Cromatografia

Cromatografia

La cromatografia fa parte delle tecniche di separazione (come distillazione frazionata, cristallizzazione, estrazione con solvente, filtrazione, elettroforesi capillare, ecc.) che, in pratica, sfruttano e amplificano differenze, anche minime, fra le specie chimiche per ottenere una separazione economica ed efficiente. In particolare i metodi cromatografici sfruttano la diversa affinità di molecole e ioni nei confronti di due fasi diverse (immiscibili) - un po’ come avviene nell’estrazione con solvente - le molecole vengono separate sulla base di interazioni specifiche con un ligando immobilizzato (fase stazionaria). La separazione avviene nel corso del passaggio di una fase mobile attraverso una fase stazionaria ed è dovuta alla competizione fra le due fasi che interagiscono coi componenti la miscela. Possono essere separate anche sostanze molto simili.
La cromatografia viene utilizzata per separare materiali in grandi quantità (parecchi grammi) e piccole quantità (alcuni picogrammi). Per arrivare alla purificazione completa di una sostanza si deve usare una sequenza di più metodi cromatografici.
• Tutti i sistemi cromatografici hanno due fasi:
la fase stazionaria (immobilizzata) solida o liquida o solida/liquida
la fase mobile liquida o gassosa, che scorre attraverso la fase stazionaria
scelti in funzione delle caratteristiche dei composti da separare. Le fasi possono essere in varie combinazioni in dipendenza del tipo di cromatografia, ad esempio fase mobile liquida e stazionaria solida o liquida, oppure fase stazionaria liquida e fase mobile gassosa.

I primi esperimenti di cromatografia risalgono al 1903, quando Mikhail Tswett separa pigmenti estratti da piante mediante cromatografia di adsorbimento usando carbonato di calcio come adsorbente e una miscela di benzina e etanolo come eluente.
Classificazione in base ai meccanismi di separazione o ai fenomeni chimico-fisici principalmente coinvolti: avremo quindi cromatografia …
 d'adsorbimento: si basa su un equilibrio d'adsorbimento tra una fase stazionaria solida e una fase mobile liquida.
 di ripartizione: si basa su un equilibrio di ripartizione tra una fase stazionaria liquida (o semiliquida) e una fase mobile liquida.
 a scambio ionico: si basa su un equilibrio di scambio ionico tra una resina a scambio ionico (la fase stazionaria) e una fase elettrolitica mobile.
 ad esclusione: un equilibrio tra una fase liquida interna ed una esterna a un setaccio molecolare.
 d'affinità: si basa su un equilibrio tra una macromolecola e una sostanza a basso peso molecolare basato sull'interazione specifica tra esse.
Si tratta di interazioni deboli (legami a H, interazione dipolo-dipolo, legami di van der Waals), ma possono formarsi composti di coordinazione, instaurarsi meccanismi di scambio ionico, interazioni steriche, ecc. In ogni caso la polarità delle due fasi gioca un ruolo decisivo.
I meccanismi coinvolti sono molteplici, generalmente in una separazione agiscono un meccanismo principale e, in misura minore, dei meccanismi secondari.

In base al supporto (fase Stazionaria)
Le matrici in uso per la fase stazionaria sono selezionate per avere alta resistenza meccanica, alta stabilità chimica, alta capacità e gruppi funzionali per l'eventuale legame. I materiali più utilizzati per le fasi stazionarie sono:
• Agarosio: polisaccaride di unità di D-galattosio
• Cellulosa: polisaccaride di unità glucosio
• Destrano: polisaccaride di glucosio
• Poliacrilammide
• Silice: polimero idrofilo costituito da ortosilicati
• Polistirene: polimero di stirene stabile a vari pH

O in base alle tecniche utilizzate:
- cromatografia su colonna: la fase stazionaria viene impaccata in colonne di vetro o di metallo.
Possono intervenire i meccanismi:
• a scambio ionico
• per filtrazione su gel
• per affinità
• di ripartizione
• di assorbimento.


- cromatografia planare
a)su strato sottile: la fase stazionaria ricopre sotto forma di strato sottile piastre di vetro, plastica o di metallo.
b) su carta: la fase stazionaria aderisce alle fibre di cellulosa di un foglio di carta.


- Alcuni aggiungono anche gascromatografia (avviene su colonna o su capillare, vedi dispensa specifica) e HPLC (su colonna, vedi dispensa specifica).


A parte per la cromatografia su strato sottile nella versione più semplice, tutte le separazioni cromatografiche si concludono con la registrazione del cromatogramma, ovvero del tracciato che descrive l’andamento del segnale del rivelatore in funzione del tempo. Nel caso ideale ogni sostanza ha il suo picco, la cui area è proporzionale alla concentrazione e i cui parametri (ad esempio il tempo di ritenzione) sono propri della sostanza. Dà quindi informazioni sulla quantità e sulla qualità della sostanza. Per una buona separazione i picchi devono essere il più possibile separati e stretti (e il sistema è selettivo ed efficiente):


I picchi sono stretti, il sistema è capace di eluire tutte le particelle di una data specie con la stessa velocità (efficienza), in modo da formare bande strette


I picchi sono separati, il sistema utilizzato ha buona selettività, ossia è capace di eluire sostanze diverse a velocità diversa, in modo che siano ben separate in uscita.



Cromatografia d'adsorbimento

• Un adsorbente può essere definito come un solido che ha le proprietà di tener legate molecole alla sua superficie, particolarmente quando è poroso e finemente diviso.
• L'adsorbimento può essere abbastanza specifico e, pertanto, un soluto può essere selettivamente adsorbito a partire da una miscela eterogenea.
• La cromatografia di adsorbimento può essere eseguita sia su colonna sia su strato sottile.
• L’area superficiale è un parametro importante: i granuli devono essere piccoli (Φ= 2 ÷ 10 μ) e porosi, perché la superficie deve essere decine di m2/g di adsorbente. Non devono comunque essere eccessivamente piccoli (polverulenti) per non dare impaccamenti e cammini preferenziali della miscela da separare.
• La fase stazionaria, se solida, può essere costituita da ossido d'alluminio attivato , acido silicilico (gel di silice) attivato , ossido di magnesio, carbonato di magnesio, carbonato di calcio, carbonato di zinco, kieselgur (farina di diatomee), carbone attivo, o cellulosa (polarità decrescente).
• L'idrossiapatite (fosfato di calcio) è l'adsorbente che più comunemente viene usato per la separazione di proteine, acidi nucleici e virus, perché, a differenza di altri adsorbenti, possiede alcune proprietà di scambio ionico che migliorano la separazione.
• Se la fase stazionaria è liquida, si usano dei lipofili su supporto: idrocarburi, squalano, silicone, clorobenzene, nitrometano.

Caratteristiche della fase mobile:
La polarità è paragonabile a quella dell'analita più polare presente nella miscela di composti da separare. I solventi si usano puri o in miscela.
1) alcoli se gli analiti contengono -OH
2) acetoni o esteri se gli analiti contengono

3) idrocarburi (esano, eptano, toluene) se gli analiti sono apolari

Si usano, in ordine di polarità decrescente: miscele acquose di acidi o basi, acqua, metanolo, etanolo, propanolo, acetone (CH3COCH3), cloroformio (CHCl3), toluene, benzene, tetracloruro di C (CCl4), cicloesano, n-eptano, n-esano, eteri di petrolio.


Cromatografia di ripartizione
Nella cromatografia di ripartizione, si sfrutta la tendenza delle molecole a ripartirsi diversamente tra due diverse fasi. Un esempio è la cromatografia per interazione idrofobica che sfrutta l'idrofobicità superficiale delle proteine dovuta alla presenza di residui amminoacidici non polari).
Le sostanze da separare sono sciolte in un solvente. La soluzione (fase fissa) viene fatta aderire ad un supporto solido e successivamente messa a contatto con un secondo solvente, immiscibile col primo (fase mobile). I componenti si ripartiscono fra il 1° solvente e il 2° secondo un rapporto caratteristico Kd.
• Il fondamento di tutte le tecniche è il coefficiente di ripartizione (o coefficiente di distribuzione) Kd che descrive come il composto si distribuisce tra due fasi immiscibili.


Il soluto si ripartisce tra le due fasi mobili 1 e 2 immiscibili per una sostanza messa tra due volumi uguali di solvente A e B

• la distribuzione del composto è valida anche tra due fasi qualsiasi, solido/liquido, gas/liquido.


CFs = CFm x Kd
L’equazione sopra, detta equazione di ripartizione di Nernst o isoterma, è l’equazione di una retta, con Kd come coefficiente angolare. E’, valida solo per soluzioni diluite.


Esempio: 3 diverse specie molecolari con K diverse fra le due fasi (0.2, 1, 2 ) possono essere separate per cromatografia. In senso orario aumenta la distanza percorsa dal soluto con la fase mobile.


K varia con la concentrazione (isoterme di Langmuir)

In fase normale (più frequente con adsorbimento)
fase stazionaria: polare (alchil ammina legata a silice)
fase mobile: relativamente non polare (esano , eptano, etilacetato o gradiente di polarità crescente)
L'ordine di eluizione degli analiti è tale che viene eluito per primo quello meno polare e per ultimo quello più polare.

In fase inversa (spesso usata in HPLC)
fase stazionaria: apolare (introduzione di catene idrofobiche (C4, C8, C18...) sulla silice mediante derivati alchilici del tricloroesano:



fase mobile: relativamente polare (acqua o tamponi acquosi, metanolo, acetonitrile, miscele di questi solventi).
Gli analiti instaurano interazioni apolari con la fase stazionaria e la separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile. Gli analiti polari eluiscono per primi e quelli non polari per ultimi.


Cromatografia a scambio ionico
Il principio su cui si basa questo tipo di cromatografia è l'attrazione che si verifica tra molecole cariche di segno opposto (è limitata alla separazione di molecole ionizzabili).

• Molti materiali biologici, ad esempio amminoacidi e proteine, possiedono gruppi ionizzabili e il fatto che essi possano portare una carica netta positiva o negativa può essere utilizzato nella separazione di miscele che li contengano. La carica netta che questi composti presentano dipende dal loro pKa e dal pH della soluzione secondo l'equazione di Henderson-Hasselbach .
Le separazioni a scambio ionico sono condotte in colonne impaccate con una resina scambiatrice di ioni, costituita da una matrice inerte con gruppi funzionali ionizzabili, che scambiano i propri controioni con altri di uguale carica presenti nei componenti della miscela da separare. Possono essere usati scambiatori più o meno forti, a seconda della loro ionizzazione a diversi pH. La fase mobile contiene ioni che competono con quelli legati alla matrice.
• La resina costituisce la fase fissa. Esistono due tipi di resine: gli scambiatori anionici (o resine basiche, hanno gruppi –NH2, =NH , raramente N)e gli scambiatori cationici (o resine acide, hanno gruppi –SO3H o solfonico, -COOH , -PO3H2 o fosforico, -OH ). I gruppi funzionali anionici o cationici sono saldamente ancorati alla resina, che non partecipa alle reazioni.


Il meccanismo di scambio ionico si compone di 5 fasi distinte:

1. Diffusione dello ione alla superficie della resina.
2. Diffusione dello ione attraverso la matrice della resina verso il sito di scambio.
3. Spiazzamento dello ione al sito di scambio.
Negli scambiatori cationici:

Negli scambiatori anionici:


Quanto maggiore sono la carica e il diametro dello ione da scambiare, tanto più forte è il legame con la resina e tanto meno facilmente esso può essere sostituito da altri ioni.
Gli ioni seguenti sono riportati secondo forza di ritenzione crescente (quelli a destra sono ritenuti più tenacemente, quindi sostituiscono quelli a sinistra):
Na+<K+<Mg++<Ca++<Al+++<Fe+++<Cl-<I- ecc.
4. Diffusione del controione attraverso la resina.
5. Distacco selettivo, a opera di un eluente, e diffusione della molecola nella soluzione esterna. L'eluizione selettiva delle molecole legate alla resina si ottiene variando il pH o la forza ionica o entrambi, oppure mediante l'eluizione di affinità. In quest'ultimo caso viene introdotto nel sistema uno ione dotato di maggiore affinità per lo scambiatore di quella della molecola legata.


Es: separazione proteine
La tecnica è adatta per grandi volumi e grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml). Le proteine vengono eluite in concentrazioni anche alte di sali, da rimuovere successivamente mediante dialisi


Materiali
Molti scambiatori ionici sono costituiti da polimeri di stirene e di divinilbenzene (polistirene). Il polistirene, come tale, è un polimero lineare, solubile in numerosi solventi.
Come alternativa alle resine polistireniche hanno avuto un largo impiego le cellulose modificate chimicamente. Analoghi ai derivati della cellulosa sono i derivati del destrano e dell' agarosio (Sephadex e Sepharose), usati in particolare nelle separazioni di proteine a elevato peso molecolare e di acidi nucleici.


Procedura e applicazioni
• La scelta dello scambiatore dipende dalla stabilità del campione, dal peso molecolare dei suoi componenti e dalle esigenze che la separazione presenta. Uno dei parametri più importanti è il pH (ad esempio le proteine sono stabili solamente in uno stretto intervallo di pH, per cui lo scambiatore dovrà funzionare entro i limiti di questo intervallo).
• Anche nella scelta tra uno scambiatore forte e uno debole occorre valutare la stabilità del campione e l'effetto del pH sulla carica del campione. Gli scambiatori deboli vanno bene per separare elettroliti forti.
• Il pH del tampone impiegato è normalmente superiore o inferiore di almeno un'unità rispetto al punto isoionico dei composti da separare.
Esempio 1: La separazione di aminoacidi (ottenuti, ad esempio, dall'idrolisi di una proteina) si effettua su uno scambiatore di cationi acido forte. Il campione viene introdotto nella colonna a un pH 1-2, per far sì che tutti gli aminoacidi si leghino. L'eluizione si ottiene, poi, mediante un gradiente in cui aumentano pH e forza ionica.
• Fase stazionaria: scambiatore cationico forte polistirene solfonato
• Fase mobile: tampone citrato/acido citrico
• Eluizione con gradiente di pH e forza ionica, ad esempio citrato/acido citrico da pH 2 a pH 5 e di ioni Na+ da 0,2 a 0,4M
• Gli aminoacidi vengono eluiti sequenzialmente quando i valori del pH si avvicinano al loro punto isoelettrico:
• a pH basso: acidi (es. Asp, Glu)
• a pH neutro: neutri (es. Gly, Val)
• a pH basico: basici (es. Lys, Arg)
Un analizzatore di amminoacidi contiene un sistema continuo di registrazione dell'eluato: nel cromatogramma ad ogni picco corrisponde un amminoacido.

Esempio 2: La cromatografia a scambio ionico delle proteine si compie invece su scambiatori acidi o basici deboli derivati dalla cellulosa o da altri polisaccaridi.

Tipi di resine Gruppo funzionale Nome comune
Scambiatore di cationi debole carbossimetil CM cellulose/sephadex
Scambiatore di cationi forte sulfopropil SP sephadex
Scambiatore di anioni debole dietilaminoetil DE cellulose/sephadex
Scambiatore di anioni forte ammine quaternarie QAE sephadex

una proteina si legherà a una resina a scambio cationico se il pH del tampone è più basso del suo punto isoelettrico (pI) e si legherà ad una resina a scambio anionico se il pH del tampone è più alto del suo pI.

Esempio
Proteina n.1 pI=9.0 Proteina n.2 pI=7.5
Buffer pH: 7.0
Il pH del tampone è significativamente più basso del punto isoelettrico della proteina, quindi la proteina avrà una carica positiva moderatamente forte Il pH del tampone è di poco inferiore al punto isoelettrico e perciò la proteina avrà una debole carica positiva

La proteina 1 si legherà sia ad una resina a scambio cationico debole che forte
(da usarsi quella a scambio cationico debole) La proteina 2 si legherà ad una resina a scambio cationico forte
(da usarsi quella a scambio cationico forte)

la conoscenza del punto isoelettrico è quindi utile nel disegnare un protocollo di purificazione usando resine a scambio ionico.




In definitiva le applicazioni della cromatografia a scambio ionico riguardano:
1. separazione di molecole organiche cariche
2. separazione di ioni metallici (es. Ca2+ e Mg2+)
3. separazione di proteine e polisaccaridi ricorrendo a matrici di cellulosa, destrani e poliacrilammide
4. separazione di nucleotidi, aminoacidi ricorrendo a resine a base di destrani e poliacrilammide.


Cromatografia a esclusione ( o di permeazione – gel filtrazione)
Per la separazione di molecole in base alla loro forma e al loro peso molecolare vengono utilizzate le proprietà di setaccio molecolare che sono proprie di numerosi materiali porosi. I materiali più comunemente usati a questo scopo sono un gruppo di polimeri presenti sotto forma di un reticolo tridimensionale poroso che conferisce loro proprietà di gel. Per tale motivo si usa solitamente il termine gel filtrazione per descrivere la separazione di molecole di varia grandezza che utilizza questi materiali. Nel caso, invece, che vengano usati come setacci molecolari granuli di vetro poroso, si parla di cromatografia su vetro a porosità controllata.
Pertanto, con il termine cromatografia a esclusione o di permeazione, vengono indicati, in generale, tutti quei processi di separazione che sfruttano setacci molecolari.

La cromatografia a esclusione si fonda su un principio abbastanza semplice: una colonna di particelle di gel (gel filtrazione) o di granuli di vetro poroso è in equilibrio con un solvente adatto alle molecole da separare. Le molecole più grandi, completamente escluse dai pori, passano attraverso gli spazi interstiziali, mentre le molecole più piccole si distribuiscono nel solvente presente sia all'interno sia all'esterno del setaccio molecolare e attraversano quindi la colonna a velocità più bassa.


=> se la nostra proteina è molto più "piccola" o molto più "grande" comparata alle altre molecole "contaminanti" del campione la gel filtrazione lavorerà in maniera soddisfacente


Ma dove sarà eluita una proteina in un esperimento di gel filtrazione?
• Ci sono due estremi nel profilo di separazione di una colonna di gel filtrazione
• Esiste una massa molecolare "critica" (la massa grande) che sarà completamente esclusa dai canalicoli dei granuli di gel. Tutti i soluti nel campione che sono uguali , o più larghi, di questa grandezza critica si comporteranno in maniera identica: saranno eluiti nel volume "escluso" (extragranulare) della colonna.
• Esiste una massa molecolare "critica" (la massa piccola) che sarà completamente inclusa nei canalicoli dei granuli di gel. Tutti i soluti nel campione che sono uguali , o più piccoli, di questa grandezza critica si comporteranno in maniera identica: saranno eluiti nel volume "incluso" della colonna.
Le molecole più grandi passano attraverso la colonna cromatografica percorrendo un cammino extragranulare e sono eluite più rapidamente, mentre le molecole più piccole sono ritardate perchè entrano nei granuli del gel. La migrazione dipende quindi dalla capacità delle molecole di entrare in un reticolo, funzione del loro ingombro. In sintesi, nella filtrazione su gel:
• L'interazione avviene tra la proteina e la matrice polimerica.
• La matrice polimerica è fatta di microsfere con porosita’ controllata.
• Le proteine interagiscono con i pori delle microsfere e vengono trattenute in base alla loro dimensione.








I principali limiti della tecnica sono legati alla bassa capacità (piccoli volumi) e alla necessità di usare soluzioni non viscose.

Determinazione del peso molecolare
La cromatografia per filtrazione su gel è usata analiticamente per la determinazione del peso molecolare (esiste una proporzionalità tra il coefficiente di partizione (KAV) e il logaritmo del Peso Molecolare).
Per determinare il peso molecolare relativo di una sostanza si procede effettuando una cromatografia di calibrazione, nella quale si determina il KAV di sostanze diverse a peso molecolare noto. Questi valori vengono usati per generare una curva di taratura, dalla quale poi si ricava il peso molecolare per interpolazione.




Oltre che su colonna, la gel filtrazione può essere condotta su strato sottile.
La gel filtrazione su strato sottile (TLG)
• Nella TLG si stratifica su una lastra di vetro il gel rigonfio. Il solvente presente negli interstizi costituisce la fase mobile.
• La lastra per TLG è posta in un contenitore chiuso, ed è collegata a entrambi i lati, per mezzo di ponti di carta da filtro, con recipienti contenenti il solvente. La lastra è inoltre inclinata di 20° circa per facilitare lo scorrimento della fase mobile. L'equilibramento deve durare almeno 12 ore. Si può anche tenere la lastra in posizione orizzontale e provocare il flusso del solvente ponendo a diverso livello i recipienti che lo contengono.
• Il campione viene applicato sotto forma di macchia o di banda e la lastra è lasciata correre per un tempo opportuno. Dopo la corsa le macchie risolte vengono evidenziate con metodi appropriati.
• La TLG viene adottata per la separazione di sostanze idrofile che richiedono condizioni sperimentali blande, come proteine, peptidi, acidi nucleici. Sostanze , cioè, ad alto peso molecolare.
• Il maggior vantaggio della TLG rispetto alla gel filtrazione su colonna è che possono essere cromatografati contemporaneamente, e nelle stesse condizioni, numerosi campioni. Inoltre è possibile applicare quantità molto piccole di campione, il che rappresenta una caratteristica senz'altro ideale nelle applicazioni cliniche.

Maggiori sono le dimensioni delle particelle del gel e maggiore è anche la velocità di flusso della colonna, mentre è minore il grado di risoluzione. Pertanto è preferibile usare particelle molto piccole per scopi analitici e gel a grana grossa per scopi preparativi. La capacità di un determinato gel rappresenta una misura della quantità in peso di un soluto per peso di gel che può penetrare in quel gel.

La principale applicazione della cromatografia a esclusione è la purificazione delle macromolecole biologiche.


Cromatografia di affinità
La purificazione tramite cromatografia d'affinità, a differenza degli altri tipi di cromatografia, dell'elettroforesi e della centrifugazione, non si basa sulle differenze nelle proprietà fisiche delle molecole da separare, ma sfrutta le interazioni altamente specifiche delle molecole biologiche. A causa dell'alta specificità di tali interazioni, la selettività della cromatografia per affinità è potenzialmente la più alta tra i tipi di cromatografia, offrendo la possibilità di purificazioni in one-step, almeno in teoria, di una molecola specifica da una miscela anche molto complessa.
Questa tecnica è stata sviluppata inizialmente per la purificazione degli enzimi, ma, in seguito, è stata anche applicata ai nucleotidi agli acidi nucleici, alle immunoglobuline, ai recettori di membrana e, persino, a cellule o a frazioni subcellulari.
La tecnica prevede che il composto da purificare si leghi reversibilmente (un opportuno eluente farà poi staccare la molecola) a un ligando specifico, immobilizzato con legame covalente su una matrice inerte.
Il ligando è una molecola che si lega con alta specificità alla proteina di interesse, deve avere affinità elevata per catturare la molecola di interesse, ma non così alta da impedire il suo distacco senza denaturazione. Generalmente si utilizza un braccio spaziatore, di 6-10 atomi di carbonio, che facilita le interazioni tra il ligando e la proteina bersaglio.
La procedura di eluizione che consente il recupero della proteina favorendo il suo distacco dal ligando, può essere effettuata in diversi modi, per esempio mediante utilizzo di soluzioni ad alta concentrazione di ligando libero, oppure mediante soluzioni con pH o forza ionica diversi, che riducono l'affinità tra colonna e ligando.




Il metodo necessita, dunque, di una dettagliata conoscenza della struttura e delle specificità del composto da purificare, in modo da poter allestire accuratamente le condizioni di separazione che diano la resa più elevata. Nel caso di un enzima, il ligando può essere rappresentato dal substrato, da un inibitore reversibile o da un attivatore, da basi di sequenza complementare, enzimi, anticorpi, ormoni. Le matrici utilizzate per immobilizzare il ligando sono caratterizzate da scarse interazioni aspecifiche e da buone proprietà di flusso, in genere sono costituite da gruppi chimici modificabili (NH3 -COOH -SH -OH) e sono stabili rispetto a variazioni di pH, temperatura, etc. Le matrici insolubili impiegate sono cellulosa, destrano, agarosio, poliacrilammide,vetro poroso.


Classificazione in base alle tecniche
Nella cromatografia su colonna, la fase stazionaria, in genere associata a una matrice inerte e insolubile, è contenuta in una colonna di vetro, plastica o metallo. La fase mobile passa attraverso quella stazionaria in seguito alla pressione generata per gravità dal dislivello del liquido o dalla rotazione di una pompa peristaltica (per tenere costante attraverso la colonna il flusso della soluzione che costituisce la fase mobile). Le colonne correntemente in uso sono corredate di valvole, rubinetti, sistemi di collegamento che ne facilitano l’utilizzo. La tecnica è utilizzata sia per scopi analitici che preparativi. La cromatografia su colonna può essere effettuata in maniera anche completamente manuale, ma dispositivi elettromeccanici o elettronici sono spesso usati per automatizzare il processo e renderlo più riproducibile. Un sistema cromatografico prevede l’utilizzo di un dispositivo di rivelazione, in genere uno spettrofotometro, in grado di seguire le molecole eluite, di un registratore che genera un tracciato, detto cromatogramma e, opzionalmente un collettore dei campioni per scopi preparativi.

Tipicamente si procede in questo modo:
• La colonna viene preparata equilibrando la matrice con il mezzo utilizzato per la fase stazionaria.
• Si applica il campione.
• Si eluisce con un flusso di soluzione.
• Le molecole vengono trattenute in maniera diversa perchè interagiscono diversamente con la fase stazionaria.
• L’eluito viene raccolto in frazioni con un collettore automatico.

Diversi tipi di cromatografia vengono tipicamente effettuati su colonna: a scambio ionico, ad esclusione molecolare, ad interazione idrofobia, per adsorbimento, per affinità.


Cromatografia su colonna: generalità pratiche
Le colonne, note importanti: il supporto che sostiene la fase stazionaria deve essere il più vicino possibile alla base della colonna in modo da ridurre lo spazio morto sotto il supporto stesso, dove si verifica un rimescolamento delle frazioni separate dalla colonna.

Fasi stazionarie, sono disponibili in un gran numero di forme e dimensioni ed entrambe queste caratteristiche sono importanti perché influenzano la velocità di flusso ed il potere di risoluzione.
• più grosse sono le particelle, più veloce va il flusso. Particelle di piccole dimensioni hanno però un rapporto superficie-volume + elevato e quindi potenzialmente un potere di risoluzione maggiore.
• le particelle sferiche offrono caratteristiche migliori. Le dimensioni delle particelle vengono espresse in termini di larghezza di maglia (mesh). Più grande è il valore di mesh e tanto più piccola è la particella.

Riempimento delle colonne
• è uno dei fattori + importanti, che maggiormente influenza l'efficienza della separazione.
• un riempimento della colonna mal eseguito porta a irregolarità nel flusso (channelling) e diminuisce la risoluzione.
• Il volume del liquido e delle particelle solide è detto volume del letto e il volume del liquido al di fuori della fase stazionaria è detto volume vuoto (V0).

Sviluppo della colonna: questo termine indica il passaggio dell'eluente attraverso la colonna.
Volume di eluizione, Ve = volume di fase mobile richiesto per eluire un particolare soluto
Il flusso dell'eluente deve avvenire a velocità costante.
Tempo di ritenzione, Tt = è il tempo corrispondente per l'eluizione del soluto ad una determinata velocità di flusso. ed è misurato a partire dall'istante in cui la miscela viene introdotta nello strumento, fino all'istante in cui si registra il massimo del tracciato cromatografico. Il tempo di ritenzione di una sostanza non trattenuta dalla fase stazionaria si dice invece tempo morto (tm); il tempo effettivamente speso da ogni sostanza eluita nelle interazioni chimico-fisiche con la fase stazionaria, tempo di ritenzione corretto (T'r), risulta quindi, pari a Tr - tm.


• lo sviluppo della colonna che prevede l'impiego di un solvente come eluente è noto come separazione isocratica.
• in molti casi, per aumentare il potere risolutivo dell'eluente, è necessario variare in modo continuo il pH, la forza ionica o la polarità del solvente: eluizione tramite gradiente. Per fare un gradiente si devono mescolare due solventi in una opportuna proporzione prima di immetterli nella colonna. Saranno la differenza di pH, forza ionica, polarità della soluzione nel recipiente B rispetto a quello nel recipiente A a determinare la direzione di formazione del gradiente.

Raccolta e analisi delle frazioni
• l'effluente può essere analizzato in continuo e la frazione contenente un particolare composto essere raccolta appena rilevata.
• l'effluente in alternativa può essere suddiviso in tante piccole frazioni (da 1 a 10 cm3) che verranno analizzate in una fase successiva, riunendo poi quelle contenenti un particolare composto.
• l'effluente dalla colonna viene fatto passare nel rivelatore. Il segnale generato dal rivelatore viene raccolto sulla carta di un registratore dove ogni composto emergente è identificato da un picco caratteristico mediante il quale è possibile calcolare il tempo di ritenzione e o il volume di eluizione. Il sistema di rivelazione si può basare sull'assorbimento della luce visibile o ultravioletta (sfruttando in particolare il fatto che la maggior parte dei composti insaturi, inclusi proteine e acidi nucleici, assorbono a 254 nm), oppure sulla fluorescenza, sulla variazione dell'indice di rifrazione dell'effluente.
• il sistema che consente di raccogliere l'eluente in una serie di frazioni è detto collettore di frazioni, concepito per raccogliere un determinato volume di effluente di ciascuna provetta prima di spostare nella posizione di raccolta la provetta successiva.
• Quando l'effluente di una colonna è stato analizzato e ha fornito un tracciato sul registratore (cromatogramma), si può dimostrare che l'area di ogni picco risulta proporzionale alla quantità di campione presente e quindi può essere utilizzata per la determinazione quantitativa dei componenti eluiti dalla colonna. L'area del picco si può misurare in base alla sua altezza (h) e alla larghezza alla metà dell'altezza (wh). Il prodotto di queste due dimensioni dà infatti l'area del picco. Alternativamente, considerando area e peso della carta linearmente correlate, si può ritagliare il picco della carta del registratore e pesarlo. Una volta nota l'area del picco, si può determinare la quantità di un componente usando una curva di taratura, ottenuta per cromatografia di quantità note di campione puro del composto da dosare, eseguita nelle stesse condizioni di separazione. Per ciascun picco, il fattore di ritenzione permette di identificare il tipo di molecola fluita. I picchi in uscita da un sistema cromatografico sono tanto piu larghi quanto maggiore è il tempo di ritenzione. La risoluzione di una colonna indica il grado di separazione dei picchi ottenuti al rivelatore di un sistema cromatografico: bande ben separate lungo la colonna generano picchi distinti e sufficientemente stretti da non sovrapporsi. Si definisce capacità di una colonna la quantità di campione che può essere separata senza sovrapposizione di picchi.

Efficienza di un sistema cromatografico
La capacità di un sistema cromatografico di eluire tutte le particelle di una data specie chimica con la stessa velocità, in modo da generare picchi molto stretti e ben separati, si definisce efficienza. In due separazioni cromatografiche su colonne che hanno uguale selettività ma diversa efficienza, si osseva che in quella caratterizzata da bassa efficienza (a), le bande dei composti A e B sono molto larghe e perciò si sovrappongono, mentre in quella dotata di buona efficienza (b), le bande sono strette e perciò ben distinte.



Il principio su cui si basa la separazione può essere descritto considerando una colonna contenente una fase stazionaria solida granulare circondata da una fase mobile liquida. Se, ad esempio, mettiamo in una colonna 256 molecole di una sostanza A e 256 molecole di una sostanza B, con A e B che hanno i coefficienti di ripartizione (K=CFM/CFS) rispettivamente KA =1 e KB =0,33, le due sostanze verranno eluite in tempi diversi. Anche se in realtà l’aggiunta di solvente è continua, è possibile immaginare ogni colonna cromatografia come un insieme di zone adiacenti nelle quali il soluto raggiunge la distribuzione di equilibrio tra la fase mobile e quella stazionaria. Ognuna di queste zone è detta piatto teorico e la sua estensione nella colonna è detta altezza del piatto (H). Tanto maggiore è il numero di piatti e tanto più efficiente è la colonna























Cromatografia planare

Su strato sottile
Nella cromatografia su strato sottile, la fase stazionaria è contenuta in un sottile strato di matrice solida, stratificata su una lastra di vetro, plastica o metallo. La fase mobile passa attraverso quella stazionaria per capillarità in senso verticale. E’ utilizzata per scopi analitici ed ha il vantaggio di poter analizzare simultaneamente più campioni.
Lo strato sottile contenente la fase stazionaria ha uno spessore dell’ordine di 100-300 µ. Il campione viene applicato in un punto a poca distanza dal margine della lastra, che viene immerso nella fase mobile.
• Su strato sottile si possono eseguire cromatografie di ripartizione, di adsorbimento, a esclusione e la cromatografie liquida ad alta risoluzione.
• La tecnica è semplice, veloce e permette l'analisi di più campioni contemporaneamente.
• Può essere impiegata sia a scopi analitici che preparativi.

Preparazione dello strato sottile
• A una lastrina dí vetro, di plastica o di metallo viene applicata una sospensione densa della fase stazionaria, normalmente in acqua, e la si stende sotto forma di uno strato sottile e uniforme per mezzo di una spatola, partendo da un lato della lastra e muovendosi verso il lato opposto.
• Lo spessore dello strato dipende dal tipo di separazione cromatografica desiderata. Nel caso di separazioni analitiche lo spessore è dell'ordine di 0,25 mm, mentre per quelle preparative può arrivare anche a 5 mm.
• Nella cromatografia d'adsorbimento, alla sospensione viene aggiunto un agente legante, come il solfato di calcio, che facilita l'adesione dell'adsorbente alla lastra. A eccezione della cromatografia a esclusione su strato sottile, la lastra viene essiccata per far aderire perfettamente la fase stazionaria al supporto. Nel caso di adsorbenti, l'essiccamento è condotto in una stufa a 100-120°C. Ciò serve anche a ottenere l'attivazione dell'adsorbente. È oggi commercialmente disponibile una vasta gamma di piastre già pronte.

Applicazione del campione
• Il campione viene applicato alla lastra mediante una micropipetta o una siringa (procedura che peraltro può essere automatizzata) sotto forma di macchia, solitamente a 2,0-2,5 cm dal bordo. Il solvente viene rimosso con un leggero riscaldamento o con un asciugacapelli.

Sviluppo della lastra
• La separazione avviene in un recipiente di vetro che contiene sul fondo circa 1,5 cm di solvente di sviluppo.
• Il solvente va lasciato equilibrare per almeno un'ora chiudendo il recipiente con un coperchio, in modo di assicurare che l'atmosfera al suo interno diventi satura del vapore del solvente (equilibramento). E' da notare che, senza questa fase, si avrebbe una corsa irregolare del solvente e quindi una cattiva separazione.
• Una volta avvenuto l'equilibramento, si toglie il coperchio e si posiziona verticalmente la lastra nel recipiente facendo in modo che peschi nel solvente (il lato immerso è naturalmente quello che porta il campione).
• Si ripone quindi il coperchio e la separazione avviene man mano che il solvente corre lungo la lastra. Questo, per capillarità, tende ad andare verso l'alto trascinando i diversi componenti della miscela che si separeranno se hanno diversi coefficienti di ripartizione tra la fase stazionaria contenuta nello strato sottile e la fase mobile, localizzandosi in punti diversi della lastra, alla fine della corsa cromatografica. Durante questa fase, è preferibile mantenere il sistema a temperatura costante per evitare effetti anomali di corsa.
• Il maggior vantaggio della TLC è la velocità con cui si realizza la separazione: normalmente occorrono 10-30 minuti.

NOTA: Un metodo per migliorare la risoluzione nelle separazioni per ripartizione o adsorbimento è l'uso della cromatografia bidimensionale (utilizzabile anche su carta). l materiale da cromatografare è posto su un angolo della lastra come singola macchia e successivamente viene sviluppato in una direzione; si toglie poi la lastra e la si lascia seccare. La lastra è infine sviluppata con un altro sistema di solventi, in cui i composti da separare hanno un diverso valore di Kd in una direzione perpendicolare alla prima corsa.


La TLC può essere anche accoppiata a un sistema di elettroforesi su strato sottile (TLE).

Rivelazione dei componenti
Gli analiti possono essere rivelati con vari metodi, ad esempio colorimetrici, fluorimetrici, autoradiografici. L'analisi densitometrica del cromatogramma può essere utilizzata per scopi quantitativi.
• Spruzzando sulla lastra acido solforico al 50% o acido solforico al 25% in etanolo, si ottiene la carbonizzazione della maggior parte dei composti che, pertanto, saranno visibili come macchie marroni.
• L'esame della lastra sotto luce ultravioletta mostrerà la posizione di sostanze che assorbono nell'ultravioletto o di composti fluorescenti. Molti adsorbenti commerciali usati per la cromatografia su strato sottile contengono un colorante fluorescente, così che, all'esame in luce ultravioletta, i composti separati appaiono come macchie blu, verdi o nere su uno sfondo fluorescente.
• Se si sottopone invece la lastra a vapori di iodio si mettono in evidenza i composti insaturi.
• Spruzzando infine la lastra con reattivi specifici si otterrà la colorazione di determinati composti: ad esempio, con la ninidrina gli aminoacidi si colorano in violetto.

Parametri importanti
• Linea di base (dove viene depositata la macchia)
• Tempo di percorrenza
• Distanze percorse dal solvente e dai componenti. Con queste si determinano i “ratio front”:
Rfa = a/h

Con: a = distanza percorsa dal componente a
b = distanza percorsa dal solvente

Se i vari Rf sono diversi tra loro, la separazione è stata selettiva. Rf è caratteristico della sostanza (a condizioni sperimentali costanti) e può dare informazioni di carattere qualitativo.



Analisi quantitativa
Il volume del campione si deve accuratamente dosare con una micropipetta. Si fa correre insieme un volume noto del componente da determinare




Una volta separato il componente che interessa può essere dosato con fotocolorimetria, conduttometria, elettrogravimetria, titolazione o, dopo averlo fatto reagire con un reagente di localizzazione che lo trasforma in un composto colorato, con un fotodensitometro (misura l’assorbimento della luce da parte delle macchie passate con un pennello di luce se la lastra è trasparente, o misura la riflettanza se la lastra è opaca.

Cromatografia su carta
• Le fibre di cellulosa della carta fungono da matrice di supporto per la fase stazionaria.
• La fase stazionaria può essere acqua, o un materiale apolare (ad esempio la paraffina liquida) oppure particelle impregnate di un adsorbente solido. Esistono in commercio carte dotate di diverse caratteristiche di corsa: lente, medie e rapide. Altre sono state preventivamente sottoposte a un lavaggio acido al fine di rimuovere eventuali impurezze che potrebbero alterare i risultati di alcune analisi.
• Nella cromatografia monodimensionale, la carta va sempre sviluppata in una precisa direzione, solitamente indicata sulla confezione. Nel caso di cromatografia di adsorbimento o di ripartizione in fase normale, la carta in commercio è già disponibile nella forma adatta per la cromatografia. Al contrario, nel caso di cromatografia in fase inversa la carta va preparata subito prima dell'uso.
Sviluppo della carta
• Sia per il metodo ascendente sia per quello discendente il solvente è posto sul fondo di un recipiente chiuso per permettere la saturazione della camera con i suoi vapori.
• Nella tecnica ascendente la procedura è identica a quella descritta precedentemente per la cromatografia su strato sottile. Il campione deve essere posto sulla carta in modo che si trovi immediatamente sopra il solvente, che, salendo per capillarità lungo la carta, provocherà la separazione dei vari componenti.
• Nella tecnica discendente, il lato della carta lungo il quale è deposto il campione è invece immerso in una vaschetta alla sommità del recipiente mentre il resto della carta è lasciato pendere verticalmente, badando però che non entri in contatto con il solvente situato sul fondo del recipiente stesso. Il solvente si muove verso il basso a causa della forza di gravità.
• La tecnica discendente presenta il vantaggio che la velocità di flusso del solvente è maggiore.
• Anche nella cromatografia su carta si può usare la tecnica bidimensionale, analogamente a quanto è stato descritto per la TLC.