Appunti di Biologia Molecolare

Biologia molecolare

Appunti del corso di Biologia molecolare da 9 CFU svolto dal prof. Vincenzo Cavalieri

Nicola Milano

Università degli studi di Palermo – CDL in Scienze biologiche

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Sommario

• 1. Introduzione alla Biologia molecolare ........................................................................................................... 5
• Dogma centrale della Biologia molecolare ................................................................................................... 5
• Dalla scoperta del DNA alla dimostrazione del suo ruolo come materiale genetico .................................... 6
• Esperimento di Griffith .............................................................................................................................. 7
• Esperimento di Avery ................................................................................................................................ 8
• Esperimento di Hershey-Chase ................................................................................................................. 9
• Il modello a doppia elica del DNA ............................................................................................................ 10
• Le regole di Chargaff ................................................................................................................................ 10
• 2. Struttura degli acidi nucleici ........................................................................................................................ 12
• Struttura fisica del DNA ............................................................................................................................... 12
• Parametri strutturali della doppia elica ................................................................................................... 13
• Conformazioni del DNA ........................................................................................................................... 15
• DNA a tripla elica ..................................................................................................................................... 19
• DNA a quadrupla elica ............................................................................................................................. 19
• Forcine e strutture cruciformi ................................................................................................................. 20
• Topologia del DNA ....................................................................................................................................... 21
• Avvolgimento e superavvolgimento ........................................................................................................ 21
• Topoisomerasi ......................................................................................................................................... 23
• Struttura dell’RNA ....................................................................................................................................... 26
• Struttura del tRNA ................................................................................................................................... 28
• 3. Impacchettamento del DNA genomico: cromosomi e cromatina ............................................................... 28
• Impacchettamento del genoma batterico ................................................................................................... 28
• Organizzazione e impacchettamento del genoma eucariotico ................................................................... 30
• 4. Replicazione del DNA ................................................................................................................................... 52
• Replicazione semi-conservativa del DNA .................................................................................................... 52
• Esperimento di Meselson e Stahl ............................................................................................................ 53
• Meccanismo della replicazione ................................................................................................................... 54
• Identificazione dell’origine di replicazione in E. coli ................................................................................ 56
• Processo replicativo nei procarioti .......................................................................................................... 56
• Problemi topologici durante la replicazione ........................................................................................... 67
• Processo replicativo negli eucarioti ......................................................................................................... 68
• 5. Trascrizione del DNA ................................................................................................................................... 73
• Espressione genica ...................................................................................................................................... 73
• Trascrizione nei procarioti ........................................................................................................................... 75
• Topologia della trascrizione ..................................................................................................................... 77
• Promotori procariotici ............................................................................................................................. 78
• Regolazione della trascrizione nei procarioti .............................................................................................. 84

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• Operone Lac ............................................................................................................................................. 86
• Operone Gal ............................................................................................................................................. 90
• Operone araBAD ...................................................................................................................................... 92
• Operone Mer ............................................................................................................................................ 93
• Gene glnA ................................................................................................................................................ 93
• Operone Trp ............................................................................................................................................ 94
• Trascrizione negli eucarioti .......................................................................................................................... 99
• Regolazione della trascrizione negli eucarioti ........................................................................................... 105
• Meccanismi d’azione dei repressori ...................................................................................................... 109
• Promotori RNA polimerasi I ................................................................................................................... 110
• Promotori RNA polimerasi III ................................................................................................................. 110
• 6. Processamento del trascrittoma ............................................................................................................... 111
• Capping dell’mRNA .................................................................................................................................... 111
• Poliadenilazione dell’mRNA ...................................................................................................................... 113
• Splicing dell’mRNA ..................................................................................................................................... 116
• Trans-splicing ......................................................................................................................................... 122
• Splicing alternativo ................................................................................................................................ 122
• Editing dell’mRNA ...................................................................................................................................... 125
• Processamento dell’ncRNA ....................................................................................................................... 127
• Micro-RNA ............................................................................................................................................. 128
• 7. Sintesi proteica .......................................................................................................................................... 133
• Codice genetico ......................................................................................................................................... 133
• tRNA ........................................................................................................................................................... 136
• ARS ......................................................................................................................................................... 138
• rRNA e ribosomi ......................................................................................................................................... 139
• Anatomia del ribosoma ......................................................................................................................... 141
• Selezione dell’AUG nei procarioti .............................................................................................................. 143
• Fase d’inizio nei procarioti ......................................................................................................................... 144
• Fase d’inizio negli eucariotici ..................................................................................................................... 145
• Traduzione indipendente dal Cap al 5’ .................................................................................................. 147
• Fase d’allungamento nei procarioti e negli eucarioti ................................................................................ 147
• Entrata dell’aa-tRNA .............................................................................................................................. 148
• Formazione del legame peptidico ......................................................................................................... 150
• Traslocazione ......................................................................................................................................... 151
• Fase di terminazione nei procarioti e negli eucarioti ................................................................................ 153
• Rilascio del polipeptide .......................................................................................................................... 154
• Post-terminazione ................................................................................................................................. 155
• Regolazione della sintesi proteica ............................................................................................................. 155

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• Antibiotici che bloccano la sintesi proteica ........................................................................................... 155
• Meccanismi di ricodificazione ............................................................................................................... 156
• Controllo traduzionale dell’espressione genica .................................................................................... 160
• Meccanismi di controllo della qualità dell’mRNA ................................................................................. 162

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1. Introduzione alla Biologia molecolare

Dogma centrale della Biologia molecolare

Il dogma centrale della biologia molecolare è un assioma che serve a descrivere il flusso di informazioni che viene riscontrato all’interno di un sistema biologico (appartenente ad ogni dominio ed avente qualsiasi livello di complessità). Le informazioni in questione sono contenute stabilmente all’interno del DNA. Il vero patrimonio di DNA che caratterizza ogni forma vivente prende il nome di genoma. Il DNA quindi è il depositario di tutta l’informazione genetica che caratterizza quella particolare forma di vita.

Il DNA può andare incontro ad un processo di auto-perpetuazione in quanto può duplicarsi ed essere trasmesso, con tutta la mole di informazioni che contiene, alle generazioni successive. Parte dell’informazione contenuta nel DNA deve essere selettivamente utilizzata (a seconda del tipo cellulare, a seconda del momento di vita della cellula e a seconda delle condizioni ambientali) e per dar luogo a molecole che sono gli RNA messaggeri (mRNA) l’unico tipo di RNA codificante.

Tutta la popolazione degli RNA (codificanti e non codificanti) prende il nome di trascrittoma. Il meccanismo biochimico che dal DNA dà luogo all’RNA (indipendentemente dal fatto che quest’ultimo sia codificante o meno) si chiama trascrizione. Dall’RNA bisogna esplicare la quota d’informazione che si sta traendo dal DNA dato che l’RNA rappresenta un intermedio in questo processo di espressione dell’informazione genetica.

Il materiale risultante che si ottiene da questa quota di informazione sarà una proteina che si ottengono attraverso un meccanismo biologico che prende il nome di traduzione (tutte le proteine prodotte costituiscono il proteoma). È possibile notare nello schema un flusso unidirezionale dell’informazione che viene selettivamente utilizzata dal genoma fino al proteoma.

Soltanto il genoma è costante ed invariante per quella particolare forma vivente e nel caso in cui sia un organismo multicellulare, anche se i tipi cellulari che lo costituiscono sono differenti, il genoma contenuto in ogni cellula di questo organismo sarà sempre identico. Al contrario esiste un’elevatissima dinamicità in quello che è il contenuto quali-quantitativo del trascrittoma e del proteoma.

Queste due componenti che sono interconnesse fra loro cambiano a seconda del tipo cellulare ma anche all’interno della stessa tipologia di cellule a seconda delle condizioni ambientali, del ciclo cellulare e in base alle segnalazioni delle fonti di stress a cui è sottoposta la tipologia di cellule in questione. Il trascrittoma e il proteoma possiedono questa plasticità che si manifesta in risposta a particolari stimoli endogeni ed esogeni.

Quella descritta finora è la descrizione originale del dogma centrale che nel corso dei decenni ha subito diverse modifiche. Infatti è stato scoperto che una quota dell’informazione contenuta nel DNA non dipende esclusivamente dal contenuto quali-quantitativo del DNA ma anche da una serie di modificazioni che possono essere associate al DNA, ovvero la cosiddetta epigenetica.

Il concetto chiave dell’epigenetica è che l’informazione genetica rimane inalterata però può variare, ad esempio, lo stato conformazionale dello stesso genoma e questo può avere come conseguenza la produzione di trascrittomi e proteomi differenti. Nello schema è possibile notare il “doppio senso di circolazione” tra RNA e DNA.

Infatti studi effettuati su particolari agenti biologici (i retrovirus) hanno messo in evidenza l’esistenza di un enzima (trascrittasi inversa), unico nel suo genere e non ritrovato in nessun’altra forma di vita, che è in grado di catalizzare la reazione opposta a quella della trascrizione e cioè utilizzare uno stampo di RNA per generare DNA.

In alcuni virus (chiamati ribovirus) il patrimonio genetico è rappresentato esclusivamente da RNA che è in grado di replicare e di auto-perpetuarsi. Infine anche le proteine possono comportarsi da tratti ereditari e questo aspetto è stato riscontrato nei prioni, proteine che hanno una certa “conformazione” e che possono indurre in tale “conformazione” altre proteine che si ritrovano nella conformazione canonica.

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Dalla scoperta del DNA alla dimostrazione del suo ruolo come materiale genetico

Johan Friedrich Miescher (Basilea, 13 agosto 1844 – Davos, 26 agosto 1895) è stato un biologo svizzero, che isolò per la prima volta gli acidi nucleici. Il laboratorio (situato nei sotterranei di un vecchio castello) dove Miescher isolò per la prima volta la nucleina.

Egli evidenziò infatti nel 1869, presso i laboratori di Felix Hoppe-Seyler a Tubinga, la presenza di vari composti chimici ricchi in fosfato all'interno dei nuclei dei leucociti. La scoperta di tali molecole, che egli denominò nucleina, aprì la strada all'identificazione del DNA come molecola responsabile della conservazione e della trasmissione dei caratteri ereditari.

Miescher proveniva da una famiglia molto in vista nella comunità scientifica: il padre e lo zio erano infatti stati professori di anatomia all’università. Timido ed intelligente, il giovane Miescher studiò medicina proprio a Basilea e, durante gli studi, lavorò per un'estate (nel 1865) presso il chimico organico Adolf Stecker a Gottinga.

A causa di una febbre tifoide, che gli provocò anche gravi problemi all'udito, Miescher dovette interrompere gli studi per un anno, per laurearsi in ogni caso nel 1868. Ritenendo che la sua sordità parziale potesse ostacolare l'attività di medico, Miescher si avviò verso la carriera di chimico fisiologo.

Iniziò a studiare i linfociti, ma Felix Hoppe-Seyler lo incoraggiò a studiare i leucociti. Miescher era infatti interessato soprattutto nello studio della chimica del nucleo: dal momento che era difficile ottenere un numero di linfociti sufficienti per uno studio, la scelta ricadde sui leucociti, che erano noti per essere il principale componente del pus, ottenibile facilmente dalle garze usate nei vicini ospedali.

Per evidenziare il nucleo dei leucociti presenti nel pus, Miescher dovette mettere a punto un protocollo totalmente nuovo. Per recuperare le cellule dai bendaggi, utilizzò una soluzione salina a base di solfato di sodio. Per separare i nuclei dai citoplasmi, sottopose le cellule ad una soluzione alcalina, seguita da una acida. Il precipitato formatosi in seguito a tale processo fu, appunto, chiamato nucleina. In seguito Miescher scoprì