Appunti biologia molecolare

Corso di biologia molecolare

Tenuto dal professor Giovanni Raugei e dalla professoressa Maria Letizia Taddei

Corso di Laurea di Biotecnologie Mediche e Farmaceutiche
Anno Accademico 2020/2021

“Il presente elaborato non è un documento ufficiale fornito dal docente, ma appunti estrapolati dalla lezione che non intendono sostituire l’essenzialità della lezione stessa”

Lezione 1

Acidi nucleici

Struttura del DNA

• Dal punto di vista chimico, il DNA è un polimero organico a doppia catena i cui monomeri sono chiamati nucleotidi (desossiribonucleotidi o deossiribonucleotidi). I nucleotidi sono costituiti da tre componenti fondamentali: un gruppo fosfato, uno zucchero pentoso (il desossiribosio, detto anche deossiribosio) e una base azotata che si lega al desossiribosio con un legame N-glicosidico. Le basi azotate che entrano nella formazione dei nucleotidi sono quattro: adenina, timina, citosina e guanina (nell'RNA al posto della timina è presente l'uracile).
• Il DNA può essere globalmente definito come una doppia catena polinucleotidica (A, T, C, G), antiparallela, orientata, complementare, spiralizzata, informazionale. L'ordine nella disposizione sequenziale dei nucleotidi costituisce l'informazione genetica, la quale è tradotta tramite il codice genetico negli amminoacidi corrispondenti. La sequenza amminoacidica prodotta, detta polipeptide, forma le proteine.
• Il processo di traduzione genetica (comunemente chiamata sintesi proteica) è possibile solo in presenza di una molecola intermedia di RNA, che è generata per complementarità con le quattro basi dei nucleotidi del DNA in un processo noto come trascrizione. Tale processo non genera solo filamenti di RNA destinati alla traduzione, ma anche frammenti già in grado di svolgere svariate funzioni biologiche (ad esempio all'interno dei ribosomi, dove l'RNA ha una funzione strutturale).
• L'informazione genetica è duplicata prima della divisione cellulare attraverso la replicazione del DNA, con cui è trasmessa integralmente nel passaggio tra diverse generazioni cellulari.

Il DNA è un lungo polimero costituito da unità ripetute di nucleotidi. La catena del DNA è larga tra i 22 ed i 26 Ångström (da 2,2 a 2,6 nanometri) ed ogni unità nucleotidica è lunga 3,3 Ångstrom (0,33 nanometri). Sebbene ogni unità occupi uno spazio decisamente ridotto, la lunghezza dei polimeri di DNA può essere sorprendentemente elevata, dal momento che ogni filamento può contenere diversi milioni di nucleotidi.

Negli organismi viventi, il DNA non è quasi mai presente sotto forma di singolo filamento, ma come una coppia di filamenti saldamente associati tra loro. Essi si intrecciano tra loro a formare una struttura definita doppia elica. Ogni nucleotide è costituito da uno scheletro laterale, che ne permette il legame covalente con i nucleotidi adiacenti, e da una base azotata, che instaura legami idrogeno con la corrispondente base azotata presente sul filamento opposto. Il composto formato da una base azotata legata allo zucchero è definito nucleoside; un nucleotide è invece un nucleoside a cui sono legati uno o più gruppi fosfato.

La struttura laterale del DNA è composta da unità ripetute ed alternate di gruppi fosfato e di 2-deossiribosio, uno zucchero pentoso (a cinque atomi di carbonio) che si lega ai fosfati adiacenti attraverso legami fosfodiesterici presso il terzo ed il quinto carbonio; in pratica, ogni molecola di fosfato forma un ponte molecolare collegando, attraverso legami fosfodiesterici, il carbonio in posizione 3’ di una molecola di deossiribosio con quello in posizione 5’ dello zucchero successivo. Conseguenza di questi legami asimmetrici è che ogni filamento di DNA ha un senso, determinato dalla direzione dei legami fosfodiesterici. Le basi azotate, invece, si uniscono in posizione 1' dello zucchero desossiribosio con legami N-glicosidici. In una doppia elica, il senso di un filamento è opposto a quello del filamento complementare. Per tale motivo, i due filamenti che costituiscono una doppia elica sono detti antiparalleli. Le estremità asimmetriche di un filamento di DNA sono definite estremità 5’ (cinque primo) ed estremità 3’ (tre primo).

La principale differenza tra il DNA e l'RNA è lo zucchero pentoso utilizzato: l'RNA, infatti, utilizza il ribosio. La doppia elica del DNA è stabilizzata dai legami idrogeno che si instaurano tra le basi azotate presenti sui due filamenti. Le quattro basi che sono presenti nel DNA sono l'adenina (abbreviata con la lettera A), la citosina (C), la guanina (G) e la timina (T). Tutte e quattro le basi hanno struttura eterociclica, ma adenina e guanina sono, dal punto di vista strutturale, derivate della purina, e pertanto dette basi puriniche, mentre citosina e timina sono correlate alla pirimidina e dette basi pirimidiniche. Esiste una quinta base, di tipo pirimidinico, chiamata uracile (U), ma essa non è di norma presente nelle catene di DNA. L'uracile è altresì presente nei filamenti di RNA al posto della timina, dalla quale si differenzia per la mancanza di un gruppo metile. L'uracile è presente nel DNA solo come prodotto della degradazione della citosina. Solo nel batteriofago PBS1 tale base può essere utilizzata all'interno del DNA. Al contrario, è molto più frequente individuare la timina all'interno di molecole di RNA, a causa della metilazione enzimatica di diversi uracili. Questo evento avviene solitamente a carico di RNA con funzione strutturale o enzimatica (rRNA e tRNA).

La doppia elica è una spirale destrorsa. Con l'avvitarsi su sé stessi dei due filamenti, restano esposti dei solchi tra i diversi gruppi fosfato. Il solco maggiore è largo 22 Å, mentre il solco minore è largo 12 Å. La differente ampiezza dei due solchi si traduce concretamente in una differente accessibilità delle basi, a seconda che si trovino nel solco maggiore o minore. Proteine che legano il DNA, come i fattori di trascrizione, dunque, solitamente prendono contatto con le basi presenti nel solco maggiore.

Ogni tipo di base presente su un filamento forma un legame con la base posta sul filamento opposto. Tale evento è noto come appaiamento complementare. Le basi puriniche formano legami idrogeno con le basi pirimidiniche: A può legare solo T e G può legare solo C. L'associazione di due basi viene comunemente chiamata paio di basi ed è l'unità di misura maggiormente utilizzata per definire la lunghezza di una molecola di DNA. Dal momento che i legami idrogeno non sono covalenti, essi possono esser rotti e riuniti in modo relativamente semplice, poiché questi sono legami ad alta energia. I due filamenti possono essere allontanati tra loro, come avviene per una cerniera, sia dalle alte temperature che da un'azione meccanica (come avviene durante la replicazione del DNA). Conseguenza di questa complementarità è che tutte le informazioni contenute nella doppia elica possono essere duplicate a partire da entrambi i filamenti, evento fondamentale per una corretta replicazione del DNA.

I due tipi di paia di basi formano un numero differente di legami idrogeno: A e T ne formano due, G e C tre. Per tale motivo, la stabilità del legame GC è decisamente maggiore di quello AT. Di conseguenza, la stabilità complessiva di una molecola di DNA è direttamente correlata alla frequenza di GC presenti nella molecola stessa, nonché alla lunghezza dell'elica: una molecola di DNA è dunque tanto più stabile quanto più contiene GC ed è lunga. Un'altra conseguenza di tale evento è il fatto che le regioni di DNA che devono essere separate facilmente contengono un'elevata concentrazione di A e T, come avviene ad esempio per il Pribnow box dei promotori batterici, la cui sequenza è infatti TATAAT.

Il DNA esiste in diversi tipi di conformazioni, ma solo le conformazioni A-DNA, B-DNA e Z-DNA sono state osservate nei sistemi biologici naturali. La conformazione del DNA può dipendere dalla sequenza, dal superavvolgimento, dalla presenza di modificazioni chimiche delle basi o dalle condizioni del solvente, come la concentrazione di ioni metallici. Di tali conformazioni, la conformazione B è la più frequente nelle condizioni standard delle cellule. Le due conformazioni alternative sono differenti dal punto di vista della geometria e delle dimensioni.

La forma A è un'ampia spirale destrorsa. Tale conformazione è presente in condizioni non fisiologiche, quando il DNA viene disidratato. In condizioni fisiologiche, questa conformazione caratterizza gli eteroduplex di DNA e RNA e i complessi formati dalle associazioni DNA-proteina. La conformazione Z è tipica invece delle sequenze che presentano modificazioni chimiche come la metilazione, e dei tratti di DNA ricchi di basi C e G. Essa assume un andamento sinistrorso, opposto rispetto alla conformazione B. Deve il suo nome all'andamento a zig-zag che la caratterizza. Queste strutture inusuali possono essere riconosciute da specifiche Z-DNA-binding proteins, con conseguenze notevoli nella regolazione della trascrizione, anche se non ne sono stati trovati esempi in natura.

Struttura RNA

• L’RNA è a singolo filamento perché viene trascritto a partire dal DNA, e questo facilita il processo attraverso la formazione di un ibrido DNA-RNA. Rispetto al DNA, l’RNA è più reattivo, di conseguenza è più soggetto a danneggiamento. La reattività consiste nella presenza di un gruppo OH nell’uracile al posto dell’H della timina nel DNA.
• Essendo a singolo filamento, l’RNA in soluzione non è steso, ma forma strutture secondarie, appaiando le zone complementari del filamento. Un esempio ne è sicuramente il tRNA con la classica forma a trifoglio. Qui, infatti, si formano delle forcine tramite interazioni (legami a idrogeno) tra 10-15 paia di basi di nucleotidi complementari.
• Nell’RNA si può formare anche un'altra coppia di nucleotidi complementari: guanina-uracile possono infatti formare un legame a idrogeno. Ci sono anche RNA molto più complessi, come il 16s di tipo ribosomiale.

A proposito del DNA

• Il DNA è una molecola a doppio filamento, i cui componenti sono complementari. Non ha analogie con sé stesso come l’RNA, quindi in soluzione non si ripiega in strutture secondarie. Se prendiamo ad esempio una molecola di DNA in sezione orizzontale perpendicolarmente al suo asse, notiamo che i due zuccheri sono disposti a 120 gradi di distanza. Questo indica che i legami a idrogeno avvengono di lato all’asse della doppia elica. L’elica avrà quindi un andamento alternante e si formeranno dei solchi: uno più grande (maggiore), ed uno più piccolo (minore).
• Ai lati delle basi azotate, quindi esternamente, troviamo dei gruppi chimici attraverso i quali possiamo riconoscere quali basi formano quel dato legame a idrogeno. Distinguiamo infatti tra siti accettori e donatori e identifichiamo una data sequenza. Questo è molto importante poiché dà la possibilità a degli enzimi che devono lavorare sul DNA di riconoscere il punto di attacco dall’esterno, quindi a spirale chiusa.

Denaturazione del DNA

• Il DNA oltre gli 80 gradi di temperatura si denatura: si svolge la doppia elica e si rompono i legami a idrogeno che tengono uniti i due filamenti. Se la temperatura si abbassa sotto gli 80 gradi, il DNA può rinaturare: inizialmente questo processo avviene in modo molto lento, una volta che i due filamenti complementari si sono avvicinati, aumenta la velocità di rinaturazione.
• Il DNA ha inoltre la capacità di assorbire la luce in range ultravioletti di una lunghezza d’onda pari a 260 MHz. Questo ci permette di identificare la quantità di DNA contenuta in una soluzione, poiché se il DNA è più concentrato, assorbe una maggiore concentrazione di raggi ultravioletti. La concentrazione di raggi assorbiti aumenta anche all’aumentare di temperatura della soluzione, poiché la divisione dei filamenti permette alle basi di non mascherarsi, e quindi di assorbire meglio la luce. Tramite questo processo posso quindi seguire anche il processo di denaturazione e rinaturazione del DNA.
• C’è però una particolarità: la coppia C-G forma tre legami a idrogeno, uno in più rispetto alla coppia A-T. Un’abbondanza di coppie citosina/guanina nella soluzione imporrà un’energia maggiore per rompere i legami e quindi una temperatura di denaturazione maggiore.

Enzimi operanti su DNA

• Tra gli enzimi più importanti troviamo le nucleasi, idrolasi che digeriscono gli acidi nucleici e fosfodiesterasi. Si possono distinguere due tipi:
  • Endonucleasi: tagliano i legami fosfodiesterici all’interno della molecola di DNA. Le rotture avvengono su un unico filamento in modo casuale, quindi questi enzimi non hanno specificità. Le rotture prendono il nome di “nic”, ma solitamente non demoliscono l’integrità del doppio filamento, assicurata se tra le rotture (su filamenti diversi) si trovano almeno 10pb. In caso contrario, molto raramente, il doppio filamento si frammenterà e potrà essere riparato da una ligasi.
  • Esonucleasi: tagliano il primo legame fosfodiesterico, sia dall’estremità 5’, sia dalla 3’. Possono farlo in due modalità:
    • Tramite taglio P: il taglio avviene sul legame fosfodiesterico al 3’. Viene lasciato uno zucchero a monte con un gruppo OH legato al 3’ e un gruppo P al 5’.
    • Tramite taglio D: tagliano tra un gruppo OH al 3’ e un gruppo P al 5’.
• Le esonucleasi sono definite anche enzimi digestivi poiché degradano gli acidi nucleici che ingeriamo attraverso il cibo.
• Esistono anche delle nucleasi specifiche, le endonucleasi di restrizione. Esse tagliano solo se riconoscono delle specifiche sequenze sul DNA. Questi tagli possono essere previsti se siamo a conoscenza delle specifiche sequenze che gli enzimi riconoscono. Esse hanno una simmetria centrale, sono quindi complementari ma anche identiche se lette in direzione 5’-3’ sui due filamenti. Anche i nic che le endonucleasi operano sono simmetrici sui due filamenti e possono lasciare estremità di due tipi:
  • Piatte, se l’endonucleasi agisce perfettamente al centro della sequenza, lasciando lo stesso numero di legami a idrogeno nei quattro frammenti.
  • Appiccicose, se i nic avvengono non al centro della sequenza, lasciando frammenti a due a due uguali.
• Possiamo calcolare le frequenze teoriche di taglio delle endonucleasi di restrizione tramite la formula: xⁿ Dove:
  • x= Numero di basi nella sequenza di riconoscimento;
  • n= numero di nucleotidi presenti nel DNA.
• Esistono inoltre enzimi diversi in organismi diversi che possono riconoscere la stessa sequenza di riconoscimento. Essi sono detti isoschizomeri.
• Le nucleasi sono dei dimeri, composti da due monomeri uguali (omodimero) che hanno due domini:
  • Un dominio di riconoscimento, composto da una sequenza;
  • Un nucleasico che agisce da taglio. Disposti a 180 gradi.
• Enzimi come quelli che abbiamo appena analizzato, fanno parte dei sistemi di restrizione e modificazione della cellula. Restrizione significa taglio, i ricercatori che li osservarono, li chiamarono così poiché questi enzimi erano attivi nella difesa dai batteriofagi, quindi restringevano la possibilità di infezione. Solitamente ogni endonucleasi è accoppiata a una DNA metilasi. Quest’ultima è capace di modificare, mediante metilazioni, specifiche basi all’interno della sequenza riconosciuta dalle endonucleasi di restrizione. Serve quindi per proteggere DNA dal taglio. Una metilasi riconosce le stesse sequenze delle endonucleasi di restrizione e inizia a legarvi un gruppo metile. Durante la replicazione del DNA, si passa da uno stadio di emimetilazione, in cui DNA è metilato solo da un lato, ma comunque l’endonucleasi non riesce a riconoscere le sequenze da tagliare. Completata la replicazione, il DNA è completamente metilato e quindi, protetto dal taglio, può iniziare un nuovo ciclo di replicazione. Se nella cellula entra DNA esogeno (batteriofagi), esso può essere oggetto di taglio da parte di endonucleasi perché non è metilato. L’Endonucleasi è più veloce solitamente della metilasi, quindi non viene protetto in tempo, viene tagliato e successivamente degradato. Inoltre, i siti di riconoscimento per l’endonucleasi sono tanti, quindi è molto improbabile che la metilasi riesca a raggiungerli tutti in tempo.

Ma come avviene la metilazione? L’elemento più importante è S-adenosilmetionina (SAM), che è buon donatore di gruppi metilici. Il gruppo metile ha buona capacità di trasferimento. Le basi, però, si metilano in modo diverso. L’adenina può essere metilata in due posizioni, mentre guanina e citosina in una sola posizione. I sistemi di restrizione-modificazione sono divisi in tre classi. A noi interessano soprattutto quelli di seconda classe per due motivi:

• Hanno attività di restrizione e metilazione su molecole distinte;
• Sono caratterizzati da una elevata specificità di taglio a livello o vicino a sito di riconoscimento.

La prima e la terza classe utilizzano domini diversi di stessa molecola proteica per entrambe le funzioni e tagliano lontano dal sito di riconoscimento.