Appunti biologia molecolare

Biologia molecolare

1 mercoledì 22 settembre 2021 17:28

Biologia molecolare = studio delle molecole biologiche (struttura, proprietà, funzioni) quindi DNA, RNA, proteine, lipidi, carboidrati.

Quando è nata la biologia molecolare? 1953 con la scoperta del DNA (Watson e Crick), il depositario dell'informazione genetica.

La biologia molecolare è nata dalla fusione di esperimenti di genetica, biochimica. I genetisti utilizzavano di più un approccio olistico (guardavano i caratteri ereditari nel loro insieme), i biochimici avevano un approccio riduzionistico (partendo da un tessuto si scende a livello di cellule, molecole ecc).

Ci troviamo adesso nell'era "omica": la genomica è la disciplina che studia tutti i geni, la trascrittomica studia tutti gli RNA, la proteomica studia tutte le proteine.

ATG = tripletta di nucleotidi che decifra la traduzione: quando c'è è probabile che dopo inizi una proteina.

TAG = codone di stop.

Genoma: l'intero contenuto di DNA di una cellula (comprende geni e regioni intergeniche).

Exoma: parte di genoma che contiene le informazioni per codificare tutte le proteine.

Cos'è un gene? Sequenza di nucleotidi (DNA) che codifica per un RNA e/o un polipeptide/proteina.

Dogma centrale della biologia: DNA -> trascrizione -> RNA -> traduzione -> proteina

Esperimenti cruciali precedenti al modello di Watson e Crick

Esperimento di trasformazione batterica: Griffith, 1929

1) Esperimento di "trasformazione" batterica: Griffith, 1929

Classificò 2 ceppi: ceppo R (superficie rugosa, senza capsula protettiva, viene riconosciuto dal sistema immunitario e degradato) benigno e ceppo S (superficie liscia, con capsula polisaccaridica che previene il riconoscimento da parte del sistema immunitario) virulento.

Iniettando nei topi il ceppo S il topo moriva, se però si scaldava il batterio e poi si iniettava il topo non moriva; se inietto il ceppo R il topo rimane in vita. Se invece si miscelano i 2 ceppi e si scaldano e poi si iniettano nei topi, questi muoiono. Qualcosa trasforma i batteri innocui in batteri patogeni, cos'è? Adesso sappiamo che il principio trasformante è il DNA.

"Trasformazione" batterica è quando si inseriscono dei frammenti di DNA in batteri, quindi vengono inserite informazioni di DNA e quindi il batterio si trasforma. La parte virulenta passa dal batterio S al batterio R.

Anche nelle cellule eucariotiche è possibile trasferire DNA esogeno, in questo caso si parla di "trasfezione" (in vitro - in colture cellulari - ex vivo - su cellule isolate da un organismo e trasferite su terreno di coltura - in vivo - direttamente su cellule di un organismo).

Lezione 1 Pagina 12 martedì 21 settembre 2021 17:31

L'esperimento bomba di Avery, 1944

2) L'esperimento bomba di Avery, 1944

Partendo dagli stessi batteri S, Avery decise di isolare DNA, proteine, RNA, lipidi e polisaccaridi per vedere qual era il principio trasformante. Quindi si ha un frazionamento dell'estratto nei suoi componenti macromolecolari. I batteri, controllati successivamente aggiungendo batteri del ceppo R, erano di tipo R tranne quelli in cui era stato isolato il DNA, dove erano S, capaci di costruirsi una corazza intorno. Egli sostenne che era il DNA il principio trasformante, non fu però accettato.

Esperimento di Griffith

Esperimento di Avery Lezione 1 Pagina 2

Amminoacido e principio trasformante

Com'è fatto un amminoacido? 1 un carbonio alfa centrale, gruppo amminico, gruppo mercoledì 22 settembre 2021 20:02 carbossilico, un idrogeno, una catena laterale R (gruppo funzionale che rende gli aa diversi).

Griffith capì con il suo esperimento che c'era qualcosa che permetteva di difendere il batterio patogeno (che non veniva distrutto dopo l'infezione), mentre l'altro ceppo con la superficie ruvida non resisteva al sistema immunitario del topo e moriva. La creazione della corazza si poteva trasmettere, c'era quindi un carattere trasmettibile e visibile fenotipicamente. Cos'era questo principio trasformante? Avery riuscì a capirlo (DNA) ma nessuno gli credette.

Nel 1929 già si credeva che i cromosomi fossero fatti da DNA e proteine, ma gli scienziati pensavano che l'informazione genetica fosse depositata nelle proteine, perché il DNA è fatto semplicemente da 4 nucleotidi con da 4 basi azotate diverse che si alternano in maniera non casuale; le proteine invece sono formate da a 20 amminoacidi diversi, quindi si pensava che esse fossero i geni (lì si depositava l'informazione genetica).

Un nucleotide è formato da un gruppo fosfato, uno zucchero, una base azotata; quando i biochimici tentavano a purificare (staccare il DNA dalle proteine dei cromosomi) venivano dei piccoli frammenti, non intatto come facciamo oggi, quindi immaginavano che il DNA all'interno dei cromosomi fosse così frammentato -> poche combinazioni, quindi impossibile spiegare così la complessità degli esseri viventi.

Un aiuto importante venne da un gruppo di fisici: "il gruppo del fago" poiché decisero di studiare non i cromosomi, ma virus batterici (batteriofagi/fagi).

Fagi: attaccandosi ai batteri, i fagi iniettano il DNA all'interno usando i batteri come "sacco" per proliferarsi e riprodursi.

Il tutto può essere studiato in laboratorio mettendo i batteri su una piastra di Petri (con Agar = zucchero che si può solidificare formando un gel su cui i batteri possono crescere e moltiplicarsi), se ai batteri aggiungiamo un fago, si vede un buco, placche fagiche.

Studiando questi sistemi è stato possibile vedere anche come si replica il nostro DNA.

Esperimento del frullatore

Il gruppo del fago divenne famoso anche per l'esperimento del frullatore (un qualcosa capace di agitare quello che c'è dentro) - Hershey e Chase 1952 - sfruttarono il sistema modello fagi poiché sono semplicemente fatti di DNA e proteine. Se si usano dei sistemi per differenziare queste molecole possiamo dire alla fine le funzioni diverse di DNA e proteine. Il gruppo fosfato è tipico del DNA perché nelle proteine fagiche gli aa difficilmente vengono fosforilati, quindi è possibile differenziare il DNA dalle proteine perché solo i nucleotidi hanno il fosforo.

Tutte le proteine hanno almeno un atomo di zolfo (iniziando con un aa metionina).

Lezione 2 Pagina 32 mercoledì 22 settembre 2021 21:50

Gli isotopi cosa sono?

S35 e P32 sono isotopi degli atomi fosforo e zolfo.

Gli isotopi cosa sono? Sono forme diverse dello stesso elemento, hanno le stesse proprietà chimiche (stesso numero atomico Z = numero di protoni), si differenziano per le proprietà fisiche, perché i loro atomi hanno masse diverse (diverso numero di massa A = protoni + neutroni). Ogni isotopo ha un diverso numero di neutroni nel nucleo dei suoi atomi, per questo ha una massa atomica diversa.

Gli isotopi pesanti sono più stabili, gli isotopi radioattivi sono instabili e tendono ad emettere radiazioni. Nel caso del fosforo, emette radiazioni beta e ci sono dei contatori che fanno un'analisi quantitativa, cioè capiscono quanto DNA è presente a seconda della quantità di fosforo che emette le particelle beta; nel caso delle proteine lo zolfo.

Gli isotopi + comuni del fosforo sono il P30 che è stabile con 15 neutroni e 15 protoni e il P32 che è radioattivo.

Gli isotopi + comuni dello zolfo sono S32 stabile con 16 neutroni e 26 protoni e S35 radioattivo.

Loro fecero crescere i batteri in un terreno che conteneva substrati radioattivi, fermarono il processo non appena i fagi si attaccarono alla parete ed iniziarono ad iniettare il principio trasformante che portava poi alla morte i batteri stessi. Il frullatore fu importante per staccare quello che rimane di fuori dalla parete e vedere cosa rimaneva fuori e cosa dentro; dopo misurarono se dentro i batteri c'era il fosforo o lo zolfo radioattivo e lo fecero centrifugando: applicando una forza centrifuga molto forte le cose più pesanti si spostano verso il basso. La maggior parte di S35 nel sopranatante, P32 nel pellet (precipitato).

Quindi i capsidi contengono la maggior parte dello zolfo (proteine), i batteri infettati il fosforo (DNA) -> è il DNA dei fagi che viene iniettato nei batteri.

Facendo infettare nuovi batteri in un terreno senza isotopi, solo una parte di DNA rimane radioattivo e le molecole sintetizzate erano in parte ibride.

Conclusioni: nei fagi l'agente capace di portare l'informazione vitale è contenuta nel DNA, le proteine costituiscono un rivestimento esterno.

Questo esperimento venne accettato di più di quello di Avery.

Partendo dai risultati di questo esperimento, Watson e Crick nel 1953 costruirono il loro modello, servendosi anche di 3 scoperte:

Regole di Chargaff 1950

Regole di Chargaff 1950

Estraendo il DNA da un tessuto, la concentrazione di basi azotate sono uguali tra loro a due a due A=T, G=C.

Strutture secondarie - Pauling 1951

Strutture secondarie - Pauling 1951

Propose i modelli alfa elica e foglietto beta come modelli geometrici della struttura secondaria della proteina.

Pauling si chiese: quali sono le proprietà del materiale ereditario?

• La capacità di esprimere il fenotipo
• La capacità di duplicarsi (trasmettere l'informazione alla progenie)

Diffrazione a raggi X - Wilkins e Franklin

Diffrazione a raggi X - Wilkins e Franklin

Se usiamo i raggi X possiamo vedere dentro una proteina, la sua struttura atomica tridimensionale e quindi possiamo capire la sua funzione, conoscendone la sua struttura.

Lezione 2 Pagina 43 mercoledì 22 settembre 2021 22:50

La stessa cosa fu fatta con il DNA, proposero come modello 2 filamenti formati dal susseguirsi nei nucleotidi uno dopo l'altro a formare una struttura ad elica molto stabile.

Doppia elica con una coppia di basi azotate piatte parallele a formare come dei gradini di una scala a chiocciola.

Purine sono sempre opposte alle pirimidine.

Caratteristiche chimico fisiche del DNA

Caratteristiche chimico fisiche del DNA

Un nucleotide è formato da un gruppo fosfato (fosfato pentavalente), uno zucchero (pentoso nel DNA), una base azotata. Questi zuccheri possono legarsi da una parte alla base azotata, dall'altra al gruppo fosfato, considerando la valenza di ciascun singolo atomo.

C è tetravalente = ha la possibilità di creare 4 legami.

Valenza: il numero di elettroni che un atomo deve acquisire o perdere quando forma legami con altri atomi.

Le basi azotate possono essere di 2 tipi: pirimidine (unico anello) come citosina, timina, uracile; purine (doppio anello) come guanina e adenina.

Le basi azotate sono legate allo zucchero e legati insieme formano un nucleoside attraverso un legame N-glicosidico 1'-1 nelle pirimidine, 1'-9 nelle purine, dove ' indica la posizione sullo zucchero.

I nucleosidi hanno dei nomi: adenosina, guanosina, citidina, timidina, uridina a seconda della base azotata utilizzata.

Se aggiungiamo un gruppo fosfato prende il nome di nucleotide, spesso in posizione 5' o 3', che conferisce una componente acida alla molecola e avremo quindi acido adenilico, acido guanilico, acido citidilico, acido timidilico, acido uridilico.

Quando i nucleotidi sono legati a formare la catena di DNA, questa catena ha una sua polarità: comincia con l'estremità 5' fosfato e termina con l'estremità 3' O-H quindi la direzione sarà 5' -> 3'. I nucleotidi si legano tra loro tramite legami fosfodiesterici, il fosfato ha legati un legame stereo verso il 3' e un legame stereo verso il 5' dove si legherà lo zucchero.

ATP è un ribonucleotide trifosfato (-OH sia al 3' che al 2').

Lezione 2 Pagina 51 martedì 28 settembre 2021 08:21

Strutture del DNA e della cromatina

Esperimenti cruciali che hanno portato al modello di Watson e Crick: Griffith - Avery - Hershey e Chase - Chargaff - Pauling - Franklin.

Concetto importante: importanza della conformazione finale in relazione alla struttura -> come per le proteine distinguiamo le varie strutture primaria, secondaria ecc, per il DNA e per la cromatina ugualmente abbiamo una struttura primaria (semplice sequenza di nucleotidi, in casi rari), secondaria (doppia elica), terziaria (DNA associato intorno ad istoni -> nucleosomi) ed altri livelli di avvolgimenti fino ad arrivare ai cromosomi.

Struttura primaria: sequenza di nucleotidi tenuti insieme da un legame covalente, il legame fosfodiesterico, in cui un atomo di fosforo è collegato ai due zuccheri tramite due legami esterei.

Struttura secondaria: doppia elica stabilizzata dai legami a idrogeno tra le basi azotate, da interazioni idrofobiche aspecifiche e interazioni di Van der Vaals.

Questo ragionamento vale anche per RNA che però ha solo 1 filamento, a volte mRNA lunghi si accoppiano a piccoli RNA, che fa da inibitore non facendolo più tradurre una determinata proteina.

Il DNA forma una doppia elica perché è più stabile, le basi essendo idrofobiche tendono ad escludere l'acqua e nella doppia elica rimangono le basi. La doppia elica può essere destrogira o levogira, la forma B è quella fisiologica che studiarono anche Watson e Crick: fibrille di DNA ancora un po' idratate (con qualche molecola di acqua). La struttura B ha un diametro di 20A°, quella A ha un diametro di 23A° (può essere DNA/RNA, RNA/RNA, DNA e proteine), la B ha 10,4 coppie di basi per giro, la A ha 11 coppie di basi per giro; nella struttura Z ce ne sono 12 di coppie di basi, ma ha una struttura molto più disordinata. In posizione 2' c'è un -OH che sporge, per cui rende l'RNA molto più reattivo e incapace di prendere la struttura di tipo B.

La presenza negli RNA del 2' -OH del ribosio ha importanti conseguenze strutturali e funzionali:

• Minore stabilità rispetto al DNA
• Forma A della doppia elica
• Struttura terziaria

Lezione 3 Pagina 62 martedì 28 settembre 2021 09:00

Caratteristiche diverse delle varie strutture

Caratteristiche diverse delle varie strutture: A B Z

Nella forma B le basi sono all'interno ed escludono l'acqua grazie ai legami a idrogeno tra le basi azotate. Si creano il solco maggiore e il solco minore, di differente grandezza, le proteine riescono ad entrare con precisione nel solco + grande ma alcune entrano anche in quello piccolo; si chiama DNA perché ha caratteristiche acide, date dai fosfati. Le basi appaiate impilate favoriscono i legami tra un gradino e quello superiore.

Z DNA si ritrova in piccole regioni del nostro genoma, ha brevi sequenze di pirimidine e purine (es: CGCGCGCG), è più stretto, forma zone che potrebbero essere dei segnali, ma ancora non è certo a cosa serva.

Tripla elica di DNA: si può inserire un altro filamento di DNA o RNA per formare triple eliche (es. un filamento solo pirimidine, uno solo purine, uno solo pirimidine -> si formano legami che non sono canonici. Si forma quando il DNA si sta replicando e può essere pericoloso perché può bloccare la trascrizione.

Atassia di Friedreich: malattia degenerativa associata a espansione della tripletta GAA nel cromosoma 9; nei pazienti sani circa 8-30 copie della tripletta, nei pazienti malati circa 100-1000 copie. Ipotesi: DNA a struttura tripla elica nel gene che codifica per la fratassina; la regione a triplette si trova all'interno dell'introne n. 1 del gene; la trascrizione è inibita e la concentrazione intracellulare di fratassina viene ridotta.

Lezione 3 Pagina 73 martedì 28 settembre 2021 09:34

Solchi del DNA e interazione con proteine

Cosa sono i solchi e perché si formano? In un'elica regolare i solchi sono tutti uguali, nell'elica di tipo B si formano i 2 tipi di solco, l'attacco allo scheletro zucchero-fosfato è asimmetrico. La parte che rimane esposta al solvente potrà interagire in maniera più libera nel solco maggiore, c'è più spazio. Nell'elica B ho un asse centrale, solchi di uguale profondità ma di larghezza diversa; nell'elica A ho un asse decentrato, un solco maggiore più profondo e un solco minore piccolo e superficiale -> una proteina potrà interagire solo con il solco maggiore.

Le basi occupano tutto lo spazio interno nella forma B (guardando dall'alto), i solchi non sono uguali perché l'attacco dello zucchero alla base è asimmetrico, non è in linea con il piano delle basi (si creerebbero sennò dei solchi tutti uguali).

Elica B Elica A

Le proteine interagiscono con il DNA nella parte del solco maggiore generalmente, come fanno le proteine a capire qual è il punto dove si devono attaccare? Devono leggere la sequenza, come fanno?

Esistono però eccezioni: la TBP (TATA binding protein) lega il DNA dalla parte del solco minore e lo piega.

Enzimi di restrizione e clonaggi molecolari

Gli enzimi di restrizione (forbici molecolari) sono esempi di proteine che legano il DNA specificatamente, leggono la sequenza di riconoscimento e tagliano il DNA -> utili per manipolazioni genetiche. Quando si fanno clonaggi molecolari (per costruzione di DNA ricombinante) dobbiamo tagliare la molecola vettore e con l'enzima ligasi si inserisce il vettore nel plasmide ottenendo il plasmide ricombinante; si fa una trasformazione e il DNA che entrerà nei batteri potrà essere studiato.

Questi enzimi di restrizione furono scoperti nel 1978, come funzionano?

Es. EcoR1 (purificato da un ceppo particolare di Escherichia coli: RY13) riconosce e taglia la sequenza GAATTC lasciando le estremità sporgenti.

Gli enzimi che tagliano il DNA sono le nucleasi, idrolizzano i legami fosfodiesterici tra i nucleotidi; endonucleasi: tagliano all'interno, aspecifiche o specifiche (come gli enzimi di restrizione); esonucleasi: tagliano all'estremità, tolgono i nucleotidi uno a uno.

Alcuni enzimi di restrizione riconoscono 4, 6, 8, basi. Nomenclatura enzimi di restrizione: Escherichia (genere) coli (specie) strain RY13 (ceppo) 1 (primo enzima isolato).

I tipi di taglio degli enzimi di restrizione sono: estremità piatte, estremità sporgenti -> taglia sequenze palindromiche (stessa sequenza di nucleotidi se letti da sinistra o da destra, sui due filamenti). Le estremità sporgenti tendono ad attaccarsi l'una all'altra.

Lezione 3 Pagina 84 martedì 28 settembre 20