Appunti biologia animale

Introduzione alla trascrizione genetica

La parte del gene utilizzata per formare l’RNA messaggero viene indicata con la posizione +1, questo punto viene chiamato punto di inizio della trascrizione (TSS). Soltanto una parte del gene viene trascritta, in assenza del promotore il gene non può essere trascritto. I nucleotidi che si trovano nel promotore (a monte della TSS) hanno numerazioni negative. Nel promotore vi sono delle regioni importanti, la -10, per esempio, è detta Pribnow box ed è ricca di Adenine e Timine. L’importanza di queste regioni è dovuta al fatto che interagiscono con il fattore sigma della RNA polimerasi, proteina aggiuntiva che aumenta l’affinità di legame della RNA polimerasi, che altrimenti tenderebbe a staccarsi.

Funzioni del promotore

• Ha funzione di stabilire il legame iniziale delle RNA polimerasi;
• Fa riconoscere alla RNA polimerasi il punto di inizio della trascrizione;
• Fa riconoscere alla RNA polimerasi quale dei due filamenti è lo stampo;
• Influenza la velocità di trascrizione: a seconda della sequenza nucleotidica il promotore può essere debole o forte (maggiore o minore velocità), un promotore molto forte lo hanno i virus.

Tre momenti base della trascrizione

Inizio

Partendo dalla posizione TSS +1 si ha la denaturazione locale del DNA e l’inizio della polimerizzazione nucleotidica.

Allungamento

Allungamento da parte della polimerasi fino all’incontro di un segnale di terminazione. Con lo spostamento della RNA polimerasi, la parte precedente si natura nuovamente da sola, questo processo è dovuto alla complementarità delle basi. La velocità di allungamento non è costante, nelle zone in cui si trovano G e C la trascrizione rallenta a causa della presenza di tre legami a idrogeno.

Terminazione

RNA polimerasi incontra la sequenza di terminazione e lascia libero il polimero staccandosi.

Caratteristiche dell'RNA messaggero

L’RNA messaggero nei procarioti è spesso policistronico, questo significa che da un solo RNA messaggero si possono ottenere proteine diverse. Negli eucarioti, invece, l’RNA messaggero è monocistronico, codifica per una proteina. Sono diversi, inoltre, come struttura: l’eucariotico ha all’estremità 5’ un cappuccio e all’estremità 3’ una Coda Poli-A, costituita da circa 200 Adenine.

RNA polimerasi negli eucarioti

• RNA polimerasi I: sintetizza rRNA;
• RNA polimerasi II: sintetizza mRNA;
• RNA polimerasi III: sintetizza tRNA, 5S rRNA e altri piccoli RNA.

L’RNA polimerasi II ha a livello dell’L’ una subunità CTD= Dominio carbossil-terminale: il carbossil-terminale è la coda, dominio importante per la funzione dell’enzima. La fosforilazione del CTD segna l’inizio della trascrizione.

Differenza strutturale fra promotore procariotico ed eucariotico

Mentre nei procarioti si arriva almeno a -50 nucleotidi a monte, negli eucarioti si arriva anche a -200. Il promotore eucariotico si divide in promotore basale (fino a -50) e promotore prossimale (fino a -200/-300). Negli eucarioti per iniziare la trascrizione si necessita di Fattori di trascrizione basali (o generici). CAAT box e GC box sono elementi di controllo. La sequenza più importante è la TATA box, questa viene riconosciuta, insieme al promotore e alle regioni più prossimali, dai Fattori di trascrizione basali, che aiutano l’attacco della RNA polimerasi. La TATA box viene anche chiamata “punto di inizio”.

Fattori di trascrizione

I fattori di trascrizione formano insieme alla RNA polimerasi II il complesso di inizio della trascrizione; essi non fanno parte della struttura dell’RNA polimerasi e riconoscono la regione del promotore. Il primo fattore che interviene è il fattore D, il TFIID, costituito da vari tipi di proteine, presenta una grande proteina detta TBP (TATA-box Binding Protein), che riconosce la TATA box e vi si lega. Oltre alla TBP, il TFII è composto da 11 proteine dette TAFs (TBP Associated Factors).

Poi si legano TFIIB, TFIIA, TFIIF (che recluta la RNA polimerasi II) e gli ultimi due TFIIH e TFIIJ che attaccano dei gruppi fosfato alla RNA polimerasi (fosforilazione). Quando si hanno degli enzimi che attaccano dei gruppi fosfato, questi prendono il nome di chinasi e la loro attività viene detta chinasica. Se attacco alla proteina dei gruppi fosfato (aventi cariche negative) si induce un cambiamento conformazionale della proteina che stacca la RNA polimerasi. Questo meccanismo viene utilizzato per attivare o inibire le proteine.

Regolazione della trascrizione genica

Le Sequenze Enhancer (intensificatore, amplificatore), sono brevi sequenze nucleotidiche che possono trovarsi anche molto lontane dal punto +1 (promotore prossimale, promotore distale, a valle del gene), ad esse si legano gli attivatori, proteine chiamate fattori di trascrizione specifici (diversi dai basali che servono per far attaccare la polimerasi al promotore). Queste sequenze influenzano la trascrizione, aumentandone l’efficienza fino a 100 volte, perché si compongono di due parti (dette domini):

• Sito di riconoscimento del DNA: si lega al DNA in una specifica sequenza;
• Sito di attivazione che si lega al complesso di inizio della trascrizione.

I fattori di trascrizione specifici sono molti (più di 2000) e si legano a sequenze specifiche che vengono chiamate Elementi di risposta. I fattori possono legarsi direttamente o attraverso un coattivatore, si tratta di un mediatore tra fattore e complesso basale, spesso vengono indicati anch’essi come fattori di trascrizione (la connessione è caratterizzata da legami non covalenti tra subunità proteiche).

Geni non regolati trascrizionalmente

• Geni housekeeping/di mantenimento/costitutivi: Geni che non vengono regolati trascrizionalmente sono trascritti in ogni momento della vita della cellula e in tutte le cellule; codificano per proteine necessarie per le attività basali cellulari. Sono trascritti nelle cellule in ogni momento della loro vita.

Geni regolati trascrizionalmente

• Geni inducibili: Geni indotti in modo specifico a essere trascritti, ovvero, si attivano in seguito a specifici stimoli. Vengono trascritti in maniera ridotta e a seguito di uno stimolo vengono indotti.
• Geni tessuto specifici: Geni che guidano le cellule nella specializzazione verso diversi tipi cellulari. Sono espressi solo in alcuni tessuti. Le cellule, infatti, hanno lo stesso patrimonio genetico (genoma), ma si differenziano (nei diversi fenotipi cellulari) in base a quali si attivano.

Un esempio di gene inducibile è il Gene Heat-Shock: quando una cellula è esposta ad alte temperature, molte proteine hanno difficoltà ad assumere la corretta conformazione (folding), compromettendo la loro funzione. Le proteine con conformazione non corretta (misfolded) inducono la trascrizione dei geni heat-shock (circa 20), questi codificano per proteine dette chaperoine, o chaperoni molecolari, che aiutano le proteine ad assumere la corretta struttura terziaria, le proteggono da interazioni inappropriate e assistono il processo spontaneo di ripiegamento. La chaperonina è strutturata come una gabbia, la proteina vi si lega e tramite una chaperonina cappuccio, vi viene chiusa dentro. Una volta chiusa, la proteina si ripiega e riprende la sua conformazione corretta. I geni heat-shock hanno una o più sequenze dette elemento di risposta allo shock da calore (HSE) che possono essere localizzate in un enhancer o nel promotore, a queste si lega uno specifico attivatore detto heat-shock factor (HSF) che è indotto dallo shock termico e la trascrizione del gene viene attivata.

Altri elementi di risposta sono: l’elemento di risposta ai glucocorticoidi (GRE), riconosciuta dai recettori dei glucocorticoidi, e l’elemento di risposta al siero (SRE), riconosciuto dai fattori che attivano geni coinvolti nella proliferazione cellulare.

Regolazione dell’espressione genica

Modificazione chimica degli istoni

• Gli istoni sono le proteine attorno alle quali si avvolge il DNA, le proteine sono ricche di amminoacidi con cariche nette positive, questo fa sì che il DNA, negativo grazie ai gruppi fosfato, si avvolga su di esse. Quando l’interazione è presente la cromatina si dice condensata. Per permettere al complesso basale di interagire con il promotore devo annullare la carica negativa degli istoni. Questa modifica, detta acetilazione del DNA (o degli istoni), avviene a livello dell’amminoacido Lisina (Lys/K), dove si aggiunge un gruppo acetile (-COCH3). La presenza del gruppo acetile annulla la carica positiva degli istoni e ne riduce l’interazione con il DNA. L’enzima che attacca il gruppo acetile è l’enzima Acetil-transferasi, l’operazione inversa è svolta invece dall’enzima Deacetilasi. La cromatina acetilata è trascrizionalmente attiva, la cromatina deacetilata è trascrizionalmente repressa. Geni trascrizionalmente attivi fanno parte dell’eucromatina. L’acetilazione è a carico delle code N-terminali H3 e dell’istone H4. (Inibitori delle deacetilasi sono presi risultati efficaci nei modelli sperimentali e nei trials clinici per malattie neurogenerative).

Trascrizione inibita = Repressione genica.

Metilazione del DNA

• L’enzima metil-transferasi (DNMT). Nel promotore molti geni hanno delle zone ricche di C, indicate con la dicitura di isole CpG, queste isole vanno incontro a metilazione (aggiunta di un gruppo metile -CH3 all’estremità 5’ della C). Le isole metilate vedono la repressione della trascrizione. Questo permette di silenziare i geni in caso di mancata necessità della proteina da essi trascritta. La metilazione è, comunque, associata sia all’attivazione che alla repressione genica. In molti tumori le cellule hanno la metilazione del DNA alterata avente un ruolo importante per l’insorgenza e la progressione del tumore, molti farmaci pirimidinici sono risultati efficaci contro la leucemia acuta mieloide.

Maturazione dell’mRNA negli eucarioti

Quando viene sintetizzato l’mRNA si chiama Trascritto primario e va incontro ad un processo di maturazione detto processamento dell’mRNA. Il processamento si divide in:

Capping al 5’

• Prevede l’aggiunta di un Cap costituito da 7-metil-guanina. Il Cap serve anche per il riconoscimento nella traduzione e rende l’mRNA più resistente all’attacco delle nucleasi. Il legame fosfodiesterico che si instaura con è diverso da quello tradizionale, si ha un legame 5’-5’ (all’ossidrile del gruppo fosfato) e la presenza di 3 gruppi fosfato, in quanto, è il primo nucleotide aggiunto. I primi due o tre nucleotidi del DNA sintetizzato vedono la presenza di gruppi metili.

Poliadenilazione al 3’

• Prevede l’aggiunta al 3’ di una coda di A di lunghezza variabile (50-250 nucleotidi). Si ha una proteina che riconosce sull’RNA un segnale specifico e rompe i legami fosfodiesterici (a valle del segnale) in modo da poter aggiungere la Coda Poli-A. L’enzima in carico è la poli(A) plimerasi. Anche in questo caso la coda è utilizzata come protezione e sito di riconoscimento per la traduzione. Non tutti gli mRNA hanno la Coda Poli-A. Questi processi servono per dare stabilità al trascritto e iniziare la traduzione dell’mRNA in proteina.

Rimozione delle sequenze non codificanti (introni)

• Splicing: Essendo che un gene eucariotico è composto da esoni (sequenze codificanti) e introni (sequenze non codificanti). I geni che codificano gli istoni non hanno introni. Il numero e la lunghezza di esoni e introni sono variabili. L’esone iniziale e finale, hanno, rispettivamente, all’inizio e alla fine delle regioni UTR (Untraslated region) che non vengono utilizzate per la traduzione e vengono dette 5’UTR e 3’UTR.

Il meccanismo di splicing prevede l’eliminazione degli introni e avviene prima che l’RNA non maturo passi nel citoplasma. Come avviene? Si hanno un sito di splicing al 5’, detto sito donatore e un sito di splicing al 3’, detto sito accettore. Si ha poca omologia di sequenza, ovvero, molta variabilità della sequenza nucleotidica degli introni, ma i primi due nucleotidi sono sempre uguali = GU, lo stesso vale per gli ultimi due = AG, questo perché sono riconosciuti da proteine che mediano il taglio dell’introne. Un terzo sito importante è il sito di ramificazione (branch site) = A, generalmente non è solo un nucleotide ma un insieme che contiene la A. Le proteine di interesse sono delle ribonucleoproteine. Oltre agli amminoacidi, nella loro struttura hanno dell’RNA, questo fa sì che le proteine possano ancorarsi nel sito donatore e accettore grazie alla complementarità delle basi. A seguito del riconoscimento delle proteine, al 5’ avviene il primo taglio, la parte tagliata si lega al punto di ramificazione; a seguito avviene il secondo taglio al 3’ e l’introne si allontana dalla sequenza nucleotidica con una forma a cappio.

Splicing alternativo

• Splicing alternativo: Uno dei meccanismi di regolazione dell’espressione genica viene indicato come splicing alternativo. Da un gene si possono ottenere diverse isoforme proteiche, le quali sono meno frequenti rispetto a quelle derivate da splicing normale.

Nel caso dello splicing normale ho la sequenza di tutti gli introni, in quello alternativo, invece, ho sequenze di esoni selezionati. Questo avviene perché si ha il mancato riconoscimento di siti di splicing intermedi e si attua un taglio anche dell’esone. Le proteine che derivano da trascritti che vanno incontro a splicing alternativo si perdono gli amminoacidi dell’esone tagliato, questo permette di ottenere proteine dette appunto isoforme.

Nei nostri tessuti, per esempio, si trovano cinque isoforme di tropomiosina, questo è dovuto ai meccanismi di splicing alternativo. Per ciascun tessuto viene espressa una isoforma rispetto che ad un'altra. Nel caso del muscolo striato per esempio, dove è coinvolta nella contrazione muscolare, è fatta in un certo modo, diverso da come è fatta nei fibroblasti, questo dipende dalle proteine con cui deve interagire.

La traduzione

Linguaggio nucleotidico Linguaggio amminoacidico. Componenti della traduzione sono: mRNA, tRNA e ribosoma. Il codice genetico, che ci permette di passare del linguaggio nucleotidico al linguaggio amminoacidico, è scritto in triplette nucleotidiche, dette codoni. Le triplette nucleotidiche sono 64, ogni codone specifica per uno specifico amminoacido, ma esistono amminoacidi codificati da una o più triplette nucleotidiche; infatti, gli amminoacidi sono solamente 20; si dice che il codice genetico è degenerato. La serina è una delle più degenerate, perché è codificata da 6 codoni. Il Triptofano e la Metionina sono gli unici codificati da un solo codone. Il codone codificante la metionina è il codone di inizio = AUG. Esistono poi codoni di stop, o di terminazione, che interrompono la sintesi della proteina.

Proprietà del codice genetico:

• Costituito da triplette nucleotidiche;
• Degenerato;
• Universale;
• Costituito da segnali di inizio (codoni di inizio) e di terminazione (codone di stop).
• Continuo: nessun nucleotide viene saltato;

tRNA

RNA transfer. Costituito da un anticodone composto da 3 nucleotidi, l’anticodone è complementare al codone dell’mRNA e a seconda dell’anticodone di ciascun tRNA, questo viene caricato con uno specifico amminoacido. L’amminoacido si lega al tRNA attraverso il gruppo carbossilico, si attacca all’estremità 3’, ovvero, all’ossidrile del ribosio. Il tRNA è una specie di interfaccia tra l’mRNA e la proteina.

Caricamento dell’amminoacido

La fase del caricamento dell’amminoacido è ATP-dipendente della traduzione. L’enzima Amminoacil-tRNA sintetasi catalizza l’attacco dell’amminoacido al tRNA, esistono diversi enzimi di questo tipo specifici per ciascun amminoacido.

Classi di enzimi

• Classe I: Monomeriche costituite da una catena amminoacidica; trasferiscono l’amminoacido sul gruppo -OH in 2’ del ribosio del tRNA.
• Classe II: Dimerica due catene polipeptidiche (proteine) legate a formare un dimero. Trasferiscono l’amminoacido sul gruppo -OH in 3’ del ribosio terminale.

Ribosomi

Si compongono di due subunità composte, a loro volta, da proteine di varia lunghezza e dall’rRNA. Per quanto queste strutture siano implicate nella sintesi proteica di eucarioti e procarioti hanno delle differenze strutturali, questo fa sì che molti farmaci per inibire la sintesi proteica si basino su queste differenze per il funzionamento. Inizialmente, le subunità dei ribosomi sono separate, solo successivamente, quando si ha la fase iniziale della traduzione si assiste alla formazione del ribosoma completo.

Il ribosoma completo è costituito da 3 siti:

• Sito A (amminoacilico);
• Sito P (peptidilico);
• Sito E (exit): di uscita.

Formazione del legame peptidico

A sintesi avviata: L’ultimo amminoacido della catena è momentaneamente legato al tRNA, questo fa sì che avendo legati a sé 3 aa., ovvero un polipeptide, la catena può continuare con l’aggiunta di nuovi amminoacidi sino alla conclusione del processo di sintesi proteica.