Appunti completi di Genetica avanzata

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Cdl Biologia Molecolare e Applicata AA 2020/2021 Dorian Fink© Dorian Fink © Dorian Fink© Dorian Fink© Dorian Fink© Dorian Fink © Dorian Fink © Dorian Fink ©

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Programma: genetica avanzata - 6 CFU – CdL Biologia Molecolare e Applicata – A.A. 2020/21

Alessio Mengoni

Dip. di Biologia Via Madonna del Piano 6, Sesto Fiorentino Tel. 0554574738; alessio.mengoni@unifi.it

• Epistemologia dello studio genetico
  In cosa consiste l’approccio genetico alle scienze della vita. Limiti e vantaggi. Ruolo dei modelli di studio.
• Concetto di gene
  Storia del concetto di gene, scoperte ed esperimenti chiave e implicazione dei modelli di studio utilizzati.
• Evoluzione dei geni
  De novo gene birth, paraloghi e ortologhi, exon shuffling, metodi sperimentali e computazionali per lo studio dell’evoluzione dei geni.
• Evoluzione dei genomi
  Genomica comparativa. Ruolo degli elementi trasponibili. Ibridazione e poliploidia. Pangenoma. Mobilome. Genomi mitocondriali e cloroplastici. Sequenziamento completo dei genomi e metodi computazionali di analisi e confronto tra genomi.
• Dalla mutazione all’evoluzione delle specie: metodi e aspetti teorici della genetica delle popolazioni
  Metodi sperimentali per l’identificazione e lo studio dei polimorfismi tra individui. Frequenze geniche e modello neutrale. Metodi statistici di stima della diversità genetica, del flusso genico tra popolazioni e del differenziamento tra individui e popolazioni (H, FST, analisi cluster, analisi multivariata, test di Mantel).
• Dal gene al fenotipo: metodi molecolari e modelli quantitativi
  La biologia dei sistemi. Modello dell’eredità poligenica. Ereditabilità di un carattere. Studi di associazione genoma-fenotipo. Metodi statistici di associazione tra polimorfismi e fenotipi (LOD score, Odd ratio, regressione). Marker-assisted selection. Sviluppo di un test genetico diagnostico.
• Genetica dello sviluppo
  Cenni alle cascate dei geni del differenziamento della larva di Drosophila. Conservazione dei geni hox.
• Modifiche genetiche degli organismi: aspetti tecnici e normativi
  Metodi per la produzione di organismi geneticamente modificati in batteri, piante e animali. Normativa di riferimento italiana ed europea.

Testi consigliati

Un qualunque testo di genetica sufficientemente aggiornato. Esempio:

Russell. Genetica. Un approccio molecolare. Pearson- Lewin. Genes XI o seguenti-Articoli su riviste scientifiche forniti a lezione (come file pdf) e presenti sulla piattaforma Moodle Slide delle lezioni (file pdf) e video registrazioni (Webex)

Video didattici su JoVE (link su file presente in Moodle)= importante ai fini dell’esame//domande

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Domande di ripasso

• Come è cambiato il concetto di gene?
• Illustrare in modo sintetico le caratteristiche del sistema CRISPR.
• Che procedura bioinformatica occorre per stimare un pangenoma?
• L’exon shuffling è…?
• A cosa serve e come viene eseguito un GWAS?
• Quanto è grande un genoma batterico?
• Cosa è il progetto ENCODE e cosa ha prodotto?
• Due geni ortologhi sono…?
• Come può avvenire la de novo gene birth Come si identifica una famiglia genica?
• Procedure e problematiche dell’annotazione dei geni.
• Cosa sono COG e Gene Ontology?
• Che informazioni può fornire KEGG?
• Come si stima la filogenesi di un gene?
• Come si assemblano le reads?
• Come avviene il sequenziamento illumina?
• Che differenze ci sono tra sequenziamento Sanger e sistemi NGS?
• Quali metodi di sequenziamento permettono di evidenziare le basi metilate?
• Si può stimare la dimensione di un genoma dal numero dei geni presenti in un batterio?
• Cosa è una isola genomica e come si identifica.
• Cosa sono i polimorfismi robertsoniani.
• Quali sono le peculiarità nell’evoluzione del genoma delle piante.

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• Cosa sono i marcatori molecolari?
• Come funziona il RAD-Seq?
• Cosa indica la legge di H-W?
• Come si calcola se una popolazione è in equilibrio?
• Cosa è la selezione naturale?
• Cosa è la deriva genetica?
• Cosa è l’Fst?
• A cosa serve il test di McDonald-Kreitman?
• Come si studiano i caratteri quantitativi?
• A cosa serve conoscere la varianza e fare test di regressione e correlazione?
• Come si misura l’ereditabilità?
• Cosa è un QTL e come può essere determinato?
• Come si stima la bontà di un cut-off di classificazione binaria?
• Che funzione svolgono i geni materni?
• Quale è il ruolo dei geni omeotici?
• Come si produce una pianta OGM?
• Cosa è l’elettroporazione?

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Lezione #1

Definizioni

La genetica si occupa di studiare l’effetto dei geni, utilizzando organismi modello, che sono organismi che si prestano di più allo studio e che consentono di approcciare un problema in maniera sperimentale, quando magari il problema per noi è rilevante non in quel modello lì ma in un altro sistema, più difficile da studiare o per il quale noi non possiamo agire nella stessa maniera.

Un esempio è la ricerca dei geni candidati malattia: io li posso cercare in un umano, posso associare probabilisticamente un gene alla malattia, ma la conferma sperimentale io la ottengo con animali modello in cui induco quella mutazione o tratto con un determinato agente, guardando la risposta (si usano modelli animali di malattia, che sono una versione semplificata di un modello complesso non trattabile – l’uomo –; si utilizzano organismi modello e non solo colture cellulari perché queste non ci consentono di effettuare osservazioni fenotipiche).

Pertanto, un modello è un organismo, una versione semplificata di un sistema più complesso. C’è tuttavia un’altra accezione del termine →modello: un modello è anche uno schema teorico (theoretical framework ciò che è testabile) che deriva dai dati sperimentali (ad esempio, il modello dell’espressione genica, è un modello che dice che un fattore trascrizionale è una proteina che si lega a una zona denominata promotore, legame che permette alla RNA polimerasi di riconoscere meglio la zona promotore ed avere un’affinità maggiore per il DNA, facendo partire →la trascrizione questo è il nostro modello.

Un altro esempio è il modello di trasduzione del segnale, come i segnali calcio-mediati o le cascate fosforilative. Oppure, il modello dell’atomo, com’è fatto un atomo: è un modello che è cambiato a seconda dei dati sperimentali ottenuti nel tempo).

Quindi, consideriamo due accezioni del termine modello: 1) Il modello sperimentale, che è l’organismo o il sistema sperimentale che usiamo; 2) Modello concettuale, ovvero l’interpretazione, derivante dall’accoppiamento di dati e fantasia.

Se un modello non è basato su dati sperimentali e non riesce a prevedere nessun dato sperimentale, non ha valenza: non è una teoria scientifica, ma è un’opinione. L’omeopatia, ad esempio, non è una teoria scientifica, ma un’opinione.

Approcci allo studio genetico

La genetica si rapporta allo studio degli organismi attraverso due modi antitetici classici: modalità riduzionista o modalità “Olista” (anche chiamata systems-oriented). Il riduzionismo è un approccio secondo cui si può studiare un sistema suddividendo il problema complesso in tanti problemi semplici affrontabili singolarmente, dalla soluzione dei quali scaturirà poi la comprensione del tutt’uno: l’intero è la somma delle singole parti.

Una seconda accezione di riduzionismo è quella del systems-oriented: un problema biologico può essere affrontato con metodi che sono di scienze di base della biologia, la chimica e la fisica. Un problema biologico può essere riassunto con esempi e problematiche trattabili in termini chimici e fisici.

La biologia dei sistemi (systems-oriented) utilizza in realtà questi metodi, ma si cerca di vedere ad un’integrazione dei risultati dei vari esperimenti: più che suddividere il problema in tanti problemi semplici, si cerca di trovare un modello di funzionamento che permetta di descrivere la totalità, e che non è quindi banalmente dato dalla somma delle singole parti, ma deriva dalle singole parti tra loro integrate (ad esempio, le previsioni del tempo, che si basa sulla misura della pressione, temperatura atmosferica e umidità, più dati abbiamo, e più precise sono le previsioni.

Temperatura, pressione e umidità atmosferica sono variabili collegate, ed è dalla integrazione di queste variabili è possibile che piova: c’è una probabilità ma non una certezza, e quando c’è un’integrazione piccole differenze possono portare a una grande differenza finale).

Dogma centrale della biologia molecolare

Il dogma centrale della biologia molecolare è un principio formulato negli anni ‘50 del XX secolo da Crick, secondo cui, in biologia molecolare, il flusso dell'informazione genetica è monodirezionale: parte dagli acidi nucleici per arrivare alle proteine, senza considerare un percorso inverso.

In realtà non è un dogma, perché “dogma” significa una verità inviolabile, e nella scienza la parola dogma non torna.. è un modello, non un dogma. Non è un dogma perché appunto ci sono delle eccezioni: la trascrittasi inversa viola il dogma.

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Lezione #2

Storia della genetica – concetto di gene

La storia della genetica ha inizio con Mendel, che lavorò intorno al 1860. Tuttavia, la pubblicazione dei suoi lavori non ebbe una così grande diffusione ma, di fatto, rimasero degli esperimenti sconosciuti a chi si occupava di scienze naturali.

È soltanto nel 1900 che, indipendentemente da Mendel, altri ricercatori, cercando di capire come funzionava l’ereditarietà dei caratteri, fecero esperimenti molto simili a quelli di Mendel, ottenendo gli stessi risultati, evidenziando quindi la correttezza dei risultati degli esperimenti effettuati quasi 40 anni prima. Quindi, l’anno 1900 lo possiamo mettere all’inizio della linea temporale che descrive la storia della genetica.

Il termine gene non è stato inventato da Mendel e nemmeno da Hugo Devris e Correns, che furono i riscopritori delle leggi di Mendel, ma fu inventato poco dopo da Johannsen, un botanico, che utilizzò questo termine riprendendo spunto da un termine che aveva utilizzato Darwin, per il quale la trasmissione dei caratteri era legata a dei cosiddetti pan-geni che venivano trasmessi tra i genitori all’atto della riproduzione, ma questi pan-geni in realtà tendevano a cambiare nel tempo (e questo non torna con quello che poi è il darwinismo stesso, cioè il fatto che non vengono trasmessi i caratteri acquisiti, che invece è la “Marca”).

Quindi, Darwin sull’ereditarietà dei caratteri non ci aveva capito granché, soprattutto perché non aveva fatto gli esperimenti, come aveva invece fatto Mendel. Johannsen decise di chiamare questo qualcosa che si trasmetteva dai genitori ai figli e nel quale risiedeva l’informazione codificante un determinato fenotipo, gene.

1900s – Johannsen

Il modello di gene indicato nella figura A indica che c’è una cellula con dentro un pezzettino rosso, immaginabile in termini più pratici: se pensiamo alle leggi di Mendel, che sono leggi statistiche in cui alla riproduzione (Meiosi) gli alleli vengono ripartiti casualmente nei gameti, qui possiamo immaginare un sacchetto contenente delle biglie di colori diversi, che campioniamo in maniera casuale: il gene è quella biglia che noi abbiamo raccolto dal sacchetto, ovvero che la formazione dei gameti (riproduzione) ha preso.

Quindi, il gene è un’entità, un qualcosa, che viene preso a caso durante la formazione dei gameti, ed è ciò che determina il fenotipo. I geni sono i determinanti del fenotipo, ed hanno delle forme diverse che determinano fenotipi diversi. Questo modello rimane per un bel po’, perché non si conoscono i dettagli molecolari che ci dicono che cosa è un gene.

1950-1960s

Alla fine degli anni ’40 si scopre che l’informazione genetica è contenuta nel DNA, e con una serie di esperimenti si arriva a capire che i geni stanno sui cromosomi. Tuttavia, soltanto con l’avvento della biologia molecolare (utilizzo delle tecniche di analisi chimica e biochimica per capire come funziona l’ereditarietà dei caratteri, e quindi la genetica) si capisce che i geni vengono trascritti (ovvero questo DNA viene copiato in una molecola di RNA), e quindi i geni sono delle regioni del genoma, trascritte, e che →determinano una proteina (perché sempre in quegli anni si è scoperto che i geni codificano per proteine c’è la cosiddetta teoria “Un gene, un enzima” e poi quella “un gene, un polipeptide”).

Quindi, un gene è una proteina, e questo è l’assunto che viene fuori da quegli esperimenti.

1970s-2000s

Le cose si complicano, perché viene fuori che prima di arrivare alla proteina c’è un RNA che chiamiamo RNA messaggero (mRNA), ma che non sempre è lo stesso, cioè la stessa regione del genoma può produrre più tipologie di mRNA attraverso lo splicing alternativo, ma anche attraverso il trans-splicing (quando trascritti diversi si uniscono assieme, ed è una caratteristica di alcuni organelli, ad esempio avviene in alcuni cloroplasti), ma anche attraverso l’RNA-editing (ovvero il cambiamento specifico di una base azotata nell’RNA, che porta quindi ad una proteina diversa: esempio di questo lo osserviamo nei tripanosomi, ma anche in geni del genoma umano che vengono editati in maniera diversa a seconda dei tessuti).

Quindi, l’idea è che non sempre ad una posizione del genoma corrisponde un unico trascritto e una sola proteina.

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2001 – present

Viene fuori un’altra cosa, ovvero che il genoma codifica anche per i tRNA, rRNA, miRNA etc. È tuttavia venuto fuori, negli ultimi 20 anni, che la frazione che noi chiamiamo “geni” ma che non porta a delle proteine, non è un qualcosa corrispondente agli altri RNA, ma è la frazione forse più consistente dei geni, nel senso che una gran parte delle regioni che noi possiamo chiamare “gene” corrispondono ad una parte del genoma che viene trascritta ma che non viene tradotta.

E non sono soltanto i piccoli RNA, ma sono una categoria chiamata, chiamata anche non-coding RNA (ncRNA), che hanno il ruolo, ancora non chiarissimo, di regolare l’espressione dei geni che poi, come ultima tappa della loro espressione, portano alle proteine (ricorda che il fenotipo che abbiamo è dato dalle proteine, noi siamo fatti di proteine).

Quindi, la modalità con cui si arriva alle proteine determinanti il nostro fenotipo, cambia a seconda dei tessuti (negli organismi pluricellulari) e a seconda delle fasi di sviluppo), ed è fortemente legata all’accensione e spegnimento dei geni piuttosto che al processamento dell’mRNA (che, ovviamente, conta), e questo sembrerebbe essere legato non solo ai fattori trascrizionali, ma tanto anche alla frazione non-coding, ovvero che non codifica per proteine.

Quindi, nel 1900s il gene era una pallina di cui non si conosceva l’entità, ma oggi possiamo dire che il gene è un pezzo di DNA che viene trascritto e in qualche caso tradotto. Quindi ne abbiamo una connotazione fisica-biochimica, e possiamo identificarlo in alcuni casi sul genoma, ma non sempre, perché ancora non conosciamo tutte le regole di questo gioco e di quand’è che la polimerasi decide di trascrivere (ad esempio, non sappiamo così bene riconoscere i promotori: sappiamo riconoscere dove ci sarà potenzialmente una proteina, perché riconosciamo una regione del genoma che quando viene trascritta e tradotta dà luogo ad →un polipeptide di una lunghezza abbastanza lunga da non essere lì per caso se compare dopo un certo numero di nucleotidi allora prendiamo in buona fede che lì dentro ci possa essere un gene che viene tradotto in un polipeptide, e magari questo potenziale gene è simile a quello trovato in altri organismi e ci fidiamo un po’ di più).

L’unica regola che noi conosciamo, ad ora, è che l’ATG (AUG per metionina) è lo start-codon e i codoni di stop, ma tutta la frazione non-coding, a livello bioinformatico (sulla sequenza) non riusciamo a ricavarla se non per omologia di sequenza con sequenze che conosciamo (una delle sfide del futuro è infatti cercare di capire, senza dover fare esperimenti, quanta più informazione funzionale possibile).

Quindi, il gene non è solo un’entità fisica, ma è un concetto, che è cambiato nel tempo perché ci sono stati esperimenti che hanno permesso di creare nuovi modelli, ampliando modelli pre-esistenti o confutando modelli pre-esistenti.

Mendel

Mendel usa la pianta di pisello come organismo modello. Mendel è tra i primi, nelle scienze della vita, a scegliere un modello sperimentale con delle caratteristiche che sono le stesse per cui scegliamo modelli sperimentali oggi: il modello sperimentale deve essere un organismo facilmente studiabile (lo studiamo in uno spazio ristretto, con dei costi r