Appunti completi istologia

Istologia lezione 1 02/03/2021

I livelli di organizzazione della materia vivente

• Cellula
• Tessuto
• Organo=insieme di tessuti che cooperano;
• Apparato=insieme di organi che cooperano.

L’istologia è una scienza morfologica che studia la struttura morfologica dei tessuti, attraverso metodiche atte alla loro identificazione.

Il tessuto è definito come un gruppo di cellule che lavorano in cooperazione.

Le diverse cellule che troviamo all’interno di un tessuto hanno aspetto e origine differente, ma un fine comune.

Nel corpo umano individuiamo 4 tipi di tessuto:

• Epiteliale
• Connettivo
• Nervoso
• Muscolare

Unità di misura e limite di risoluzione

Alcune unità di misura utilizzate in questo ambito:

• µm è la millesima parte del mm
• nm è la millesima parte del µm; utilizzata per organuli subcellulari.

Limite di risoluzione: distanza minima fra due punti vicini, percepibili come distinti.

• Occhio umano 0.1 mm
• Microscopio ottico/luce 0.2 µm
• Microscopio elettronico 0.4 nm
• Microscopio crioelettronico 0.2 nm

N.B. I limiti di risoluzione dei microscopi ottici sono dati dalla formula di Abbe:

d= 0.612 • λ / n • sinα

Dove: λ = lunghezza d’onda della luce; n = indice di rifrazione del mezzo interposto* tra lente frontale dell’obiettivo, e il preparato; n • sinα è riducibile a N, che sarebbe l’apertura numerica dell’obiettivo (> è il suo numero, migliore sarà l’obiettivo).

*solitamente è l’aria, ma grazie ad alcuni obiettivi ad immersione, può essere acqua, oppure particolari oli di sintesi che aumentano l’indice di rifrazione fino a 1.5

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Diversi tipi di microscopio

• Microscopio ottico/luce. Una fonte luminosa, posta sotto al preparato (che dev’essere estremamente sottile) produce un fascio di luce che lo attraversa, entrando negli obiettivi, e poi negli oculari, che producono l’ingrandimento dell’immagine osservata. Sugli obiettivi sono riportati due numeri: numero di volte che ingrandisce/apertura numerica. Per calcolare quanto un determinato obiettivo ingrandirà l’immagine: ingrandimento obiettivo x ingrandimento oculare.
• Microscopio elettronico. Al posto del fascio di luce viene impiegato un fascio di elettroni, che attraversa una colonna sottovuoto, e deviato poi dal preparato, in modo che proietti un cono d’ombra su uno schermo fluorescente. Le zone più elettrondense risulteranno nere. L’immagine con questo microscopio è visualizzata in bianco e nero, vi è la possibilità di colorare le varie componenti in seguito, utilizzando un computer.

-3λ degli elettroni = 10 nm

• Microscopio crioelettronico. Una tipologia di m.e. in cui il materiale utilizzato è congelato, e pertanto più resistente al riscaldamento provocato dal fascio di elettroni. È stato impiegato per analizzare la proteina Spike del Sars-CoV-2.
• Microscopio elettronico a scansione. Offre un’immagine 3D della superficie del campione, sempre in bianco e nero.
• Microscopio confocale. Permettono un’osservazione a fluorescenza, elimina ad ogni piano focale i pixel non definiti, offrendo un’immagine finale molto nitida.

N.B. L’ingrandimento dell’immagine non ne determina una migliore risoluzione.

Step per allestire il preparato

• Fissare cellula o tessuto: uccidere istantaneamente ogni attività vitale, anche a quella degli enzimi che porterebbero all’apoptosi. Senza questo processo, le cellule del tessuto andrebbero incontro a degradazione, e quello osservato sarebbe un artefatto. Esistono delle sostanze che permettono di effettuare questa operazione, e sono chiamati fissativi. Vengono utilizzati fissativi:

Chimici: sono liquidi, in cui vengono immersi i tessuti dalle 4-48 ore

• Alcoli: svolgono la loro funzione sostituendosi all’acqua all’interno della cellula;
• Aldeidi: come formaldeide, utilizzata in soluzione acquosa al 4%, che prende il nome di formalina; è in grado di inattivare gli enzimi, cambiando la loro struttura terziaria.

Fisici.

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• Congelamento: dev’essere istantaneo, l’acqua contenuta nel tessuto deve vitrificare; ciò può avvenire con getto di CO a -70ºC, o con immersione in azoto liquido a2-196ºC.
• Sciacquare
• Disidratare: tramite l’uso di soluzioni alcoliche a dosaggio crescente (da 50% acqua e 50% alcol, fino ad alcol puro); questo, andrà a sostituirsi all’acqua presente nelle cellule del tessuto che vogliamo osservare.
• Xilene o xiloro: passaggio aggiuntivo, che permette una migliore penetrazione della paraffina all’interno delle cellule.
• Inclusione: processo necessario per procedere con il taglio del campione, permette di indurire il tessuto per poterlo tagliare in modo adeguato. Vengono impiegate sostanze inizialmente liquide, fatte penetrare all’interno del tessuto, e che poi solidificano, irrigidendo le strutture cellulari. Solitamente si utilizzano:

• Paraffina: per preparati da osservare al microscopio ottico; alla temperatura di 55-60ºC risulta liquida.
• Ecom: una resina impiegata per preparati da osservare al microscopio elettronico.

• Taglio: si utilizzano degli apparecchi noti come microtomi, con i quali è possibile ottenere sezioni molto sottili di tessuto; in particolare:

• 4-10 µm per preparati da microscopia ottica;
• Alcune decine di nm per preparati da microscopia elettronica.

• Colorazione: molto spesso le strutture cellulari sono incolori, o c’è poco contrasto fra esse. Una colorazione adeguata permette di mettere in risalto ciò che più ci interessa osservare in un preparato. La più utilizzata è la colorazione ematossilina-eosina; consiste nell’impiego dei due omonimi coloranti:

• L’ematossilina è un colorante basico blu-violaceo, che colora di blu strutture basofile (strutture acide),
• L’eosina è un colorante acido rosso-rosa, che colora di rosso strutture acidofile (sostanze basiche).

Si definisce “comune preparato” se fissato con formalina, incluso con paraffina, e colorato con colorazione ematossilina-eosina. In un comune preparato NON si colorano i lipidi e i glucidi.

Nell’immagine a lato osserviamo la sezione trasversale di un villo intestinale, trattato con colorazione ematossilina-eosina. Le parti evidenziate in blu sono nuclei, quindi acidi perché contengono acidi nucleici (basofili); quelle in rosso sono acidofile (notare l’orletto a spazzola delle cellule epiteliali, leggermente più marcato, che segna il contorno del villo). I rigonfiamenti non colorati sono ghiandole mucipare caliciforme, e sono incolori perché contengono muco (ricco di glucidi).

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A lato una visione al microscopio elettronico dell’orletto a spazzola degli enterociti, formato da microvilli (aumentano fino a 50 volte la superficie utile all’assorbimento) che ricoprono la superficie apicale di queste cellule. I microvilli risultano acidofili perché all’interno dei microvilli sono presenti filamenti di actina (proteina del citoscheletro che mantiene eretta la loro struttura) che è basica.

A lato osserviamo un comune preparato di una fibra muscolare striata scheletrica. Le zone rosse, sono acidofile, e sono date da filamenti contrattili di actina e miosina nella fibra muscolare, e sono proteine basiche.

A lato, un preparato di pancreas esocrino; risulta particolare perché compaiono delle porzioni violacee, e quindi basofile, anche nel citoplasma, e non più solo nel nucleo. Quando osserviamo basofilia citoplasmatica, nel 99% dei casi, è l’RNA a dare questa basofilia, in associazione con proteine a formare ribosomi; questi organuli sono adibiti alla sintesi proteica. Quindi il citoplasma basofilo, suggerisce che la cellula che stiamo osservando ha una spiccata sintesi proteica; in questo caso il pancreas esocrino produce enzimi digestivi.

Istochimica

Permette di identificare in situ (in vetrino) i costituenti chimici di cellule e tessuti mediante specifiche reazioni di colorazione.

• Lipidi: rosso Congo, Sudan nero
• Polisaccaridi: PAS (Acido Periodico - reattivo di Schiff)
• Proteine: reazione di millon
• DNA: Feulgen

PAS (colorazione tipica per zuccheri)

L’acido periodico ossida gruppi ossidrili degli zuccheri in aldeidi, che vengono evidenziati di un colore rosso dal reattivo di Schiff. Tutti gli zuccheri si dicono PAS positivi.

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1) 2)

Nell’immagine 1 osserviamo un epatocita trattato con PAS; nella 2 è stata ricavata una sezione nuova, inferiormente a quella prima osservata, e trattata con enzima digerente il glicogeno (zucchero evidenziato in questo caso), la deidrogenasi, e successivamente con PAS.

Si noti come il colore risulta più chiaro in assenza di glicogeno.

Immunoistochimica

È una branca dell’istochimica, che permette l’identificazione dei costituenti cellulari e tissutali, come antigeni in situ, utilizzando anticorpi. Il complesso antigene-anticorpo non è visibile, e pertanto servono dei marcatori. Esistono 2 tipi di marcatori:

• Fluorescenti
• Enzimatici

Ripasso citologia

Teoria cellulare (1839)

La cellula è l’unità strutturale e funzionale di ogni organismo vivente; ogni cellula ha origine da un’altra cellula, ed è la più piccola struttura capace di vita autonoma.

Le dimensioni cellulari nel corpo umano variano da 4-150 µm.

Ogni cellula acquista la propria forma e funzione in seguito al processo di differenziamento.

Nella cellula animale distinguiamo 3 compartimenti:

• Citoplasma
• Nucleo
• Membrana plasmatica (o plasmalemma). Il suo spessore è di 8 nm ed è visibile solo a microscopio elettronico, come 2 strati elettrondensi che ne circondano uno meno elettrondenso.

Visione nella membrana plasmatica a microscopio elettronico. Rappresentazione grafica della membrana plasmatica.

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È costituita da componenti di diversa natura:

• Lipidi. Troviamo i fosfolipidi a costituire la membrana plasmatica; sono cellule antipatiche dotate di una testa polare rivolta verso l’esterno/interno della cellula, e delle code apolari rivolte nel mezzo. Si pensa che il doppio strato elettrondenso visibile a microscopio elettronico corrisponda alle teste polari, mentre quello meno elettrondenso alle code apolari. Depositi di colesterolo formano zattere lipidiche.
• Proteine. In base al loro rapporto con la membrana distinguiamo:

• Estrinseche, se poggiate sulla superficie esterna
• Intrinseche/integrali se poggiate sulla superficie interna
• Transmembrana, se attraversano da parte a parte la membrana.

Le proteine del feltro proteico formano una rete sul lato citoplasmatico, mantenendo la forma; nelle cellule dei muscoli striati questa rete è formata da distrofina, e lega la membrana su filamenti contrattili di actina e miosina.

• Glucidi. Sono legati covalentemente principalmente alle proteine, si trovano sempre all’esterno della cellula a formare il glicocalice. Hanno funzione di interazione e riconoscimento tra cellule; le glicoproteine e/o glicolipidi sono anche chiamati antigeni di superficie, e hanno ruolo di comunicazione tra cellule.

Il plasmalemma degli eritrociti è stato studiato per la ricerca sulla membrana plasmatica, poiché costituiti da questa è emoglobina.

Eritrociti posti in soluzione ipotonica si gonfiano, fino a farli scoppiare; l’emoglobina si deposita sul fondo, mentre le membrane vuote rimangono in superficie, riassemblandosi nella forma originaria di disco biconcavo (chiamate ghost, perché non più colorati).

Il modello della membrana è detto a mosaico fluido, i fosfolipidi a temperatura corporea sono, appunto, fluidi. Esistono però dei vincoli per le proteine di superficie, che non possono muoversi liberamente e in modo autonomo, e sono:

• Zattere lipidiche, che permettono il movimento delle proteine sulla membrana.
• Proteine del feltro proteico formano una rete sul lato citoplasmatico. Nei globuli rossi troviamo la spettrina, che mantiene la particolare forma a disco biconcavo, ed è responsabile della plasticità degli eritrociti, che sono in grado di ridurre il loro diametro per poter scorrere in vasi di dimensioni inferiori, per poi tornare a quella originale; nelle cellule dei muscoli striati questa rete è formata da distrofina, che lega la membrana ai filamenti contrattili di actina e miosina.

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Istologia lez 2 09/03/2021

Le diverse sostanze attraversano la membrana plasmatica per:

• Diffusione semplice, secondo gradiente di concentrazione si muovono:

• Acqua
• Gas respiratori (ossigeno, anidride carbonica e azoto)
• Sostanze liposolubili (es. alcol, ormoni lipidici, colesterolo)

• Proteine canali: sono proteine transmembrana con un canale. Poche sono sempre aperte, perché solitamente hanno un meccanismo di chiusura che può avere diverse modalità di controllo:

• Canali a controllo di ligando: si aprono in seguito al legame di una proteina del canale con una specifica molecola. Es, neurotrasmettitori sono il ligando che nell’elemento post-sinaptico si legano con il recettore, provocando una reazione nell’elemento post-simpatico stesso.
• Canali a controllo di voltaggio (o potenziale): si aprono quando la differenza di potenziale tra i due lati della membrana raggiunge un determinato valore. Es. nella sinapsi: sulla membrana del neurone viaggia una differenza di potenziale, quando raggiunge il bottone sinaptico provoca l’apertura dei canali per il calcio, che entrando della cellula provoca il rilascio del neurotrasmettitore.
• Canali a controllo meccanico: si aprono in seguito a stimolazione meccanica del canale. Es. nell’orecchio interno, nell’organo del Corti ci sono delle stereociglia che vengono mosse fisicamente dalle onde sonore, e questo movimento provoca l’apertura dei canali per il calcio.

Permettono il passaggio secondo gradiente di molecole piccole:

• Glicogeno
• Ioni
• Acqua attraverso acquaporine

• Carrier/trasportatori/permeasi: legano una molecola da trasportare in maniera reversibile, subiscono una modificazione conformazionale reversibile aprendosi sull’altro lato della membrana per rilasciare la molecola che avevano legato. Possono svolgere:

• Trasporto secondo gradiente (da dove concentrazione è > a dove è <), non necessita di energia;
• Trasporto contro gradiente, necessitano di energia sotto forma di ATP. Vengono chiamate pompe di membrana, la più nota è la pompa sodio-potassio: per ogni molecola di ATP idrolizzata, vengono espulse 3 ioni sodio, e immesse 2 ioni potassio; provoca una distribuzione asimmetrica degli ioni tra i due lati, garantendo il mantenimento del potenziale di membrana*. Il potassio tende ad uscire, seguendo il suo gradiente, attraverso canali di fuga del potassio, per cui essendo ioni positivi, ne deriva che l’interno della cellula è negativo, rispetto a quello esterno.

*in condizioni di equilibrio è pari a 70 mV

Un’altra pompa di membrana la pompa ABC (ATP Binding Cassette), e ultimamente è molto studiata per