Appunti di lezioni di Colture microbiche

Scienze e tecnologie alimentari magistrale - UniMi

Appunti di lezioni di: colture microbiche per l'industria alimentare

Introduzione alle colture microbiche

Le colture microbiche che studieremo sono per:

• Settore lattiero-caseario
• Carne e pesce
• Prodotti da forno
• Vegetali
• Alimenti funzionali e probiotici
• Ago veterinario

I prodotti alimentari fermentati sono stati parte della dieta umana da almeno 10,000 anni a.C.

Fermentazione

Fermentazione = processo utilizzato dall'uomo per migliaia di anni, con un ruolo importante nella conservazione degli alimenti e nella produzione di alcol. È una combinazione di glicolisi con coinvolgimento finale, un processo anaerobico che converte gli zuccheri, come il glucosio, in altri composti come l'alcool, producendo energia per il microrganismo o la cellula. Dal punto di vista biochimico, la fermentazione è un processo metabolico di derivazione di energia da composti organici senza il coinvolgimento di un agente ossidante esogeno. La fermentazione svolge un ruolo diverso nella lavorazione degli alimenti.

Principali ruoli della fermentazione

• Conservazione degli alimenti mediante la formazione di metaboliti inibitori quali acido organico (acido lattico, acido acetico, acido formico, acido propionico), etanolo, batteriocini, ecc., spesso in combinazione con la diminuzione dell'attività dell'acqua (mediante essiccazione o uso di sale).
• Migliorare la sicurezza alimentare mediante l'inibizione degli agenti patogeni (pH) o la rimozione di composti tossici.
• Miglioramento del valore nutrizionale (vitamine, acidi grassi, produzione di aminoacidi essenziali, proteine o peptidi).
• Qualità organolettica dell'alimento (acido lattico, esopolisaccaridi, composti aromatici).

Le colture microbiche vengono utilizzate per standardizzare i prodotti finiti e per velocizzare i processi di trasformazione.

Chi?

I batteri e i lieviti sono microrganismi con la capacità enzimatica di fermentazione, in particolare. Molti prodotti diversi in tutto il mondo sono il risultato della fermentazione, che avviene in natura o attraverso l'aggiunta di una coltura di avviamento. Diverse specie batteriche e lievito sono presenti in ogni caso, contribuendo ai sapori unici e texture presenti negli alimenti fermentati.

Colture alimentari microbiche per la produzione alimentare

I MFC sono batteri vivi sicuri, lieviti o muffe utilizzati nella produzione alimentare che sono di per sé un ingrediente alimentare caratteristico. Sono lieviti, muffe e batteri vivi che vengono utilizzati come starter o come ingredienti. Ad esempio, nel gorgonzola, i due batteri lattici del lattosio vengono utilizzati come starter. In una seconda parte della maturazione, lavora il lievito. Sicure, cioè non devono portare rischi per uomo e animali.

Oltre a scegliere il microrganismo adatto, si dovrà scegliere il ceppo idoneo per ogni produzione alimentare.

Colture microbiche per la produzione alimentare

Componente essenziale di quasi tutti gli alimenti fermentati prodotti in commercio. Ad esempio, a seconda della stagionalità, lo yogurt potrà contenere più o meno urea. L'attività ureasica influenza molto la crescita di St in latte e quindi anche il numero di cellule iniziali di St varia con la stagionalità perché a seconda della stagionalità cambia la condizione di crescita di St. L'alimentazione delle vacche d'estate e d'inverno cambia e quindi cambia anche il contenuto di urea.

Microrganismi inoculati direttamente nei materiali alimentari al fine di portare sui cambiamenti desiderati e prevedibili nel prodotto finito. In relazione al mo inoculato possiamo aspettarci il metabolita desiderato, per quello è prevedibile.

Cambiamenti prevedibili

• Maggiore conservazione: prevenire lo sviluppo di patogeni; prevenire lo sviluppo di mo indesiderati e alterativi.
• Miglioramento del valore nutrizionale: degradazione da parte dei mo di alcuni componenti che non hanno valore nutrizionale e che talvolta diminuiscono la biodisponibilità.
• Qualità sensoriali modificate.
• Maggiore valore economico: i latti fermentati valgono di più del latte.

Anche se molti alimenti fermentati possono essere fatti senza una coltura di avviamento, l'aggiunta di microrganismi concentrati, sotto forma di coltura di avviamento, fornisce una base per garantire che i prodotti siano fabbricati secondo un calendario coerente, con qualità del prodotto coerenti (qualità prevedibile e costante nel tempo).

Cronistoria

Van Leeuwenhoek e Hooke (1665): microscopio, microrganismi. Pasteur (1860s): tecniche di coltura pura in microbiologia, vita senza aria. Lister (1870s): identificazione di batteri dell'acido lattico (LAB), Bacterium lactis. In the late 1880s: industria dedicata alla produzione di culture pure, Christian Hansen ha iniziato un'attività culturale che continua ancora oggi ad essere un importante fornitore di culture di avviamento per l'industria lattiero-casearia, della carne, della birra, della panificazione e del vino.

I ceppi di avviamento sono stati preparati dal produttore coltivando ceppi puri nel latte sterilizzato a caldo. Le aziende di cultura di avviamento mantengono uno staff di microbiologi altamente qualificati. L'industria è dominata da un piccolo numero di grandi imprese.

MFC per settore lattiero-caseario

1. Colture starter

Coltura microbiologica che effettua effettivamente la fermentazione. Essenziale per tutti gli alimenti fermentati prodotti. Formaggio erborinato, pasta filata stagionata, formaggio feta, formaggio di media stagionatura, stagionato formaggio, formaggio molle, burro. Starter per yogurt: (miscela di Streptococcus thermophilus e Lactobacillus delbrueckii subsp bulgaricus che converte il lattosio in acido lattico).

Tra i mo del latte si ha una protocoperazione, un mutualismo dove l'interazione è positiva per entrambi: Lb fornisce a St peptidi e aa perché St ha una scarsa attività proteolitica, St che è più ossigeno-tollerante, fornisce a Lb grazie all'attività ureasica, libera oltre che urea anche CO₂, rendendo anaerobico l'ambiente. Entrambi traggono vantaggio ma spesso sulla base della selezione dei ceppi, il mutualismo diventa sinergismo (1 + 1 = 3). Per ottenere sinergismo, si necessita di un'attenta selezione dei ceppi.

2. Colture starter secondarie

Per la produzione di burro, formaggi stagionati, formaggi semiduri, panna fermentata, formaggi a pasta molle. Essenziale per il sapore, la consistenza, l'aroma e la particolarità del formaggio. Direttamente inoculato nel latte di formaggio o spruzzato o spazzolato sulla superficie di fresco formaggi stagionati. Batteri, muffe e lieviti, stafilococchi.

3. Colture per maturazione delle croste

Per l'invecchiamento del formaggio, per "personalizzare" la produzione del formaggio, per migliorare la consistenza e il profilo organolettico, per proteggere la superficie del formaggio dalla crescita di indesiderati microrganismi che possono modificare l'aspetto esterno del formaggio. Ad esempio, proteggere la crosta da Lysteria monocytogenes uno tra i maggiori contaminanti della crosta di Gorgonzola.

Queste colture possono inibire in modo competitivo i microrganismi patogeni che possono apporsi sulla crosta. Per ottenere un risultato visivo costante, sia dal punto di vista del colore che da quello la consistenza della crosta. Mantenere e garantire il giusto sapore, il risultato di un equilibrio di diversi tipi di reazioni enzimatiche.

Esempi

• Candida krusei + Kluiveromyces marxianus: per la maturazione del formaggio tipo Harzer. Candida isolato da latte crudo, utilizzato per la produzione di formaggi del nord Europa (Austria).
• Brevibacterium linens: Alotollerante, tolleranza al sale, sviluppo di un pigmento arancione, aroma e sapore; mo aerobio, G+, con la forma che cambia in relazione alla fase di crescita (cocco > bastoncino). Molto tollerante all'ossigeno; ha delle protesi extracellulari che producono composti solforati (zolfo - metile - tioesteri) ed in particolare, questi composti solforati è il metantiolo (responsabile dell'odore di piedi del formaggio).
• Debaryomyces hansenii: alta attività proteolitica e lipolitica, neutralizzazione sulla superficie del formaggio per l'assimilazione dell'acido lattico. Grazie all'attività proteolitica, si ha una liberazione di ammoniaca che porta ad un innalzamento del pH del formaggio con neutralizzazione dell'acido lattico formato dai mo in prima fase di maturazione. È alotollerante, cresce. Viene utilizzato nei formaggi erboranti (tipicamente francesi) al posto di Saccharomyces cerevisiae
• Kluiveromyces marxianus: applicato come coltura di superficie, per lo sviluppo di aromi, per il controllo dello sviluppo di stampi indigeni, applicato per kefir. È lattosio positivo, sa utilizzare il lattosio, infatti, ha la beta galattosidasi.
• Staphylococcus xylosus: per formaggi teneri, stagionatura e aroma. Micrococcacee, anaerobio facoltativo, coagulasi negativo (un esoenzima) prodotto da mo coagulasi negativo. Modifica il fibrinogeno in fibrina, portando la coagulazione del sangue. Ha una forte attività lipolitica, quindi maturazione. Viene utilizzato anche nel settore carne. Ha come funzione la riduzione dei nitrati in nitriti. Ed è catalasi positivo (va a decomporre l'acqua ossigenata) e va a prevenire l'ossidazione dei lipidi. Alcuni producono anche delle batteriocine (anche contro Staphylococcus aureus e Lysteria). Le concentrazioni di questo mo arrivano fino a 10 - 9 Log/g di cellule vitali. Si distingue dallo Staphylococcus aureus perché è coagulasi positivo.
• Staphylococcus equorum: coagulasi negativo, inibizione della crescita della muffa. Viene utilizzato per inibire le muffe quei formaggi in cui non sono volute. Viene utilizzato per formaggi a pasta dura (svizzeri).
• Debaryomyces hansenii, Staphylococcus xylosus, Arthrobacter globiformis, Brevibacterium linens, and Geotrichum candidum: mix commerciale, fornito al cliente sulla base dell'esigenza del cliente. Per un trattamento superficiale uniforme e controllato nella produzione di formaggio pressato e molle dall'aspetto arancione.

4. Colture per aromatizzazione e formazione delle occhiature

Gruppo di colture aromatizzanti specificamente progettate per fornire più sapori al formaggio. Per frenare lo sviluppo di qualsiasi NSLAB (Non Starter Lactic Acid Bacteria, una flora batterica secondaria che è coinvolto nelle fasi di maturazione e maturazione del formaggio e non ha alcuna influenza diretta sulla fase iniziale di acidificazione). Ridurre al minimo le variazioni di aroma dovute ad una crescita indesiderata. Per il raggiungimento del livello desiderato di occhi nel prodotto finito.

Esempi

• Leuconostoc mesenteroides e Leuconostoc pseudomesenteroides: per la produzione di gas > occhiature. Produce CO₂. Talvolta produce batteriocine. Batteri lattici eterofermentanti, anaerobi facoltativi. Per formaggi olandesi, si attivano durante la terza fase di maturazione del formaggio perché non utilizzano bene il lattosio che è abbondante e quindi non si sviluppano all'inizio. Non hanno funzione principale quella di acidificare. Appartengono a diverse nicchie, infatti si sono adattati a diverse nicchie (vegetale e lattiero-casearia), cosa che ha fatto sì che hanno sviluppato un ampio spettro di proprietà biocatalitiche. Cosa che, per esempio, St non ha perché si è adattato all'interno del latte. Quindi l'adattamento all'interno del latte ha portato questa specie a perdere i geni legati alla patogenicità e alla virulenza, tipici delle specie di Streptococcus (S. pneumoniae). Infatti, St viene definito regresso perché ha perso tutti i geni legati alla patogenicità tipici del genere Streptococcus ma ha guadagnato la sua migliore adattabilità all'interno dell'ambiente latte, quindi la capacità di utilizzare il lattosio. Quindi ha perso la patogenicità ed è molto adattato all'ambiente latte mentre i Leuconostoc si sono adattati a diverse nicchie, quindi hanno un grosso spettro di azione e tante proprietà biocatalitiche.
• Propionibacterium freudreichii: per il tipo di formaggio svizzero; fermenta lattosio e lattato e produce anidride carbonica, acido propionico e acido acetico; acidi grassi a corta catena, acidi grassi liberi che derivano dalla lipolisi del grasso del latte. Resiste molto allo stress termico, tipico stress imposto per la produzione dell'Emmental. Cresce anche a temperature di frigorifero, quindi sviluppa l'aroma anche in conservazione. Tutti i ceppi hanno queste attività ma vanno controllate queste attività a livello di ceppo. [La selezione delle colture microbiche deve essere ceppo specifica]. Possono utilizzare oltre che il lattosio per fonte di energia, anche l'acido lattico e dal lattato tornano a privato con produzione di ATP. Il privato può essere ossidato ad acetato + CO₂ oppure ridotto a dare propionato. Resistente anche allo stress osmotico.
• Lactococcus lactis spp. lactis biovar diacetylactis: per la fermentazione del citrato. Insieme a St è una tra le colture più importanti nel settore lattiero caseario. Dal citrato produce diacetile (aroma del burro), fondamentale per i prodotti lattiero caseari. Il citrato viene trasportato tramite la citrato permeasi e scisso in acetato + ossalacetato da una citrato liasi. L'ossalacetato diventata substrato dell'ossalacetato decarbossilasi che porta alla produzione di CO₂ e formazione di privato che porta alla formazione di alfa-aceto-lattato + CO₂. alfa-aceto-lattato subisce una decarbossilazione ossidativa a dare diacetile e decarbossilazione non ossidativa a dare acetoino. È fondamentale che ci sia oltre al citrato anche l'ossigeno perché favorisce l'azione della alfa-aceto-lattato sintasi. Essendo che i lactococchi producono diacetile, vengono anche chiamati aroma bacteria.
• Enterococcus faecium: per esaltare il sapore del formaggio. Batterio lattico Gram +, resistente al sale e cambiamenti di pH e temperatura. L'aroma di formaggio deriva dal metabolismo primario della glicolisi e lipolisi e proteolisi della caseine. Producono le batteriocine. È sintomo di scarsa igiene perché spesso derivano dall'intestino umano. Si trova anche nel settore della carne.
• Lactobacillus fermentum: per formaggi con occhiature limitate (Cheddar, Emmentaler). Viene utilizzato come starter per il caciocavallo silano. Può avere delle caratteristiche di probiotico. Viene selezionato per la produzione di piccole occhiature ma anche per l'attività esterasica, aroma fruttato nel formaggio.

Selezione ceppo-specifica

Su cosa si basa la selezione ceppo-specifica? Si basa sulla selezione di mo con caratteristiche fenotipiche ma nello specifico caratteristiche biochimiche e fisiologiche.

5. Colture per protezione

Preparati costituiti da microrganismi vivi (colture pure o concentrati di colture) aggiunti agli alimenti allo scopo di ridurre i rischi derivanti da microrganismi patogeni o tossigeni.

• Anti-lievito e -Muffe, anti-Listeria monocytogenes, anti-Clostridi (per evitare il soffiaggio tardivo e l'odore sgradevole), anti altri microrganismi di deterioramento.
• Fermenti per la protezione contro i microrganismi inquinanti di yogurt, latte fermentato, formaggi freschi, semiduri e a pasta dura, senza lasciarli interferire con le colture autoctone o le colture altrimenti utilizzate nella produzione. Non devono competere con gli starter, loro devono essere autonomi. Quindi non devono rubare le fonti di carbonio ai microrganismi fermentativi.
• Le colture aiutano a controllare e proteggere il prodotto da alterazioni e migliorare la conservabilità.
• Possono essere utilizzati in prodotti con indicazioni "clean label" perché caratterizzati da una bio-protezione naturale.
• I fermenti selezionati non acidificano, né alterano le caratteristiche organolettiche del prodotto e si adattano facilmente anche alle temperature di refrigerazione (es. Carnobacterium spp, Carnobacterium divergens, Carnobacterium maltaromaticum).

Inibiscono Lysteria a dare acido lattico (conservante) e producendo batteriocine.

Efficacia delle colture protettive

L'efficacia delle colture protettive si basa sui seguenti principi:

• Esclusione concorrenziale, ad esempio attraverso la concorrenza per le sostanze nutritive e/o i siti di legame sul substrato, o attraverso un migliore adattamento al contenuto di ossigeno.
• Formazione di sostanze antagonisticamente attive, ad es. con acidi organici lactobacilli (e.g. lattici, acetici, propionici, formici, acido benzoico), etanolo, H₂O₂, CO₂, batteriocini (peptidi sintetizzati ribosomali, proteine e composti polipeptidici come Nisin) nonché antibiotici o altri principi antagonisticamente attivi con attività antimicotica o antibatterica.

Piccolina prodotta da maltaromaticum; Diviricina prodotta da divergens.

Lieviti

I lieviti costituiscono un gruppo separato di culture che sono indubbiamente cruciali per alcuni prodotti del settore lattiero-caseario. Il loro contributo è essenziale per creare la giusta struttura e sapore di un formaggio o di un latte fermentato. Spesso la loro azione deve evolvere in un delicato coordinamento con altri microrganismi presenti nella produzione, conferendo al prodotto finito le sue caratteristiche tipiche. Garantire uno sviluppo controllato di CO₂ per la produzione di formaggi erborinati, come il Gorgonzola.

Saccharomyces spp, Saccharomyce cerevisiae, Debariomyces hansenii, Kluyveromyces lactis, Kluyveromyces marxianus, Candida utilis (degradazione del lattato, neutralizzazione della cagliata).