Appunti esame laboratorio di biologia

Introduzione ai dispositivi di sicurezza e protezione

Le schede di sicurezza contengono pittogrammi di divieti, di attenzioni e di obblighi. A seconda del tipo di laboratorio, le schede di sicurezza contengono pittogrammi diversi. Con il termine dispositivi di protezione individuale (DPI) si intendono le attrezzature che hanno la funzione di salvaguardare la persona che le indossi, o comunque le porti con sé, da rischi per la salute e la sicurezza (guanti, camice, mascherine, occhiali protettivi).

Per dispositivi di protezione collettiva (DPC) si intendono dispositivi che hanno il compito di limitare un rischio o contenere un danno per la salute individuale e degli altri lavoratori (cappe). Esistono 2 tipi di cappe: chimiche e biologiche o a flusso laminare.

Tipologie di cappe

Cappa d'aspirazione chimica

La cappa d’aspirazione in ambito chimico ha la funzione di proteggere l’operatore da eventuali vapori sprigionati da reazioni chimiche (protegge quindi da reagenti volatili).

Cappa a flusso laminare

La cappa a flusso laminare è una cappa utilizzata in ambito biologico per la protezione dell’operatore e dell’ambiente circostante da agenti biologici (generalmente microrganismi patogeni); inoltre, la cappa a flusso laminare elimina la possibilità di contaminazione del campione biologico, consentendo un lavoro in condizioni di sterilità. Il flusso di aria è sterile perché filtrato attraverso filtri HEPA (che filtrano l’aria in ingresso). Il flusso laminare può essere orizzontale o verticale.

Flusso laminare orizzontale

Quando il flusso laminare è orizzontale, l’aria sterile si muove parallelamente al piano di lavoro. Le cappe a flusso laminare orizzontale vengono utilizzate per la manipolazione di materiale biologico non patogeno, terreni di coltura e in tutti i casi in cui l’obiettivo principale sia la protezione di campioni che non comportino rischio per l’operatore.

Flusso laminare verticale

Quando il flusso laminare è verticale, l’aria sterile si muove perpendicolarmente al piano di lavoro. Queste cappe proteggono sia il campione sia l’operatore. Vengono inoltre distinte cappe biologiche di classe I, di classe II e di classe III.

Classificazione delle cappe biologiche

• Classe I: Adatte per impieghi con agenti biologici a basso medio rischio (gruppo I e gruppo II).
• Classe II: Indicate per la manipolazione di agenti di gruppo II e di gruppo III.
• Classe III: Indicate per la manipolazione di agenti di gruppo IV (altamente patogeni).

Etichettatura e utilizzo delle sostanze chimiche

Ogni volta che sia necessario prelevare ed utilizzare una sostanza, si deve controllarne attentamente l’etichetta e leggere le schede di sicurezza. In base alla direttiva europea, l’etichetta di un prodotto chimico deve riportare, tra le indicazioni, il nome del prodotto, dati analitici sulla composizione, il tipo di pericolosità con il suo simbolo, le sigle riguardanti la natura dei rischi (R seguita da un numero) e le norme di sicurezza (S seguita da un numero), la formula bruta e il peso molecolare (FW).

Il numero CAS è un identificativo numerico che individua in maniera univoca una sostanza chimica. Il Chemical Abstracts Service, una divisione della American Chemical Society, assegna questi identificativi a ogni sostanza chimica descritta in letteratura. Anche i recipienti provvisori vanno etichettati e possibilmente datati e firmati.

Le frasi di rischio R sono ora indicazioni di pericolo H. Le istruzioni di sicurezza S sono ora consigli di prudenza P. I nuovi pittogrammi contenuti in un riquadro rosso sostituiranno gradualmente gli attuali simboli di pericolo su sfondo arancione.

Per ogni sostanza chimica presente in laboratorio esiste anche una scheda di sicurezza che fornisce le indicazioni e le norme comportamentali da seguire quando la si deve maneggiare o ci si trova in contatto con essa. Le schede di sicurezza devono essere collocate ben visibili all’interno del laboratorio.

I reagenti devono essere conservati entro appositi e specifici armadi di sicurezza chiusi a chiave. Le bombole dei gas possono determinare seri rischi sia per la natura chimica del fluido stesso (tossico, irritante, infiammabile, asfissiante) sia per il relativo stato fisico (elevata pressione). Generalmente i gas vengono erogati da postazioni esterne; l’uso delle bombole è ammesso all’interno dei laboratori solo se il volume di gas è limitato.

Considerando che si possano verificare perdite non fisicamente percettibili, va definito il numero adeguato di ricambi d’aria necessari ad evitare il crearsi di atmosfere pericolose. Il riduttore di pressione è un dispositivo che viene collegato alla bombola oppure alle prese a parete di distribuzione dei gas nei laboratori e serve per diminuire la pressione e consentire l’utilizzo del gas da parte dell’utenza. Non si può mai utilizzare una bombola senza riduttore.

Strumentazione e materiali di uso comune in un laboratorio di biologia

• Becher: Bicchieri dotati di beccuccio nella parte superiore per facilitare il travaso dei liquidi. Hanno capacità diverse (25-100-250-400-600-1000 ml ed oltre). Non sono adatti per misurazioni del volume. Si utilizzano per riscaldare liquidi, travasare liquidi, sciogliere un soluto in un solvente.
• Cilindri graduati: Dotati di una base d’appoggio e di un beccuccio che consente di versare i liquidi con facilità. Lungo il cilindro è posta una scala graduata. Con i cilindri si effettuano misure con una certa approssimazione, in quanto il diametro interno è piuttosto grande. Per limitare l’errore, bisogna utilizzare il cilindro di capacità più vicina possibile al volume di liquido da misurare. Per una corretta misurazione si osserva il menisco inferiore.
• Matraccio: Un pallone a fondo piatto con collo lungo sul quale viene indicato il livello del liquido. È un contenitore tarato con molta precisione e viene usato per la preparazione di soluzioni a concentrazione nota (soluzioni titolate) e per diluire campioni a un volume esatto. Possono essere chiusi con appositi tappi in vetro o in PTFE. Il matraccio non è costruito in vetro da fuoco, non può quindi essere usato per il riscaldamento di soluzioni o liquidi di qualsiasi genere. Misura solo un volume di 500 ml.
• Beute: Matracci conici e nella parte superiore terminano con un collo cilindrico che può essere smerigliato in modo da poter apporre un tappo. Possono avere varie capacità (25-50-100-500...ml). Vengono utilizzate come contenitori per liquidi, quando si vogliono ridurre le perdite di liquido per evaporazione. Non servono per misurare volumi.
• Provette: Tubi di vetro o plastica di varia misura, con o senza scala graduata. Le eppendorf sono provviste di un tappino che non si avvita mentre le falcon hanno un tappino avvitabile.
• Fiasche: Terminano nella parte superiore con un collo cilindrico ed un tappo a vite. Sono contenitori utilizzati per la crescita delle cellule in fase liquida.
• Piastre Petri: Possono essere in vetro o in plastica e sono costituite da un piattino e da un coperchio; sono ideali per la microbiologia.
• Piastre multipozzetto: In plastica e costituite da un supporto e da un coperchio; hanno diverse applicazioni in funzione del numero di pozzetti, da 6 a 96.
• Pipette tarate: Tubi sottili di vetro, tarati per volumi di 0.5, 1, 2, 5, 10, 25 ml. La pipetta Pasteur è formata da un tubicino vitreo abbastanza sottile con un’estremità larga e una parte inferiore che è quasi un capillare; è poco precisa perché priva di una scala graduata. Esistono dispositivi per prelevare i liquidi con le pipette (pro-pipette): porcellino, pompetta a stantuffo, tettarella (per pipette Pasteur) e pipettatore automatico.
• Spatoline: Servono per prelevare delle polveri dai contenitori; le navicelle da pesata servono per pesare delle polveri; le ancorette magnetiche servono per miscelare soluzioni; i vetrini portaoggetto e coprioggetto servono per allestire preparati istologici; portaprovette e porta eppendorf servono per mantenere in posizione verticale provette ed eppendorf.
• µpipette volumetriche: Presentano uno stantuffo, la cui corsa è regolata da una vite che permette di spostare una determinata quantità di aria che, per pressione positiva o negativa, farà scendere o salire il liquido nel puntale. Attenzione al secondo scatto e alle bolle nel puntale!

Soluzioni

Una soluzione è una di 2 o più sostanze pure, dette componenti della soluzione; la sua composizione e le sue proprietà sono uniformi in ogni parte; rimane omogenea nel tempo. Una soluzione è diversa da una sospensione (miscela omogenea) e dai colloidi (caratterizzati dall’effetto Tyndall). Il componente presente in misura maggiore è chiamato solvente e determina lo stato della materia in cui la soluzione esiste, mentre quello presente in misura minore è detto soluto. Il processo attraverso cui il soluto si miscela con un solvente è detto solubilizzazione o dissoluzione. Da un punto di vista biologico le soluzioni più rilevanti sono quelle in cui il solvente è l’acqua (soluzioni acquose).

• Soluzioni gassose: In genere i gas possono mescolarsi in tutte le proporzioni per dare soluzioni gassose (aria).
• Soluzioni solide: Vengono chiamate leghe e sono costituite dall’insieme di 2 o più metalli. Si possono anche ottenere sciogliendo un soluto gassoso o liquido in un solvente solido.
• Soluzioni liquide: Sono le più comuni e sono ottenute nella maggior parte dei casi sciogliendo un gas, un liquido o un solido in un liquido.

Un soluto si scioglie in un solvente quando tra le 2 componenti si stabiliscono forze di attrazione simili. Le soluzioni possono essere preparate per diluizione o per pesata. Nelle soluzioni per diluizione si parte da soluzioni concentrate di un composto e si diluisce, cioè si aggiunge una quantità opportuna di solvente, facendo diminuire la concentrazione. Nelle soluzioni per pesata il soluto viene pesato e sciolto in una certa quantità di solvente.

Soluzioni per diluizione

La soluzione iniziale che vogliamo diluire si chiama soluzione madre o stock. La concentrazione dello stock può essere indicata col il valore di concentrazione assoluto (3M) oppure in modo relativo alla concentrazione d’uso (5X vuol dire che la soluzione madre è 5 volte più concentrata della concentrazione d’uso). In questo caso la soluzione d’uso si preparerà per diluizione della soluzione madre. Per preparare le diverse diluizioni posso utilizzare il metodo intuitivo o una formula diretta.

Metodo intuitivo

Una soluzione finale è diluita di 1:3 (un terzo) vuol dire 1 ml della soluzione madre + 2 ml di acqua. Diluiamo 4 ml di una soluzione madre con 8 ml di acqua distillata (volume finale è 12 ml), cioè 4 + 8 ml, che diluizione abbiamo operato? Il fattore di diluizione operato è 1:3.

Metodo diretto con formula

Posso applicare l’equazione quindi volume iniziale per concentrazione iniziale = volume finale per concentrazione finale. Voglio preparare 100 ml di HCl 0,1 M partendo da una soluzione concentrata 0,5 M. Applico la formula e scrivo:

V_i × C_i = V_f × C_f

Ottengo che il volume iniziale corrisponde a 20 ml. Devo aggiungere quindi 80 ml di solvente.

Soluzioni per pesata

Devo calcolare la quantità di sostanza da pesare, pesare la sostanza con una bilancia analitica o tecnica, infine devo sciogliere la sostanza nel solvente (becher) portando a volume con gli opportuni strumenti da laboratorio (cilindri, matracci, pipette). Per la misura delle masse lo strumento utilizzato è la bilancia. Le bilance scientifiche si distinguono tra loro per portata e sensibilità. La portata è il peso massimo che può sopportare la bilancia, effettuando ancora una misura corretta. La sensibilità è il peso minimo che la bilancia riesce a pesare in maniera corretta. Le bilance tecniche sono sensibili al millesimo del grammo 0,001 g. Le bilance analitiche consentono invece di apprezzare fino al decimo o al centesimo di mg 0,0001 g o 0,00001 g.

Per un corretto uso, la bilancia deve essere perfettamente pulita, posizionata su un piano antivibrazioni; il piano deve essere perfettamente orizzontale. Questa situazione si ottiene quando la livella a bolla d’aria è perfettamente centrata. L’aggiustamento si fa spostando i piedini regolabili. Per prima cosa si accende la bilancia e ci si assicura che il piatto sia pulito. Per ripulire il piatto da eventuali sostanze si utilizza un pennello. Successivamente la bilancia viene azzerata, si calcola la tara del contenitore su cui si intende pesare la sostanza e si trasferisce la sostanza da pesare, infine si annota il suo peso sul quaderno di laboratorio.

La concentrazione di una soluzione è il rapporto tra la quantità di soluto disciolta e il volume della soluzione. Diciamo che una soluzione è concentrata o diluita a seconda che a parità di volume contenga quantità maggiori o minori di soluto. La concentrazione di una soluzione può essere espressa in modi diversi:

• Molarità (M): Corrisponde al numero di moli di soluto contenuti in 1 litro di soluzione. 2 soluzioni con la stessa concentrazione molare contengono, a parità di volume, lo stesso numero di molecole di soluto.
• Molalità (m): Corrisponde al numero di moli di soluto contenuti in 1 kg di solvente.
• Percentuale (%): Esprime il rapporto percentuale tra quantità di soluto e quantità di solvente. La percentuale peso/volume (% P/V) si utilizza nel caso di soluti solidi in soluzioni liquide e si esprime come grammi di soluto contenuti in 100 ml di soluzione. La percentuale volume/volume (% V/V) si utilizza nel caso di soluti liquidi in soluzioni liquide e si esprime come ml di soluto contenuti in 100 ml di soluzione. La percentuale peso/peso (% P/P) si utilizza nel caso di soluti solidi in soluzioni solide e si esprime come grammi di soluto contenuti in 100 g di soluzione.

Una soluzione fisiologica (o soluzione salina) è una soluzione di cloruro di sodio (NaCl, sale da tavola) in acqua purificata. La soluzione fisiologica contiene NaCl 0,9 % (0,9 g di NaCl in 100 ml di soluzione).

Solubilità e saturazione

Esistono alcune sostanze che si mescolano tra loro in qualsiasi proporzione (acqua ed etanolo) ma, nella maggior parte dei casi, esiste una concentrazione massima, raggiunta la quale, il soluto non è più solubile e precipita formando il cosiddetto corpo di fondo. La solubilità di un soluto è la quantità massima di soluto che può essere disciolta in una quantità definita di solvente a una certa temperatura e la soluzione che ne risulta è definita satura.

La solubilità dipende dal composto considerato, dal solvente e dalla temperatura. In una soluzione satura la sostanza sciolta e quella non sciolta sono in equilibrio dinamico, vale a dire che la velocità con cui le particelle di fondo vanno a formare il corpo di fondo è la stessa con cui il corpo di fondo entra in soluzione. Quando la quantità di soluto in soluzione è maggiore di quella consentita dalla solubilità allora la soluzione è sovrasatura. Una soluzione sovrasatura si può ottenere per evaporazione di una parte del solvente (se il soluto è in stato solido) o per raffreddamento di una soluzione satura (quando la solubilità del soluto diminuisce con il diminuire della temperatura). La solubilità dei solidi nei liquidi è infatti fortemente influenzata dalla temperatura, in alcuni casi molto rari la solubilità cresce al diminuire della temperatura: è il caso del carbonato di litio e del solfato di cesio. La pressione influenza invece la solubilità dei gas.

La legge di Henry regola la solubilità dei gas in un liquido. Essa sostiene che un gas che esercita una pressione sulla superficie di un liquido vi entra in soluzione finché avrà raggiunto in quel liquido la stessa pressione che esercita sopra di esso. Ovvero che a temperatura costante, la solubilità di un gas è direttamente proporzionale alla pressione che il gas esercita sulla soluzione. Raggiunto l’equilibrio, il liquido si definisce saturo di quel gas a quella pressione. Tale stato di equilibrio permane fino a quando la pressione esterna del gas resterà inalterata, altrimenti, se essa aumenta, altro gas entrerà in soluzione; se diminuisce, il liquido si troverà in una situazione di sovrasaturazione e il gas si libererà tornando all’esterno fino a quando le pressioni saranno nuovamente equilibrate.

Il nostro organismo è composto da acqua per circa il 70 % in peso. La concentrazione dei soluti nei liquidi biologici è in genere mantenuta costante da complessi meccanismi di controllo, specifici per ogni soluto ed esercitati a livello renale, epatico, respiratorio, ormonale, ecc. Variazioni significative di questi valori sono spesso indice di patologie. L’omeostasi è l’insieme di processi con i quali l’organismo mantiene il proprio ambiente interno stabile a fronte di perturbazioni esterne o interne.

Soluzioni ioniche

Quando parliamo di soluzioni cellulari parliamo principalmente di soluzioni ioniche. Una soluzione ionica è costituita da acqua e cristalli di soluto. In un cristallo di cloruro di sodio NaCl, i singoli ioni sono tenuti insieme da forze di attrazione di natura elettrostatica tra particelle di carica opposta ossia tra Na⁺ e Cl^- (legami ionici). L’NaCl è strutturato sotto forma di reticolo cristallino e mantiene questa forma grazie all’instaurazione di legami ionici. Questo cristallo può sciogliersi solo in solventi polari come l’acqua. I fattori che determinano la dissoluzione di un solido ionico in un solvente polare sono due: energia reticolare del solido ed energia di attrazione ione-dipolo. L’energia reticolare del solido è la somma delle energie di attrazione fra anioni e cationi.