1- Introduzione e Epiteli

Istologia ed embriologia

L’istologia è la realizzazione di ciò che avviene nell’embrione, è un disegno embriologico: moltiplicazione di cellule inizialmente tutte uguali tra loro che poi iniziano a diversificarsi e a dare origine a tutti i tessuti dell’organismo.

Si calcolano 250 tipi di cellule diverse nel nostro organismo; si parte nello zigote da una cellula indifferenziata e, a poco a poco, alcune cellule assumono caratteri diversi e si raggruppano nei tessuti.

Queste due materie vanno viste in maniera strettamente integrata perché i tessuti non sono statici, ovvero una volta compiuto lo standard differenziativo non rimangono uguali a se stessi. All’interno di ogni tessuto, anche nei più immobili, come l’osseo, c’è un continuo rimodellamento; ciò che si studia nell’embriologia si rivede nel differenziamento e anche quando i tessuti si rimodellano rivediamo questo meccanismo di proliferazione attuato nello sviluppo embrionale, e anche nella rigenerazione dei tessuti sia in casi fisiologici che patologici, es. tessuti oggetto di lesione devono essere ricostituiti e l’organismo attua meccanismi che aveva sfruttato nello sviluppo embrionale.

Tessuti, organi, sistemi e apparati

I tessuti sono costituiti da cellule accomunate da caratteristiche simili morfologiche o funzionali.

• Tessuto epiteliale: è formato da cellule a mutuo contatto tra di loro.
• Tessuto connettivo: le cellule sono inframezzate con altri costituenti, non ci sono solo cellule ma c’è una matrice intracellulare.
• Tessuto sangue: nel tessuto connettivo ci sono varie specializzazioni; nel tessuto sangue la matrice è liquida.
• Tessuto osseo: nel tessuto osseo la matrice è mineralizzata.
• Tessuto muscolare scheletrico, muscolo cardiaco, muscolo liscio: tutti questi tessuti sono accomunati dalla capacità contrattile; il muscolo scheletrico è volontario, nelle pareti degli organi cavi.
• Tessuto nervoso: è composto da cellule che hanno una spiccata capacità di diventare sede di segnali elettrici e di comunicare mediante le sinapsi trasmettendo il segnale ad altre cellule nervose o di altra natura.

I tessuti si organizzano a formare gli organi che costituiscono sistemi o apparati.

L’apparato tegumentario: l’epitelio è l’epidermide, poi c’è il tessuto connettivo, tessuto ghiandolare, tessuto nervoso.

L’apparato cardiovascolare: vari tessuti cooperano per formare questo apparato.

Microscopi

Micron = millesima parte di 1 mm.

• Potere risolutivo: distanza minima alla quale due punti devono trovarsi per essere percepiti come distinti.
• Potere di ingrandimento.
• Contrasto: le diverse parti osservate hanno differenze di assorbimento.

Microscopio ottico

Microscopio convenzionale, “microscopio ottico”: è un sistema di lenti, dalla sorgente luminosa (lampadina) proviene il fascio luminoso che tramite un sistema di specchi e lenti è convogliato sul preparato; quando i raggi luminosi attraversano il campione si forma l’immagine.

L’immagine è raccolta dall’obiettivo dove si trova una lente che ingrandisce, poi l’immagine è convogliata all’oculare (dove poggiamo gli occhi) e l’immagine è quindi ingrandita due volte, una volta dalla lente dell’obiettivo e una seconda dalla lente dell’oculare.

Può arrivare a 1200 ingrandimenti: si moltiplica il potere di ingrandimento della lente dell’obiettivo che può arrivare al massimo a 100, per il potere di ingrandimento della lente dell’oculare, che al massimo può arrivare a 12x.

Microscopio elettronico

Microscopio “elettronico”: si entra nell’ultrastruttura, esso non utilizza un fascio di raggi luminosi ma di elettroni, si tratta di un filamento (anodo) di tungsteno da cui partono questi elettroni che vengono diffusi in una colonna, che è sotto vuoto di 10^-5 atm, e questo fascio è convogliato mediante un condensatore, che è un campo elettromagnetico, verso il preparato, una sezione di dimensioni di 10-20 nm (millesima parte di 1 micron).

A seconda della densità delle strutture il fascio è trattenuto o lasciato passare e il fascio che esce dal preparato passa attraverso l’obiettivo, che non è una lente ottica, ma un campo elettromagnetico, e attraverso un sistema di proiezioni, campi elettromagnetici, si ha l’ingrandimento dell’immagine che poi è proiettata su uno schermo digitale.

Sono visibili strutture subcellulari come membrane, citoscheletro e organuli. (200 mila ingrandimenti)

Microscopio elettronico a trasmissione

Microscopio elettronico “a trasmissione”: permette di osservare internamente il campione, fornisce informazioni sulla struttura interna della cellula.

Microscopio elettronico a scansione

Microscopio elettronico “a scansione”: il fascio di elettroni non attraversa il preparato ma lo va a colpire, il preparato è ricoperto con materiale conduttivo (particelle di oro, platino, carbone), quando gli elettroni primari (del fascio emesso dal catodo) raggiungono questa superficie resa conduttiva, sono emessi elettroni secondari che formano dei segnali che dipendono dalla superficie del campione e vengono captati da un rilevatore di elettroni, che trasmette un segnale elettrico, che diviene digitale ed è riportato su schermo.

Ci rivela come sono fatte le superfici degli organi e delle cellule.

Microscopio confocale laser

1 - “Microscopio confocale laser”, riesco a vedere se su una membrana di una cellula c’è la molecola x e quanto è estesa la sua distribuzione.

Il raggio laser è la sorgente luminosa ma posso variare la lunghezza d’onda di emissione con cui viene colpito il preparato —> vantaggio: posso mettere a fuoco uno strato molto sottile del preparato, posso fare un sezionamento digitale, strato per strato e dire dove si trova la positività, vado a localizzare la presenza della sostanza x in maniera molto più perfezionata.

Basofilia e acidofilia

Per analizzare un tessuto bisogna bloccare i meccanismi biologici, il tessuto deve offrire una resistenza alla lama che lo taglia.

1. Si fa una fissazione tramite liquidi come acidi (acido acetico) o con la formalina. Il tessuto è bloccato, reso immortale.
2. Per renderlo solido e sezionabile si fa l’inclusione in un mezzo solido, solitamente in paraffina oppure in altri mezzi come in resine. Poi il campione va disidratato perché la paraffina è una soluzione organica che messa nell’acqua non si mescola, quindi si toglie l’acqua al preparato e al suo posto si fa entrare la paraffina e si fa solidificare il tutto.
3. Ci sono strumenti che attuano sezioni di pochi microns, microtomi, e si ottiene una sezione di paraffina e si mette sul vetrino. Ora però il tessuto sezionato non offre contrasto, è difficile distinguere la paraffina dal campione.
4. Processo di colorazione: i coloranti sono di varie tipologie, alcuni vitali per essere usati su cellule vive, generalmente si usano coloranti acidi (l’eosina) o basici (l’ematossilina).

Questi coloranti vanno a legarsi ai costituenti delle cellule dei tessuti: nel nucleo il componente maggiore è il DNA = acido desossiribonucleico, nella parete del mitocondrio ci sono proteine enzimatiche, e anche nei lisosomi, nei ribosomi c’è l’acido ribonucleico, nel liquido citoplasmatico è più difficile individuare i costituenti.

Quindi i costituenti principali sono acido nucleico e proteine, se uso coloranti acidi o basici ciascun gruppo va a legarsi a costituenti che hanno reazione reciproca: i coloranti acidi si legano ai costituenti basici della cellula, es. proteine, i coloranti basici si legano ai costituenti acidi della cellula, es. acido nucleico.

Ci sono cellule cromofobe e cromofile, tra quest’ultime si distingue tra basofile o acidofile:

• Basofilia = affinità per i coloranti basici (ematossilina), zone con abbondanza di contenuti acidi: il nucleo, per il citoplasma delle cellule con abbondanza di ribosomi.
• Acidofilia = zone che si legano al colorante acido, all’eosina, sono zone dove prevalgono le proteine enzimatiche, citoscheletro, mitocondri e lisosomi.

Immunoistochimica

L’immunoistochimica: questa metodica serve per riconoscere molecole specifiche in un tessuto o cellula o su membrana della cellula, e si basa sulle proprietà del sistema immunitario.

Nel nostro organismo delle cellule possono riconoscere ciò che appartiene all’organismo, il self, e ciò che non gli appartiene, il not self. I vaccini si basano sul prevenire una malattia introducendo un patogeno o parti del patogeno così che il sistema immunitario riconosca il not self e si armi degli anticorpi.

A scopo di ricerca si può sfruttare questa proprietà del sistema immunitario producendo gli anticorpi contro una precisa molecola; gli anticorpi sono specifici, selettivi, un anticorpo riconosce solo la sostanza x —> se prendo la sostanza x e la inietto in un organismo, l’organismo produce anticorpi anti-x, allora, isolando gli anticorpi ho a disposizione un sistema di riconoscimento della sostanza x.

Tuttavia preso l’anticorpo, non è evidente il suo legame con la sostanza di studio, il legame deve essere messo in evidenza: si utilizza un sistema di rivelazione, i sistemi più utilizzati: un marcatore, un qualcosa legato all’anticorpo per vedere dove va a posizionarsi l’anticorpo.

I più comuni marcatori fluorescenti sono i fluorocromi. I colori dipendono dalle radiazioni che emettono i fluorocromi una volta colpiti dai raggi ultravioletti. Si utilizza il microscopio confocale laser per evidenziare questa fluorescenza.

Di solito il tracciante non è posizionato sull’anticorpo (metodo diretto) ma, per amplificare il segnale, si usa il metodo indiretto: si utilizza l’anticorpo primario, è diretto contro la sostanza x e in più un anticorpo secondario diretto sull’anticorpo primario e il tracciante si trova sul secondario. (Posso, infatti, generare anticorpi contro anticorpi, iniettando anticorpo umano in organismo di coniglio e si sviluppano anticorpi contro i primi).

Gli anticorpi fino a qualche decennio fa erano solo policlonali ma ad oggi nel mondo terapeutico e biotecnologico si possono usare i monoclonali.

Anticorpi policlonali = la sostanza x ha varie sfaccettature, è scomponibile in tanti antigeni x1, x2, x3, x4…xn, ciascun gruppo (clone) di linfociti riconoscerà uno di questi antigeni x1, x2, x3, quando vado a prendere il pool di anticorpi contro la sostanza x, ho anticorpi tutti contro sostanza x ma di cui ognuno riconosce una diversa sfaccettatura.

2 Anticorpi monoclonali = posso prendere il clone che produce anticorpi contro x1, clone contro x2, clone contro x3 e tramite amplificazione creo anticorpi contro un singolo determinante antigenico (x1, x2, x3); è importante perché nel mondo della terapia si fa utilizzo di anticorpi monoclonali contro una singola cellula cancerogena, permettono di portare l’anticorpo alla cellula specifica risparmiando tutte le altre cellule, quindi posso avere un’azione mirata diretta alla sola cellula da distruggere.

Epiteli di rivestimento

EPITELI DI RIVESTIMENTO (anche ghiandolari e sensoriali)

• Cellule a mutuo contatto (giunzioni di adesione con caderine), distanziate da pochi nm.
• Adesione alla membrana basale (emidesmosomi).
• Forma e polarità, hanno dominio basale, apicale e laterale.
• Non devono essere direttamente vascolarizzate, ricevono nutrimento dal connettivo sottostante.

Citoscheletro e giunzioni sono organizzati per sviluppare differenze cellulari presenti nei diversi tessuti epiteliali.

• I filamenti intermedi = tonofilamenti nei tessuti epiteliali, perché danno tono alle cellule stesse.
• Strutture stabili.
• Nei diversi tipi cellulari trovo cheratine diverse per l’assemblaggio in tetrameri di monomeri diversi.
• Sostengono l’architettura della cellula.
• Connessione alla membrana basale (emidesmosomi).
• Connessione alle cellule adiacenti (desmosomi).

Riconoscimento

• Nucleo appiattito = pavimentoso semplice (= monostrato).
• Nucleo rotondeggiante = pavimentoso cubico semplice.
• Nucleo ovalare con asse maggiore perpendicolare alla base d’impianto = cilindrico semplice.
• Nucleo ovalare su più strati = cilindrico composto, appare come lo pseudostratificato.

In base al numero di strati

1. Epitelio semplice = monostratificato, è situato in sedi protette del nostro corpo => sottigliezza ottima per scambi gassosi, es. alveoli polmonari.
2. Epitelio composto = pluristratificato, solo lo