Concetti Chiave
- Le reazioni enzimatiche sono più complesse rispetto ad altri test, richiedendo l'uso di più enzimi e reazioni indirette per ottenere risultati.
- La determinazione del glucosio in laboratorio avviene attraverso una reazione che coinvolge l'enzima esochinasi e il NADP+, misurando l'assorbanza del NADPH a 340 nm.
- La misurazione dell'alcol etilico si basa sulla trasformazione dell'etanolo in acetaldeide tramite l'enzima alcol deidrogenasi, usando anche qui il NAD come coenzima.
- I test enzimatici di glucosio e alcol etilico sono definiti "all’endpoint", in quanto si misura l'assorbanza del prodotto finale dopo la completa reazione.
- La misurazione a 340 nm è altamente specifica e sensibile, poiché pochissime sostanze fisiologiche assorbono a questa lunghezza d'onda, garantendo risultati accurati.
Le reazioni enzimatiche sono test molto più complessi rispetto agli altri visti precedentemente.
I test enzimatici si effettuano per determinare la quantità di un substrato o per determinare l’attività enzimatica di un enzima. Spesso queste reazioni riflettono le reazioni fisiologiche che avvengono in natura.
Si parlerà del glucosio, dell’alcol etilico, dell’urea e dell’LDH.
Glucosio
Determinazione del glucosio
In laboratorio si riproduce la prima reazione della glicolisi: in una provetta si aggiunge il campione da analizzare, l’ATP e l’enzima esochinasi, che trasforma il glucosio in glucosio-6-fosfato, e l’ATP in ADP.
Successivamente si aggiunge alla reazione del NADP+ e l’enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi: in questo modo il glucosio-6-fosfato viene trasformato in gluconato-6-fosfato e il NADP+ in NADPH.
In laboratorio si misura l’assorbanza del NADPH a 340 nm. Sapendo poi che una mole di NADPH corrisponde ad una mole di glucosio-6-fosfato e quindi ad una mole di glucosio, si risale alla concentrazione del glucosio.
Quindi, rispetto alle reazioni precedenti, la reazione è più che indiretta, in quanto è costituita da due reazioni; in più si ha l’intervento di più di due enzimi per far avvenire la reazione.
La misurazione del NAD o del NADP è una tecnica di indagine molto utilizzata in laboratorio: questo perché la misurazione a 340 nm è una misurazione molto pulita, in quanto perché ci sono pochissime altre sostanze fisiologiche che assorbono a questa lunghezza d’onda. In questo modo la reazione non risulta solo sensibile, ma anche specifica
Alcol etilico
Misurazione dell'alcol etilico
Un’ altra reazione enzimatica è quella dell’alcol etilico che viene misurato in modo automatizzato solamente a scopo clinico (il test che ha invece anche valenza medico-legale misura l'alcol etilico nei campioni di sangue tramite metodica di riferimento in gas cromatografia accoppiata a spettrometria di massa). È una misura enzimatica indiretta ed anche in questo caso si riproduce in laboratorio il passaggio di metabolizzazione dell’alcool da parte del fegato, che è il passaggio in cui l'etanolo viene trasformato in acetaldeide tramite l'enzima alcol deidrogenasi. In laboratorio:
1. si prende la provetta contenente il plasma e con all’interno ipoteticamente alcol etilico
2. si aggiunge NAD e alcol deidrogenasi che catalizza la trasformazione dell'alcol etilico in acetaldeide e del NAD in NAD ridotto
3. Anche in questo caso si misura il NAD ridotto a 340 nm e da questa concentrazione si risale alla concentrazione dell’alcool etilico.
Gli esami considerati finora (glucosio ed alcol etilico) sono test enzimatici definiti all’endpoint, questo significa che si fa avvenire la reazione fino a che non viene completata e successivamente si misura l'assorbanza del prodotto di reazione.
Domande da interrogazione
- Qual è il principio alla base della determinazione del glucosio in laboratorio?
- Perché la misurazione del NADPH a 340 nm è considerata una tecnica efficace?
- Come viene misurato l'alcol etilico in laboratorio?
- Cosa si intende per test enzimatici definiti all'endpoint?
La determinazione del glucosio si basa sulla riproduzione della prima reazione della glicolisi, in cui il glucosio viene trasformato in glucosio-6-fosfato tramite l'enzima esochinasi, e successivamente in gluconato-6-fosfato con l'enzima glucosio-6-fosfato deidrogenasi, misurando l'assorbanza del NADPH a 340 nm per risalire alla concentrazione di glucosio.
La misurazione del NADPH a 340 nm è efficace perché è molto pulita, con poche sostanze fisiologiche che assorbono a questa lunghezza d'onda, rendendo la reazione sensibile e specifica.
L'alcol etilico viene misurato in laboratorio attraverso una reazione enzimatica in cui l'etanolo viene trasformato in acetaldeide dall'enzima alcol deidrogenasi, con la misurazione del NAD ridotto a 340 nm per determinare la concentrazione di alcol etilico.
I test enzimatici definiti all'endpoint sono quelli in cui la reazione viene portata a termine completamente prima di misurare l'assorbanza del prodotto di reazione, come nel caso degli esami per glucosio e alcol etilico.
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