Appunti di Biologia molecolare

Biologia molecolare

Introduzione alla biologia molecolare

Biologia molecolare: studia gli esseri viventi a livello dei meccanismi molecolari alla base della loro fisiologia, concentrandosi in particolare sulle interazioni tra proteine e acidi nucleici. "Studia fondamentalmente la struttura e la funzione degli acidi nucleici e delle proteine."

Scoperta del DNA

Andando molto velocemente:

• Miescher isolò gli acidi nucleici per la prima volta, li chiama nucleina.
• Griffith dimostra che esiste qualcosa che riesce a cambiare la natura di alcuni batteri, il principio trasformante.
• Avery dimostra che il principio trasformante è il DNA, perché sperimentalmente non si aveva la trasformazione se trattavamo la soluzione con DNAsi che distrugge il DNA.
• Hershey e Chase dimostrano con l’esperimento del frullatore che il DNA è il materiale genetico.
• Chargaff enuncia la "regola di Chargaff".
• Franklin e Wilkins mostrano la struttura base del DNA con la cristallografia.
• Watson e Crick propongono il modello della doppia elica e aggiungono che la struttura serve per la replicazione del DNA, dove un filamento funge da stampo per l’altro.
• Kornberg identifica la DNA polimerasi 1 responsabile della sintesi del nuovo filamento.
• Meselson e Stahl dimostrano che la replicazione è semiconservativa, questo confuta i modelli di replicazione conservativa e dispersiva.

Funzioni e struttura del DNA

Il DNA è un acido nucleico, questi sono responsabili del mantenimento e della trasmissione dell’informazione genetica e pertanto hanno un ruolo fondamentale in biologia. Le cellule contengono due tipi di acido nucleico: DNA e RNA. La funzione del DNA è quella di immagazzinare l’informazione genetica in tutte le cellule. Anche l’RNA può contenere l’informazione genetica.

Struttura del DNA

La struttura fondamentale è la doppia elica, costituita da: catene polinucleotidiche la cui impalcatura è formata da uno zucchero e un gruppo fosforico. Il nucleoside: base azotata legata al 2’-deossiribosio (nel DNA). Il nucleotide: nucleoside legato al fosfato (può essere legato fino a 3 Pi).

Le componenti del nucleotide sono unite tramite legami glicosidici (che unisce il gruppo emiacetalico di uno zucchero con un atomo, di solito nucleofilo, di un'altra molecola) mentre i nucleotidi sono uniti tramite legami fosfodiesteri (attraverso il fosfato); questi legami conferiscono polarità alla molecola, infatti abbiamo due estremità, una 5’ che inizia con il fosfato e una 3’ che inizia con l’ossidrile.

Basi azotate: sono molecole contenenti azoto che hanno le proprietà chimiche di una base cioè una sostanza che accetta uno ione H⁺ o un protone in soluzione. Appartengono a due famiglie:

• Purine: adenina e guanina; derivano da una struttura a doppio anello. Legano in posizione 9.
• Pirimidiniche: citosina e timina; derivano da una struttura a singolo anello. Legano in posizione 1.

Queste si appaiano sempre seguendo la regola di Chargaff, ovvero, l’adenina si appaia sempre con la timina e la citosina sempre con la guanina ([A]:[T]; [C]:[G]). Queste si legano attraverso legami a idrogeno, tre tra C-G e due tra A-T; questi legami sono importanti anche per la specificità di appaiamento. Infatti, A e G sono accettori mentre T e C sono donatori di legame a idrogeno, per “adattarle” dovremmo interporre una molecola di acqua ma a causa dell’ingombro sterico non possiamo, quindi il legame deve essere specifico per conferire la stabilità.

All’interno della molecola le basi tendono ad impilarsi, per il fenomeno dell’impilamento delle basi (stacking), questo elimina lo spazio libero minimizzando lo spazio all’interno della molecola e creando dunque un nucleo centrale idrofobico.

Regole di Chargaff

In ogni molecola di DNA la quantità di A e T e di C e G sono equivalenti. La somma delle purine, A+G, è uguale alla somma delle pirimidine, C+T. Altra caratteristica della doppia elica è che ruotando forma due solchi, uno maggiore e uno minore. Quello maggiore è ricco di informazioni chimiche, inoltre le basi sporgono dall’interno dei solchi creando un sistema donatori/accettori di legami H, questo permette il legame di proteine specifiche.

Strutture alternative del DNA

Ciascun nucleotide nell’elica è dotato di una flessibilità che gli permette di assumere forme molecolari leggermente differenti. I cambiamenti più importanti riguardano la rotazione attorno al legame β-N-glicosidico, che cambia l’orientamento della base rispetto allo zucchero, questo fa variare la struttura. Ne abbiamo individuate tre: A, B e Z.

Z è l’unico sinistrorso a causa del legame syn delle basi allo zucchero, questo gli fa assumere una forma a zig-zag. Il suo significato fisiologico è incerto.

Denaturazione-riassociazione

Le due catene sono tenute insieme da legami H quindi portate ad una certa temperatura hanno la capacità di separarsi, fenomeno della denaturazione termica. Può avvenire anche in condizioni di pH elevato. La denaturazione è però reversibile, infatti abbassando la temperatura lentamente i singoli filamenti si riassemblano, fenomeno della rinaturazione o annealing.

Monitorando la denaturazione con luce UV (DNA ha un massimo nello spettro di assorbimento a 260 nm). Graficando osserviamo che questo assorbimento aumenta vicino una determinata temperatura (Tm) e segue andamento sigmoidale. Tm: è il punto in cui il 50% del DNA è a singolo filamento. La temperatura di fusione dipende anche dalla percentuale di citosina e guanina, dato che queste sono legate da tre legami H.

Struttura dell’RNA

Differisce dal DNA per tre caratteristiche:

• Contiene ribosio, questo ha un gruppo OH- in posizione 2’;
• Contiene l’uracile al posto della timina (è sempre una pirimidinica quindi a singolo anello);
• È a singolo filamento.

Inoltre non trasporta informazione genica e non viene utilizzato come stampo. Abbiamo diverse funzioni, questo agisce con intermediario come mRNA, di raccordo come tRNA, strutturale come l’RNA dei ribosomi infine possiamo avere RNA regolatori come rRNA. L’effetto dell’OH- impedisce all’RNA di assumere determinate strutture a doppia elica nelle zone complementari, quindi viene favorita la forma A.

Inoltre lo rende più instabile, e per questo l’RNA viene idrolizzato molto più velocemente del DNA (> 100 volte). Abbiamo parlato di doppia elica nell’RNA nonostante sia a singolo filamento. Spesso però può ripiegarsi a doppia elica grazie a delle sequenze in orientamento opposto chiamate ripetizioni invertite; grazie a queste formano le cosiddette strutture a stem loop (a forcina, a gemma e ad ansa semplice).

Topologia del DNA

Queste proprietà si riferiscono ai superavvolgimenti del DNA; infatti, il DNA si attorciglia su sé stesso a formare strutture complesse dette “Superavvolgimenti”. Queste strutture se non controllate, possono interferire con l’espressione dei geni, la duplicazione del DNA e la segregazione dei cromosomi. Le caratteristiche del DNA superavvolto e quali le regole prendono il nome di Topologia del DNA.

Il DNA è una molecola flessibile, infatti se le estremità di una molecola lineare si legano, otterremo una molecola circolare e il numero di volte in cui una molecola gira intorno all’altra è un numero definito. Il DNA così chiuso prende il nome di cccDNA (DNA circolari covalentemente chiusi). In queste molecole, dato che non abbiamo interruzioni, non possiamo avere la separazione delle catene; l’unico modo per separarle sarebbe usare delle topoisomerasi. E il numero di volte che un filamento deve essere passato attraverso l’altro affinché vengano separate è chiamato linking number; questo numero è una proprietà topologica del DNA.

Il linking number è la somma di due componenti: twist e writhe.

• Il twist: il numero di volte che un filamento gira intorno all’altro. Il twist può essere positivo se destrogiro e negativo se levogiro.
• Il writhe: è il numero di incroci dell’asse longitudinale, cioè il numero di volte che l’asse centrale della doppia elica incontra sé stesso. Può presentarsi in due forme:
  • Interwound (plectonomico): l’asse longitudinale è avvolto su sé stesso.
  • Toroide: l’asse longitudinale è avvolto come intorno ad un cilindro.

Il cccDNA può essere sottoposto a diverse deformazioni senza subire deformazioni, a patto che Lw = Tw + Wr sempre. Possiamo anche avere però un cccDNA privo di torsioni, in questo caso il linking number viene detto Lk^° ed è pari al numero di basi diviso 10.5 (bp/10.5). In base a Lk possiamo definire la quantità di superavvolgimenti che abbiamo nella nostra molecola di DNA; attraverso la differenza di linking ΔLk = Lk – Lk^°.

Se:

• Lk > Lk^° e ΔLk > 0 allora il DNA è superavvolto positivamente.
• Lk < Lk^° e ΔLk < 0 allora il DNA è superavvolto negativamente.

Quasi sempre troviamo il DNA superavvolto negativamente perché i superavvolgimenti negativi possono essere considerati un meccanismo di immagazzinamento dell’energia; regini avvolte negativamente hanno infatti la tendenza ad eliminare la doppia elica e separare il DNA spontaneamente.

Il linking number può essere modificato solamente con la rottura e la riunione della molecola di DNA; questo avviene ad opera di una classe di enzimi, le topoisomerasi, che possono rilassare il DNA superavvolto modificandone la topologia. Abbiamo due classi principali:

• Topoisomerasi 1: permettono di modificare Lk un’unità per volta, rompendo temporaneamente un singolo filamento e consentendo all’altro di passare al di sotto dell’altro prima che il nick venga chiuso. Non richiedono l’idrolisi dell’ATP. Si dividono in due "sottoclassi":
  • Topoisomerasi di tipo IA: tagliano un filamento di DNA e permettono al filamento non tagliato di passare attraverso l’incisione della superelica. La topoisomerasi I prima taglia un filamento e unisce covalentemente il 5’ fosfato libero ad una tirosina del sito attivo dell’enzima; L’estremità 3’OH ruota di un giro prima di attaccare il residuo fosfato. In questo modo il DNA duplex si salda nuovamente cambiando il numero di legame di una unità.
  • Topoisomerasi di tipo IB: funzionano alla stessa maniera ma si legano all’estremità 3’, e c’è la rotazione di un duplex intorno alla rottura e non il passaggio di un filamento sotto l’altro.
• Topoisomerasi 2: permettono di modificare Lk due unità per volta, rompendo temporaneamente il doppio filamento e consentendo al duplex di passare prima che il nick venga chiuso. Richiedono l’idrolisi dell’ATP. In realtà l’idrolisi dell’ATP serve ad assicurare il cambiamento di conformazione al DNA, mentre il taglio e la legatura avvengono in maniera spontanea. In alcuni procarioti possiamo avere delle speciali topoisomerasi 2 chiamate DNA girasi, queste inseriscono all’interno della doppia elica superavvolgimenti negativi.

Nick: interruzione del legame fosfodiesterico su un solo filamento del DNA. Questi enzimi sono importanti anche perché svolgono altri lavori di correzione sulla doppia elica. Ad esempio utilizzano un nick temporaneo per concatenare e deconcatenare due molecole di cccDNA (concatenazione: quando una molecola di DNA chiusa passa dentro l’altra come l’anello di una catena). Inoltre catalizzano la rottura di nodi occasionali che si possono formare all’interno del DNA lineare.

Funzionamento delle topoisomerasi

Taglio: un residuo di tirosina attacca il legame fosfodiesterico del DNA, questo causa la rottura in seguito alla formazione di un legame tra la topoisomerasi e un terminale fosfato. La separazione è favorita dall’alto numero di superavvolgimenti negativi. L’altra estremità viene trattenuta dalla topoisomerasi.

Riassemblaggio: Il legame fosfo-tirosina conserva l’energia di conseguenza il riassemblaggio avviene tornando indietro nella reazione. Quando il DNA viene tagliato, la topoisomerasi promuove il passaggio del filamento attraverso il taglio; in un meccanismo altamente concertato.

Organizzazione del DNA

All’interno della cellula il DNA è associato a delle proteine in un complesso definito cromosoma. Questa organizzazione si trova in tutte le cellule (sia procariotiche che eucariotiche). Il compattamento è importante perché permette di proteggere l’acido nucleico, conferisce strutture di ordine superiore e facilita l’espressione e la ricombinazione. Un cromosoma è formato da DNA e proteine che formano la cromatina.

La cromatina rappresenta la forma in cui gli acidi nucleici si trovano nel nucleo di una cellula eucariote. La cromatina è formata da DNA, avvolto su gruppi di proteine dette istoni (proteine basiche), formando un nucleosoma, e da proteine non-istoniche (proteine neutre o acide); essa è poi ripiegata in vario modo. Si possono distinguere due tipi di cromatina:

• Eucromatina, più dispersa che consiste di DNA che viene espresso.
• Eterocromatina, fortemente condensata che consiste di regioni di DNA per la maggior parte trascrizionalmente inattive. Sembra che svolga ruoli strutturali.

L’eterocromatina (interfasica) può essere distinta in due tipi:

• Eterocromatina costitutiva rappresenta regioni del genoma che non avendo capacità codificante non vengono mai espresse e comprende alcuni DNA satelliti che si trovano nelle regioni centromeriche.
• Eterocromatina facoltativa è tale solo in alcune situazioni, rappresenta regioni che hanno capacità codificante che si esplica solo in alcune condizioni, es in un tessuto.

Le proteine che si associano al DNA sono proteine istoniche, di piccole dimensioni e carattere basico. Abbiamo anche proteine non istoniche che legano il DNA e regolano le reazioni di trascrizione, replicazione e ricombinazione. La subunità fondamentale della cromatina è il nucleosoma. Questo fornisce il primo livello di organizzazione e riduce la lunghezza del DNA di circa sei volte, formando la fibra da 10nm. I nucleosomi visti al microscopio elettronico e danno alla cromatina un aspetto di collana di perle.

Il nucleosoma

È formato da un ottamero istonico con il DNA avvolto intorno adesso, in maniera sinistrorsa. Mediante questo assemblaggio si ha un compattamento di sei volte. Il DNA legato internamente al nucleosoma, il DNA core, si avvolge 1.6 volte intorno all’ottamero e poi lascia il nucleosoma in due punti vicini (siti di legame dell’istone H1). Il DNA linker, invece, costituisce il resto dell’unità ripetitiva e la sua lunghezza può variare da un minimo di 8 ad un max di 114bp.

Gli istoni

Sono le proteine più abbondanti in associazione agli acidi nucleici. Ne conosciamo cinque tipi: H2A, H2B, H3, H4 (formano il core) e H1 (lega il DNA linker fra due nucleosomi, per questo è chiamato istone linker). I primi quattro sono presenti in quantità uguali nella cellula, mentre H1 è metà (1 nucleosoma). Queste sono proteine basiche, cioè cariche positivamente e il core si assembla solo in presenza di DNA.

Sono formati da un dominio ben conservato, detto histone-fold, formato da tre α-eliche, coinvolte nella formazione di dimeri H2A-H2B e H3-H4, questi ultimi poi formano tetrameri. Oltre al disco troviamo una coda all’estremità N-terminale, queste non si associano con l’ottamero istonico ma forniscono dei siti per modificazioni che sono in grado di cambiare la funzione del nucleosoma.

L’associazione DNA-nucleosoma è mediata da un gran numero di legami H che si instaurano tra proteine ad atomi di ossigeno dei legami fosfodiesterici. Gli istoni devono essere carichi positivamente per legarsi all’ossigeno ma anche per altri due motivi: la basicità degli istoni è necessaria per mascherare la negatività dei fosfati ma anche per favorire la curvatura del DNA.

In parole povere: L’associazione del tetramero H3,H4 con il DNA provoca una curvatura accentuata del DNA stesso e facilita l’associazione del DNA con H2A e H2B. Inoltre le code che sporgono ai due lati della doppia elica “costringono” il DNA ad avvolgersi attorno all’ottamero.

Strutture di ordine superiore

Una volta formati i nucleosomi, l’impacchettamento di ordine superiore viene dato dall’istone H1 che determina la protezione di 20 ulteriori paia di basi aggiuntive, quindi, il legame di H1 aumenta il compattamento del DNA sul nucleosoma. L’istone H1 ha la proprietà di legare due regioni diverse del DNA duplex, tipicamente queste regioni fanno parte della stessa sequenza di DNA. Il legame H1 stabilizza una struttura di ordine superiore definita fibra da 30nm.

Abbiamo due modelli differenti per spiegare la struttura:

• Modello a solenoide: Una superelica di sei nucleosomi x giro; si presume che i nucleosomi siano impilati.
• Modello a zig-zag: Nucleosomi disposti a zig zag; i DNA linker più lunghi favoriscono questa struttura.

Le differenze tra queste due strutture riguardano la disposizione del DNA linker che nel modello a solenoide viene a trovarsi sempre al centro del solenoide, in una posizione inaccessibile. Mentre il modello a zig zag invece, prevede che le regioni linker siano più accessibili e possano costituire dei punti di attacco per eventuali proteine di regolazione.