la sua superficie.

Si fa una riduzione dell’oro partendo da acido cloroaurico utilizzando trisodio citrato.

Si possono visualizzare con l’imaging, tuttavia non sono biodegradabili e possono essere solamente modificate in superficie. Nella ricerca contro il cancro nanoparticelle d’oro possono essere usate per targhettare il tumore e per la detection usando la Surface Enhanced Raman Spectroscopy in vivo. Sono state analizzate come convertitori fototermici per la luce infrarossa in vivo poiché la luce infrarossa si trasmette attraverso la pelle e i tessuti.

Silica mesoporosa

Ha una forma simile ad un globulo rosso, posso mimare qualcosa che  esiste già nel corpo.

Non essendo biodegradabili possono causare infiammazione.

Posso generare dei pori della dimensione di mio piacimento, le particelle possono essere riempite con farmaci o coloranti fluorescenti che altrimenti non sarebbero in grado di passare la parete cellulare, queste particelle otticamente sono trasparenti quindi un colorante può essere visto attraverso la parete di silica.

Nano tubi di carbonio

Sono utilizzati solitamente per la rigenerazione, possono essere realizzati a forma di tubi o particelle. Generalmente sono strutture di forma esagonale.

Possono essere usati per il trasporto di farmaci tra cellule. Possono funzionare come transistor e quindi possono essere usati come sensori.

• Agenti per il bioimaging
• Delivery di farmaci/geni
• Biosensori
• Rigenerazione tissutale
• Cancro
• Scaffold 3D

Possono essere realizzati a singolo strato (SWNTs) o a multistrato (MWNTs). Il tubo ha un diametro di 1 nm e la lunghezza è variabile. La caratteristica di quelli a singolo layer è che hanno proprietà elettriche e quindi possono essere usati come sensori e la capacità elettrica può variare a seconda di biomarcatori che sono connessi.

• Transistor = semiconduttore. I transistor si basano su semiconduttori e un semiconduttore è un materiale che ha una resistività (o anche una conducibilità) intermedia tra i conduttori (come un filo di rame) e gli isolanti (come l`aria).

La conduttività di un semiconduttore, cioè la facilità degli elettroni di fluire attraverso un corpo, dipende da diverse variabili, quali la temperatura o la presenza o meno di elettroni.

Sono delle strutture di carbonio rigide che possono essere disegnate in modo da poter regolare la loro rigidità, resistenza e forza alla trazione.

Vi possono essere dei problemi durante la sintesi, soprattutto a causa della perdita di un atomo di carbonio. I problemi sono connessi con la tossicità. Se si accumulano a livello polmonare possono causare infiammazioni.

Possono essere usati come biosensori, come vasi sanguigni ovvero possono essere usati come scaffold dove le cellule endoteliali possono rivestirli per generare dei vasi in caso di problemi vascolari.

Possono essere funzionalizzati sulla superficie in modo da permettere l’attacco della cellula che si vuole rigenerare. In laboratorio possono essere usati come stampo per il bio-printing.

I nanotubi di carbonio sono i materiali più forti e rigidi mai scoperti in termini rispettivamente di resistenza alla trazione e modulo elastico. Questa forza deriva dai legami covalenti formati tra i singoli atomi di carbonio.

Ci si aspetta che tutti i nanotubi siano ottimi conduttori termici lungo il tubo, esibendo una proprietà nota come "conduzione balistica" (=> capacità di condurre elettricità senza dispersione) ma buoni isolanti lateralmente all'asse del tubo.

Il loro uso finale, tuttavia, può essere limitato dalla loro potenziale tossicità.

In alcune condizioni, i nanotubi possono attraversare le barriere della membrana e indurre effetti dannosi: infiammazione, granulomi epitelioidi (noduli microscopici), fibrosi e cambiamenti biochimici / tossicologici nei polmoni.

Determinare la tossicità dei nanotubi di carbonio è stata una delle domande più urgenti nella nanotecnologia. Purtroppo, tale ricerca è appena iniziata e i dati sono ancora frammentari e soggetti a critiche. I risultati preliminari evidenziano le difficoltà nel valutare la tossicità di questo materiale eterogeneo. Parametri come struttura, distribuzione dimensionale, area superficiale, chimica superficiale, carica superficiale e stato di agglomerazione, nonché purezza dei campioni, hanno un impatto notevole sulla reattività dei nanotubi di carbonio.

Quantum dots

Sono dei fluorofori di origine cristallina usati per l’imaging, sono fatti soprattutto di cadmio, hanno una dimensione di 10 nm, le loro proprietà ottiche possono essere modulate e solitamente sono visualizzate nell’infrarosso (650 nm) siccome hanno come finestra di emissione nel vicino infrarosso non vi è il problema del quenching ovvero dell’assorbimento da parte di macromolecole dei nostri sostituenti.

Sono stati usati per visualizzare cellule tumorali residue, non sono usati per trasportare i farmaci. Anche in questo caso tendono ad accumularsi e quindi vi sono dei problemi di tossicità.

Hanno una resa quantica elevata e l’emivita della fluorescenza che emettono è elevata. Essendo delle strutture molto piccole il problema principale è quello della clearance a livello renale. Possono essere sfruttati in vitro. Si è tentato di combinare i QD con dei farmaci tumorali per accoppiare diagnostica e terapia.

• Alta resa quantica rispetto ai comuni coloranti fluorescenti.
• Assorbimento della banda larga: la luce che ha una lunghezza d'onda più corta della lunghezza d'onda massima di emissione può essere assorbita, la lunghezza d'onda di emissione di picco è indipendente dalla fonte di eccitazione.
• Emissione sintonizzabile e stretta, a seconda della composizione e delle dimensioni.
• Elevata resistenza al photo bleaching: le particelle inorganiche sono più fotostabili rispetto alle molecole organiche e possono sopravvivere a tempi di irradiazione più lunghi.
• Lunga durata della fluorescenza: la fluorescenza dei punti quantici è compresa tra 15 e 20 ns, che è superiore alle normali durate della tintura organica.
• Sensibilità di rilevamento migliorata: le nanoparticelle di semiconduttori inorganici possono essere caratterizzate con microscopi elettronici.

Problemi

• Mettere i farmaci nella particella.
• Mantenerlo nella particella.
• Tossicità.
• Purezza: deve essere iniettabile e quindi sterile (GMP). 
• Delivery: devo portare il farmaco dove mi serve. 
• Deve essere eliminabile.
• Il cervello è un tessuto difficile da raggiungere (barriera ematoencefalica).
• La preparazione.

09/10/19

Liposomi

I liposomi sono sferici per definizione, sono delle strutture chiuse, il contorno è un doppio strato fosfolipidico, hanno il core pieno della soluzione acquosa in cui vengono preparati. Il buffer in cui vengono preparati è lo stesso che è presente nel core, vi sono delle occasioni in cui il cuore contiene un buffer e l’esterno è diverso (ad esempio con pH diversi). Come dimensione si parte dai 20 nm in su. Esiste una CMC (concentrazione micellare cristica), per far in modo di avere un doppio strato che si incurvi a sfera ho bisogno di un tot numero di particelle lipidiche 1 mM. 

Lo spessore è intorno ai 3-4 nm, la quantità di farmaco che posso incorporare nel doppio strato è piccola comparato al core acquoso.

Il vantaggio dei liposomi è che non sono tossici e la composizione si può stabilire in base all’utilizzo e in base al farmaco da incorporare. Possono essere fatti sia da lipidi naturali che da lipidi sintetici. Possono essere preparati anche su larga scala.

Possono caricare sia molecole idrofiliche che idrofobiche e la struttura è versatile perché posso decidere la composizione lipidica; se voglio ad esempio una struttura rigida aggiungerò più colesterolo e acidi grassi saturi. Se voglio che permanga in circolo per più tempo voglio che sia più stabile, se invece voglio un rilascio immediato voglio una superficie più morbida.

Originariamente venivano usati come modelli di membrana, negli anni 90 sono nati i liposomi stealth, ovvero modificati in superficie per essere invisibili ai macrofagi.

Come dimensione devono avere un diametro minimo di 60 nm.

Da un punto di vista della composizione questa può essere variabile, si possono usare tutti i lipidi noti, sono lipidi naturali non immunogenici e molto sicuri. Posso mischiare anche lipidi diversi.

I liposomi approvati dall’FDA hanno una composizione 1:1 sfingomielina – colesterolo. Questa composizione lipidica può evitare l’uso del PEG poiché sono piccoli, rigidi e non attaccabili.

I fosfolipidi sono delle molecole anfipatiche con una testa idrofilica e una coda idrofobica composta da due catene di acidi grassi di diversa lunghezza. In ambiente acquoso spontaneamente formano dei bilayers che formano delle strutture sferiche chiuse solitamente multilamellari.

Esistono in commercio fosfolipidi con la testa molecolare modificata, ad esempio con il PEG già attaccato, in questo modo posso evitare reazioni chimiche successive in modo da avere una molecola più pura.

Oppure vi sono dei lipidi che hanno la testa modificata con un gruppo chimico utile per l’attacco di un ligando.

I fosfolipidi costituiscono almeno il 50% in moli del liposoma, questi si posizionano in maniera autonoma in un doppio strato e si richiudono a formare una sfera.

Solitamente in soluzione acquosa dei fosfolipidi formano delle strutture multilamellari ovvero possiedono più doppi strati, da questa preparazione iniziale vi sono delle procedure che permettono di ottenere liposomi unilamellari che sono composti da un singolo doppio strato lipidico.

Una micella viene ottenuta usando dei lipidi che hanno una singola catena di acidi grassi, le micelle sono più piccole dei liposomi, userò dei lisofosfolipidi che formano delle unità a cono.

Utilizzando micelle inverse si ottiene uno strato multilamellare che risulta utile per l’utilizzo di farmaci idrofobici.

Il colesterolo viene aggiunto spesso per mantenere la stabilità del liposoma.

Posso anche preparare dei liposomi in cui mischio lipidi diversi. Il lisolipide con una sola coda rende il doppio strato instabile, questo può essere sfruttato per permettere il rilascio del farmaco, oppure si possono preparare dei liposomi con dei lisolipidi modificati con una seconda catena riconosciuta dalle metallo proteasi coinvolte nel riarrangiamento della matrice, queste proteine sono coinvolte nella tumorigenesi, quindi si vuole generare un lisolipide in modo che le metalloproteasi riconoscano il frammento addizionale, venga tagliata la coda e quindi il liposoma perda stabilità e rilasci il farmaco.

Vi sono diversi tipi di liposomi che possono essere classificati come:

• Convenzionali
• Stealth con aggiunta di PEG per aum